JP2020509360A - 循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃａｍｌ）を使用して癌を有する被験体における全生存期間及び無増悪生存期間を予測する方法 - Google Patents

循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃａｍｌ）を使用して癌を有する被験体における全生存期間及び無増悪生存期間を予測する方法 Download PDF

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Abstract

癌を有する被験体の全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する手段を開示し、該予測は、被験体に由来する血液等の生体試料中に見られる循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）の数及びサイズに基づく。【選択図】図５

Description

本発明は、概して、固形腫瘍等の癌を有する被験体における全生存期間及び無増悪生存期間に関する予測を行うための血液及びその他の体液中のバイオマーカーの使用に関する。
腫瘍細胞が原発固形腫瘍から離脱すると、それらの腫瘍細胞は血液又はリンパの循環に入り込み、最終的には血流を出て、臓器又は組織のいずれかに入って転移を形成する。癌関連死の９０％は転移のプロセスによって引き起こされる。最も一般的な転移部位は肺、肝臓、骨及び脳である。循環に見られる腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と称される。多くの研究発表及び臨床試験は、ＣＴＣが、（ｉ）血流中のＣＴＣの計数によって予後の生存及び癌再発の情報を提供すること、並びに（ｉｉ）タンパク質発現レベル、ＣＴＣにおける遺伝子突然変異及び転座の発生の検査を通じて治療情報を提供することにおいて臨床的有用性があることを示す。しかしながら、ステージＩＶの癌患者さえも、ＣＴＣは被験体における癌の発症及び／又は存在との一貫した関連性を示さない。ＣＴＣはステージＩＶの乳癌、前立腺癌及び結腸直腸癌で最も頻繁にみられるが、同じ癌の初期段階では稀である。また、ＣＴＣはその他の癌では稀である。
循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ：circulating cancer associated macrophage-like cell）は、癌を有する被験体の血液に見られる別の癌関連細胞型である。ＣＡＭＬは、試験した全ての固形腫瘍及び全てのステージの癌と関連がある。ＣＡＭＬは倍数体であり、サイズが約２５μｍ〜約３００μｍと非常にサイズが大きい。これらの倍数体細胞は、ＣＤ４５（−）又はＣＤ４５（＋）のいずれかとなる可能性があり、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４及びＣＤ３１を発現することから、骨髄系起源であることが確認される。それらは、しばしばＣＴＣ及び細胞残屑を貪食する過程で見られる［１、７］。
血液及びその他の体液中のＣＡＭＬ等のバイオマーカーの識別及び特性評価と関連するアッセイを使用して予後の情報を提供することができる。本発明は、臨床医及びその他の重要な目標に対してかかる手段を提供することに関する。
本発明は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫を含む固形腫瘍を有する被験体の血液に見られる特有の特徴を有する或る種の細胞を使用する方法に関する。「循環癌関連マクロファージ様細胞」（ＣＡＭＬ）と称されるこれらの循環細胞は、癌を有する被験体において固形腫瘍の存在と関連していることが示されている。ＣＡＭＬと関連する５つの形態が特性付けられ記載されている［１、２］。ＣＡＭＬは、精密マイクロフィルタを使用する精密濾過によってステージＩ〜ステージＩＶの固形腫瘍を有する被験体の末梢血において一貫して見られた。
ＣＡＭＬと関連する医学用途としては、限定されないが、癌の早期発見及び癌の診断を提供するバイオマーカーとしての、特に癌の再燃又は再発の早期の発見及び診断における、並びに癌突然変異の判定における、上記細胞の使用が挙げられる。また、ＣＡＭＬは、疾患の進行及び患者の生存に関する予測を行う際にバイオマーカーとして臨床的有用性を有することが、本明細書に提示されるデータによって示される。
ＣＡＭＬは、癌マーカーとして独立して、又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、上皮間葉転換細胞（ＥＭＴ）、循環癌関連血管内皮細胞（ＣＡＶＥ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、メチル化ＤＮＡ、患者の疾患のより完全な理解を提供するプロテオミクス、メタボロミクス、リピドミクス及びその他のバイオマーカーと組み合わせて使用され得る。
より具体的には、第１の実施の形態では、本発明は、癌を有する被験体の全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法に関する。これらの方法は、癌を有する第１の被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することと、癌を有する第２の被験体と結果を比較することとを含む。より大型の細胞を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳは、より小型の細胞を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳより短いと予測される。
一態様において、上記方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することを含み、上記試料中の少なくとも１個の細胞のサイズが約５０μｍ以上である場合に、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、どの細胞のサイズも約５０μｍを超えない癌を有する被験体よりも短いと予測される。
第２の実施の形態において、本発明は、癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法に関する。この方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料の選択された体積中の循環細胞の比を決定することを含み、該比が生体試料７．５ｍＬ当たり約６個以上の細胞と等しい場合、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、生体試料７．５ｍＬ当たり６個未満の細胞と等しい比を持つ癌を有する被験体よりも短いと予測される。
第３の実施の形態において、本発明は、癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法に関する。上記方法が、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞におけるＣＥＰ１７ドットの数を決定することを含み、上記試料中の少なくとも１個の細胞が約１０以上のＣＥＰ１７ドットを有する場合、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、被験体に由来する生体試料中のどの細胞も約１０以上のＣＥＰ１７ドットを有しない癌を有する被験体よりも短いと予測される。
本発明の実施の形態の或る特定の態様において、ＯＳ若しくはＰＦＳ、又はその両方は少なくとも１２カ月の期間に及ぶ。本発明の実施の形態の他の態様において、ＯＳ若しくはＰＦＳ、又はその両方は少なくとも２４カ月の期間に及ぶ。
本発明の実施の形態の或る特定の態様において、上記生体試料のサイズは５ｍＬ〜１５ｍＬである。
本発明の各実施の形態及び態様において、上記循環細胞は、以下の各特徴：
（ａ）サイズが約１４μｍ〜６４μｍの大型の異型倍数体核、又は単一細胞における複数の核、
（ｂ）サイズが約２０μｍ〜３００μｍの細胞サイズ、並びに、
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形（oblong）、二本足、三本足以上（more than two legs）、細い足（thin legs）、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、
のそれぞれを有するものとして定義され得る。
本発明の実施の形態の或る特定の態様において、上記循環細胞は、以下の追加の特徴：（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型、
（ｅ）ＣＤ４５発現、
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現、
（ｇ）ビメンチン発現、
（ｈ）ＰＤ−Ｌ１発現、
（ｉ）単球ＣＤ１１Ｃマーカー発現、
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現、
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現、及び、
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現、
の１つ以上を有するものとして更に定義され得る。
本発明の各態様及び実施の形態では、循環細胞は「癌関連マクロファージ様細胞」、又はＣＡＭＬと称される場合がある。
本発明の実施の形態の或る特定の態様において、上記生体試料の供給源は、限定されるものではないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿の１つ以上であり得る。生体試料が血液である場合、例えば、血液は、前肘静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血又は頸静脈血であってもよい。上記試料は、新鮮試料であってもよく、又は解凍される適切に調製された凍結保存試料であってもよい。
本発明の実施の形態の或る特定の態様において、上記癌は、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又はその他の固形腫瘍癌である。
本発明の実施の形態の或る特定の態様において、循環細胞は、サイズ排除法、免疫捕獲、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び様々なマイクロ流体チップ、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の手段を使用して、上記決定工程のため上記生体試料から単離される。
本発明の一態様において、循環細胞は、マイクロフィルタを使用することを含むサイズ排除法を用いて、上記生体試料から単離される。上記マイクロフィルタは、約５ミクロン〜約２０ミクロンの範囲の孔径を有してもよい。上記マイクロフィルタの細孔は、円形、レーストラック形、楕円形、正方形、及び／又は長方形の細孔形状を有してもよい。上記マイクロフィルタは、精密な細孔形状及び／又は均一な細孔分布を有してもよい。
本発明の別の態様において、循環細胞は、物理的なサイズに基づく選別、流体力学的なサイズに基づく選別、分類、捕捉、免疫捕獲、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除によってマイクロ流体チップを使用して上記生体試料から単離される。
本発明の更なる態様において、循環細胞は、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して上記生体試料から単離される。
ＣＡＭＬを識別し、そのサブタイプを特定するために使用される細胞分化マーカーの強度を示す図である。 ６つの異なる癌及び異なるステージの癌においてＣＴＣ対ＣＡＭＬの存在を比較する図である。 異なるステージの癌におけるサイズによるＣＡＭＬの平均数を示す図である。 異なるステージの癌におけるサイズによるＣＡＭＬの平均数を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズと細胞１個当たりのＣＥＰ１７のドット数との関係を示す図である。 ｎ＝１５７患者の探索セット及びｎ＝１５８患者の検証セットについて２４カ月間の全生存（ＯＳ）の確率のプロットを示す図である。データをＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０ｍ未満について分析する。探索セット（ｎ＝１５７）；ハザード比：３．４（９５％ＣＩ＝２．１〜５．６、ｐ＜０．００１）。検証セット（ｎ＝１５８）；ハザード比：４．２（９５％ＣＩ＝２．３〜７．７、ｐ＜０．００１）。 ｎ＝１５７患者の探索セット及びｎ＝１５８患者の検証セットについて２４カ月の無増悪生存（ＰＦＳ）の確率のプロットを示す図である。データをＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析する。探索セット（ｎ＝１５７）；ハザード比：３．２（９５％ＣＩ＝２．１〜５．０、ｐ＜０．００１）。検証セット（ｎ＝１５８）；ハザード比：３．８（９５％ＣＩ＝２．７〜６．８、ｐ＜０．００１）。 ＣＡＭＬの数６個以上及び６個未満についてｎ＝２９３患者試料に対して分析した２４カ月間のＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満についてｎ＝２９３患者試料に対して分析した２４カ月間のＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬサイズ５０μｍ未満、５０μｍ〜１１０μｍ及び１１０μｍ超について、ステージＩとステージＩＩ（左パネル）、及びステージＩＩＩとステージＩＶ（右パネル）に分けたｎ＝２９３患者試料に対して分析した２４カ月間のＰＦＳを示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間のステージＩの患者（ｎ＝６２）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間のステージＩＩの患者（ｎ＝７２）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間のステージＩＩＩの患者（ｎ＝６９）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間のステージＩＶの患者（ｎ＝１０６）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間の乳癌患者（ｎ＝５９）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間の食道癌患者（ｎ＝２７）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者（ｎ＝５９）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間の膵臓癌患者（ｎ＝５９）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間の前立腺癌患者（ｎ＝７４）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。 ＣＡＭＬのサイズ５０μｍ以上及び５０μｍ未満について分析した２４カ月間の腎細胞癌（ＲＣＣ）患者（ｎ＝３７）に対するＯＳ（左パネル）及びＰＦＳ（右パネル）を示す図である。
詳細な構成及び要素等の明細書に定義される事項は、本発明についての包括的な理解を支援するために提供されるものに他ならない。したがって、当業者は、本明細書に記載される実施形態の様々な変更及び修正が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく行われ得ることを認識する。
癌は世界で最も恐れられている疾患のうちの１つであり、あらゆる国のあらゆる集団及びあらゆる民族に罹患する。男性と女性の両方のおよそ４０％が、一生のうちに癌を発症する。アメリカ合衆国だけでも、常時、１２００万人を超える癌患者がおり、２０１８年には新たな癌の症例が１７０万に上り、死亡数が６０万人を超えると推定された。世界中の癌による死亡は、年間約８００万人に上ると推定され、そのうち３００万人は、患者が治療を受けられる先進国で死亡している。
選択された治療法の効果があるかどうかを迅速に判断することができ、生存に関する予後を提供することができる診断が存在することが理想的である。
この開示では、その他のどの癌関連細胞よりも、ステージＩ〜ステージＩＶの固形腫瘍患者の血液に一貫して見られる細胞型が提示される。これらの循環細胞は、原発腫瘍と同じ腫瘍マーカーを含むマクロファージ様細胞であり、それらの細胞を本明細書では循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）と称する。
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に加えて、癌を有する患者に由来する生体試料中に存在するＣＡＭＬは、例えば、精密濾過法を含むサイズ排除法の使用を通じて単離され、特性評価され得る。マイクロフィルタは、赤血球及び大半の白血球が通過するように十分大きいが、ＣＴＣ及びＣＡＭＬ等のより大きな細胞を保持する細孔で形成され得る。次いで、直接フィルタ上で又はその他の手段のいずれかによって収集した細胞を特性評価することができる。
単独で使用される場合、ＣＡＭＬには多くの臨床的有用性がある。さらに、生体試料中でのＣＡＭＬの特性評価は、診断技術の感度及び特異度を更に改善させるため、血液中のＣＴＣ、無細胞ＤＮＡ及び遊離タンパク質等のその他マーカーのアッセイと組み合わされてもよい。これは、ＣＡＭＬ及びＣＴＣが同じ手段を用いて同時に単離され、識別され得ることから特に当てはまる。
循環腫瘍細胞
本明細書で定義されるように、癌腫と関連するＣＴＣは、多くのサイトケラチン（ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９は、最も一般に発現され、診断に使用されるサイトケラチンであるが、測量をこれらのマーカーだけに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、通常、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する。しかしながら、この発現は均一すなわち一貫したものではない。ＣＤ４５は白血球マーカーであるため、ＣＴＣはＣＤ４５を全く発現しない。ＣＴＣ及びＣＡＭＬ等の腫瘍関連細胞を識別するアッセイでは、ＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９等の固形腫瘍と関連するマーカーに対する抗体、又はＣＤ４５若しくはＤＡＰＩに対する抗体を使用することで十分である。染色技術と形態学とを組み合わせることにより、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ＰＤＣＴＣ）、アポトーシスＣＴＣ及びＣＡＭＬが識別され得る［３］。
固形腫瘍と関連するＰＤＣＴＣはＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９を発現し、以下の特徴によって識別され、定義され得る：
ＤＡＰＩによって染色される「癌様」核。核は、通常ドットパターンを有し大きいが、細胞が分裂状態にある場合には例外として、核が圧縮されることもある。
ＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９の１つ以上の発現；上皮癌に由来するＣＴＣは、通常少なくともＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９を発現する。サイトケラチンは線維状パターンを有する。
ＣＤ４５発現の欠如。
アポトーシスＣＴＣはＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９を発現する癌と関連し、以下特徴によって識別され定義され得る：
核の分解
ＣＫ８、ＣＫ１８及びＣＫ１９の１つ以上の発現；全てのサイトケラチンが線維状のパターンであるのではなく、部分又は全体が断片化されたスポットの形状のように見える。 ＣＤ４５発現の欠如。
循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）
本明細書で定義されるように、本発明の方法で使用される循環細胞は「ＣＡＭＬ」と称される場合がある。「循環細胞」に対するそれぞれの言及はＣＡＭＬと同じ意味であり、「ＣＡＭＬ」に対するそれぞれの言及は循環細胞と同じ意味である。ＣＡＭＬと称されるか「循環細胞」と称されるかにかかわらず、これらの細胞は、以下の特徴の１つ以上を有することを特徴とする：
ＣＡＭＬは、拡大した融合核小体が一般的であるものの、大型の異型倍数体核又は細胞内にしばしば点在する複数の個別の核を有する。ＣＡＭＬ核は、一般的には直径約１０μｍ〜約７０μｍのサイズ、より一般的には直径約１４μｍ〜約６４μｍのサイズの範囲である。
多くの癌に対して、ＣＡＭＬは、その疾患の癌マーカーを発現する。例えば、上皮癌と関連するＣＡＭＬはＣＫ８、ＣＫ１８又はＣＫ１９、ビメンチン等を発現し得る。マーカーは、典型的には拡散されているか、又は液胞及び／又は摂取された物質と結び付いている。任意のマーカーに対する染色パターンは、細胞全体の至る所でほぼ均一に広がる。肉腫、神経芽細胞腫及び黒色腫については、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９に代えて、癌と関連するその他マーカーを使用することができる。
ＣＡＭＬはＣＤ４５陽性又はＣＤ４５陰性の場合があり、本発明は両方の種類のＣＡＭＬの使用を包含する。
ＣＡＭＬは、大きく、最長寸法でおよそ２０ミクロン〜およそ３００ミクロンのサイズである。
ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形、二本足、三本以上の足、細い足、及び無定形の形状を含む、多くの明らかに異なる形態学的形状で見られる。
癌腫に由来するＣＡＭＬは、典型的には拡散したサイトケラチンを有する。
ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現する場合、ＥｐＣＡＭは典型的には細胞の至る所に拡散されているか、又は液胞及び／又は摂取された物質と結び付いており、細胞全体を通してほぼ均一であるが、いくつかの腫瘍はＥｐＣＡＭの発現が非常に低いか又はそれを発現しないことから、全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するわけではない。
ＣＡＭＬがマーカーを発現する場合、マーカーは典型的には細胞の至る所に拡散されるか、又は液胞及び／又は摂取された物質と一体化されており、細胞全体を通してほぼ均一であるが、全てのＣＡＭＬが等しい強度で同じマーカーを発現するわけではない。
ＣＡＭＬは、しばしば、腫瘍起源のマーカーと関連するマーカーを発現する。例えば、腫瘍が前立腺癌起源であり、ＰＳＭＡを発現する場合には、かかる患者に由来するＣＡＭＬもまたＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓起源であり、ＰＤＸ−１を発現する場合には、かかる患者に由来するＣＡＭＬもまたＰＤＸ−１を発現する。更なる例として、原発腫瘍又は癌起源のＣＴＣがＣＸＣＲ−４を発現する場合、かかる患者に由来するＣＡＭＬもＣＸＣＲ−４を発現する。
原発腫瘍又は癌を起源とするＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現する場合、かかる患者に由来するＣＡＭＬもまた薬物標的のバイオマーカーを発現する。免疫療法のかかるバイオマーカーの一例は、ＰＤ−Ｌ１である。
ＣＡＭＬは、単球マーカー（例えばＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）及び内皮細胞マーカー（例えばＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。
ＣＡＭＬは、Ｆｃフラグメントを結合する能力を有する。
広範囲なマーカーセットを、ＣＡＭＬに対するそれらの発現について評価し、結果を図１に示す。本発明の一態様では、本発明のＣＡＭＬは、図１に示されるマーカーの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個全てを発現する。マーカーを、異なる癌を有する９３名の異なる患者に由来する１１１８個のＣＡＭＬに対してスクリーニングした。ＣＡＭＬを最初に単離し、ＤＡＰＩ、サイトケラチン及びＣＤ４５により識別し、次いで、連続して骨髄／マクロファージ、白血球、巨核球、上皮細胞、内皮細胞、前駆細胞／幹細胞、及び運動性のマーカーを含む合計２７個のマーカーで再染色した。図１からわかるように、マーカー発現は０％〜９６％に及ぶ。ほとんど全てのＣＡＭＬが、ＣＤ３１のレベルを発現することがわかり、通常サイトケラチン、ＣＤ１４、ＣＸＣＲ４、ビメンチン及びその他マーカーを共発現した。しかしながら、ＣＡＭＬは明らかな骨髄系マーカー（ＣＤ１４）を含んだが、ＣＤ３１マーカーは９６％とより頻繁に発現された。
また、ＣＡＭＬは、古典的な細胞分化の理解と一致するようには見えない多数の表現型（すなわち、ＣＤ４５［白血球］及びサイトケラチン［上皮］、ＣＤ１１ｃ［マクロファージ］及びＣＤ４１［巨核球］、ＣＤ１４６［内皮］及びＣＤ４１／ＣＤ６１［巨核球］、ＣＤ４１／ＣＤ６１［巨核球］及びＣＤ６８／ＣＤ１６３［スカベンジャーマクロファージ］の共発現）を示す。マーカーの多くが、複数の細胞型に現われる。合わせると、これらのデータは、ＣＡＭＬが、幹細胞及び血管新生促進能力と関連する多くの表現型の属性を持つ、分化プロセスの早期の骨髄由来細胞であることを示す。
ＣＡＭＬは、図１に示されるように、Ｈ＆Ｅ等の比色分析染色、又は特異的マーカーの蛍光染色によって可視化され得る。細胞質について、ＣＤ３１は最も陽性の表現型である。ＣＤ３１単独で、又は図１中のその他陽性マーカー若しくは腫瘍と関連する癌マーカーとの組み合わせが推奨される。
本発明の様々な実施形態及び態様において、上記循環細胞及びＣＡＭＬは、以下の特徴：（ａ）サイズが約１４μｍ〜６４μｍの大型の異型倍数体核、又は単一細胞における複数の核、（ｂ）サイズが約２０ミクロン〜３００ミクロンの細胞サイズ、並びに（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形、二本足、三本足以上、細い足、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状を有する細胞として定義され得る。更なる実施形態において、上記ＣＡＭＬは、以下の追加の特徴：（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型、（ｅ）ＣＤ４５発現、（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現、（ｇ）ビメンチン発現、（ｈ）ＰＤ−Ｌ１発現、（ｉ）単球ＣＤ１１Ｃマーカー発現、（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現、（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現、及び（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現の１つ以上を有するものとしても定義され得る。
上で示唆されるように、本明細書に記載されるＣＡＭＬ及びＣＴＣに特有の特徴は、それらを、癌等の疾患のスクリーニング及び診断、治療のモニタリング、疾患の進行及び再発のモニタリングの方法を含む臨床法における使用に適したものとする。
細胞のサイズを使用するＯＳ及びＰＦの予測
上の概要で示唆されるように、本発明は、循環細胞サイズに基づいて、癌を有する被験体の全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法に関する。これらの方法は、癌を有する第１の被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することと、癌を有する第２の被験体と結果を比較することとを含む。より大型の細胞を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳは、より小型の細胞を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳより短いと予測される。
本発明の好ましい実施形態において、上記方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することを含み、上記試料中の少なくとも１個の細胞のサイズが約５０μｍ以上である場合に、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、どの細胞のサイズも約５０μｍを超えない癌を有する被験体よりも短いと予測される。
５０μｍという値を、この方法に対するカットオフ値と見なすことができる。この方法の関連する態様では、カットオフ値は、４０μｍ、４１μｍ、４２μｍ、４３μｍ、４４μｍ、４５μｍ、４６μｍ、４７μｍ、４８μｍ、４９μｍ、５０μｍ、５１μｍ、５２μｍ、５３μｍ、５４μｍ、５５μｍ、５６μｍ、５７μｍ、５８μｍ、５９μｍ、又は６０μｍ以上のいずれか１つであってもよい。
本発明の一態様において、本発明の方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することを含み、上記試料中の少なくとも１個の細胞のサイズが約５０μｍ以上である場合に、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、どの細胞のサイズも約５０μｍを超えない癌を有する被験体よりも短いと予測される。
この方法に関して、特定の循環細胞のサイズが、細胞の状態及び形態、サイズを決定する状況、並びにサイズを決定する方法に依存して変化し得ることを認識するのは重要である。循環細胞が取る形態の種類としては、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形、二本足等（本明細書で更に定義される）が挙げられることから、サイズもまた測定のため選択された細胞上の２点に依存して変化し得る。しかしながら、細胞のサイズは、一般的には、細胞体上の最も離れた２点間で測定されることになる。したがって、形状が球形である場合、細胞の直径が測定される。形状が紡錘形である場合、細胞の軸長に沿った２つの末端間の距離を測定することができる。
この実施形態の各態様では、循環細胞はＣＡＭＬとも称される場合がある。
細胞数を使用するＯＳ及びＰＦＳの予測
また、本発明は、循環細胞数に基づいて癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法に関する。これらの方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料の選択された体積中の循環細胞の比を決定することを含み、該比が生体試料７．５ｍＬ当たり約４個以上の細胞と等しい場合、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、生体試料７．５ｍＬ当たり４個未満の細胞と等しい比を持つ癌を有する被験体よりも短いと予測される。
循環細胞４個という値を、この方法に対するカットオフ値と見なすことができる。この方法の関連する態様では、カットオフ値は、生体試料７．５ｍＬ当たり、細胞４個、４．５個、５個、５．５個、６個、６．５個、７個、７．５個、８個、８．５個、９個、９．５個又は１０個以上のいずれか１つであってもよい。
更なる例として、本発明の方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料の選択された体積中の循環細胞の比を決定することを含み、該比が生体試料７．５ｍＬ当たり約６個以上の細胞と等しい場合、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、生体試料７．５ｍＬ当たり６個未満の細胞と等しい比を持つ癌を有する被験体よりも短いと予測される。
この実施形態の各態様では、循環細胞はＣＡＭＬとも称される場合がある。
ＣＥＰ１７ドット数を使用するＯＳ及びＰＦＳの予測
本発明は、さらに、循環細胞において検出されるＣＥＰ１７ドットの数に基づいて、癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法に関する。これらの方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞におけるＣＥＰ１７ドットの数を決定することを含み、上記試料中の少なくとも１個の細胞が約８以上のＣＥＰ１７ドットを有する場合、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、被験体に由来する生体試料中のどの細胞も約８以上のＣＥＰ１７ドットを有しない癌を有する被験体よりも短いと予測される。
あらゆる混同を回避するため、「被験体に由来する生体試料中のどの細胞も約８又はＣＥＰ１７ドットを有しない」の句は、生体試料中の各細胞が７以下のＣＥＰ１７ドットを有することを意味すると理解されるべきである。
ＣＥＰ１７ドット「８以上」という値を、この方法に対するカットオフ値と見なすことができる。この方法の関連する態様では、カットオフ値は、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、又は１５以上のいずれか１つのＣＥＰ１７ドットであってもよく、又はそれより多くてもよい。
本発明の一態様において、本発明の方法は、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞におけるＣＥＰ１７ドットの数を決定することを含み、上記試料中の少なくとも１個の細胞が約１０以上のＣＥＰ１７ドットを有する場合、上記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、被験体に由来する生体試料中のどの細胞も約１０以上のＣＥＰ１７ドットを有しない癌を有する被験体よりも短いと予測される。あらゆる混同を回避するため、「被験体に由来する生体試料中のどの細胞も約１０又はＣＥＰ１７ドットを有しない」の句は、生体試料中の各細胞が９以下のＣＥＰ１７ドットを有することを意味すると理解されるべきである。
この実施形態の各態様では、循環細胞はＣＡＭＬとも称される場合がある。
本発明の各方法では、全生存期間（ＯＳ）若しくは無増悪生存期間（ＰＦＳ）、又はそれらの両方は、少なくとも約１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、２５カ月、２６カ月、２７カ月、２８カ月、２９カ月、又は３０カ月以上の期間に及ぶ。本発明の一態様では、ＯＳ若しくはＰＦＳ、又はそれらの両方が少なくとも約２４カ月の期間に及ぶ。
本明細書で使用される全生存期間（ＯＳ）は、癌を有する被験体が、診断の日、治療を開始した日、又は癌の進行を評価するため採血した日等の選択された日から生存した時間の長さを意味する。
本明細書で使用される無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、癌を有する被験体が、治療を開始した日、又は癌の進行を評価するため採血した日等の選択された日から生存した時間の長さであって、癌が悪化又は進行していない期間の長さを意味する。
本発明の各方法では、循環細胞（ＣＡＭＬ）を分析する生体試料の量が変化し得ることは明らかであろう。しかしながら、上記方法が細胞のサイズの決定に基づく場合、適切な数の細胞を得るため、生体試料は少なくとも約２．５ｍＬとされるべきである。また、生体試料の量は、少なくとも約３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、７．５ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１１ｍＬ、１２ｍＬ、１２．５ｍＬ、１３ｍＬ、１４ｍＬ、１５ｍＬ、１６ｍＬ、１７ｍＬ、１７．５ｍＬ、１８ｍＬ、１９ｍＬ、２０ｍＬ、２１ｍＬ、２２ｍＬ、２２．５ｍＬ、２３ｍＬ、２４ｍＬ、２５ｍＬ、２６ｍＬ、２７ｍＬ、２７．５ｍＬ、２８ｍＬ、２９ｍＬ、又は３０ｍＬ以上であってもよい。また、生体試料の量は、約２．５ｍＬ〜２０ｍＬ、約５ｍＬ〜１５ｍＬ、又は約５ｍＬ〜１０ｍＬであってもよい。本発明の一態様では、生体試料は約７．５ｍＬである。
生体試料中の循環細胞（ＣＡＭＬ）数に基づいて癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法に関して、癌を有する被験体に由来する生体試料の選択された体積における循環細胞（ＣＡＭＬ）の比を決定する。様々な量の生体試料を使用することができるが、試料の大きさに対する試料中の細胞数の比が決定され、被験体間で比較されることが理解される。例えば、試料１５ｍＬ中に８個の細胞の比は、試料７．５ｍＬ中に４個の細胞、及び試料３．７５ｍＬ中に２個の細胞と等しい。
本発明の各実施形態及び態様において、上記循環細胞（ＣＡＭＬ）は、以下の特徴：
（ａ）サイズが約１４μｍ〜６４μｍの大型の異型倍数体核、又は同一細胞における複数の核、
（ｂ）サイズが約２０μｍ〜３００μｍの細胞サイズ、並びに、
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形、二本足、三本足以上、細い足、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、
のそれぞれを有するものとして定義され得る。
本発明の実施形態の或る特定の態様において、上記循環細胞（ＣＡＭＬ）は、以下の追加の特徴：（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型、
（ｅ）ＣＤ４５発現、
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現、
（ｇ）ビメンチン発現、
（ｈ）ＰＤ−Ｌ１発現、
（ｉ）単球ＣＤ１１Ｃマーカー発現、
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現、
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現、及び、
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現、
の１つ以上を有するものとして更に定義され得る。
本発明の各実施形態及び態様において、上記生体試料の供給源は、限定されるものではないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿の１つ以上であり得る。生体試料が血液である場合、例えば、血液は、前肘静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血又は頸静脈血であってもよい。上記試料は、新鮮試料であってもよく、又は解凍される凍結保存試料であってもよい。
癌を有する２名の被験体間の循環細胞（ＣＡＭＬ）のサイズを比較する場合、被験体が同じ種類の癌を有していることが好ましい。しかしながら、因子のなかでもとりわけ、癌の種類、癌のステージ、癌の進行の速度、治療歴、並びに癌の寛解及び／又は再発の病歴に関して２名の被験体を完全に一致させることは困難な場合がある。したがって、この方法で比較されている２名の被験体の癌の特徴に幾つかの違いが存在してもよいことが理解されるべきである。
本発明の各実施形態及び態様において、上記癌は、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又はその他の固形腫瘍癌である。当業者は、本発明の方法が特定の形態又は種類の癌に限定されず、多種多様な癌と関連して実施され得ることを十分に理解する。
本発明の各実施形態及び態様において、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、サイズ排除法、免疫捕獲、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び様々なマイクロ流体チップ、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の手段を使用して、上記決定工程のため上記生体試料から単離される。特定の態様では、サイズ排除法は、マイクロフィルタの使用を含む。
本発明の一態様において、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、マイクロフィルタを使用することを含むサイズ排除法を用いて、上記生体試料から単離される。好適なマイクロフィルタは、様々な孔径及び形状を有し得る。マイクロフィルタは、約５ミクロン〜約２０ミクロンの範囲の孔径を有してもよい。本発明の或る特定の態様では、孔径が約５ミクロン〜１０ミクロンであり、その他の態様では、孔径が約７ミクロン〜８ミクロンである。より大きな孔径は、フィルタ上のほとんどのＷＢＣの汚染を排除する。上記マイクロフィルタの細孔は、円形、レーストラック形、楕円形、正方形、及び長方形の細孔形状を有し得る。上記マイクロフィルタは、精密な細孔形状及び／又は均一な細孔分布を有し得る。
本発明の別の態様では、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、物理的なサイズに基づく選別、流体力学的なサイズに基づく選別、分類、捕捉、免疫捕獲、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除によってマイクロ流体チップを使用して上記生体試料から単離される。循環細胞（ＣＡＭＬ）捕捉効率は、回収方法に依存して変化し得る。異なるプラットフォーム上で捕捉され得る循環細胞（ＣＡＭＬ）サイズもまた、変化し得る。予後及び生存を決定するために循環細胞サイズを使用することの原理は同じであるが、統計値は変化する。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）マイクロフィルタを使用する循環細胞の収集は、１００％の捕捉効率及び高品質の細胞を提供する。
本発明の別の態様では、血液収集チューブが存在する。ＣｅｌｌＳａｖｅ血液収集チューブ（カリフォルニア州サンディエゴのMenarini Silicon Biosystems Inc.）は、安定した細胞の形態及びサイズを提供する。その他の利用可能な血液収集チューブは、細胞安定性を提供しない。ほとんどのその他の血液収集チューブでは、細胞は拡大する場合があり、バースト収集（burst collect）することさえある。
本発明の別の態様では、細胞をＣＡＭＬ細胞自体であると特異的に識別することなく、代わりに、単に細胞質及び核のサイズに基づいて細胞を識別して、試料中の大きな細胞を識別する。例は、Ｈ＆Ｅ染色等の比色分析染色を使用する技術、又は単にＣＫ（＋）細胞を見ることである。
本発明の更なる態様において、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して上記生体試料から単離される。
試料の収集及び処理
本明細書で提供され、以下に概説される各実施例では、末梢血をＣｅｌｌＳａｖｅチューブ（カリフォルニア州サンディエゴのMenarini Silicon Biosystems Inc.）に収集し、９６時間以内に処理した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）精密濾過技術を使用して、血液試料中の全ての癌関連細胞（ＣＴＣ、ＥＭＴ、ＣＥＣ及びＣＡＭＬ）を収集した。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）マイクロフィルタは、９ｍｍの区域内に、１６００００個超の、均一な配列の、孔径７μｍの細孔を有する。試薬は、前固定バッファー、後固定バッファー、透過処理バッファー及び抗体カクテルを含む。濾過を行う技術は、５ｍＬ／分で引くように設定されたシリンジポンプ［６］又は真空ポンプ［４］のいずれかを使用した。フィルタを通って引く前に、前固定バッファー７．５ｍＬ中で血液７．５ｍＬを前固定することによって濾過プロセスを開始させた。次いで、フィルタ及び捕捉された細胞を、洗浄、後固定、洗浄、透過処理及び洗浄に供した。次いで、フィルタ上に捕捉された細胞を、ＦＩＴＣ抗サイトケラチン８、１８、１９と、フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ＥｐＣＡＭと、Ｃｙ５−抗ＣＤ４５（５）とからなる抗体カクテルで染色した後、洗浄した。フィルタをスライドガラス上に置き、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩ（Southern Biotech）で封入した（cover-slipped：カバーガラスにて封入した）。特定の蛍光キューブ及び白黒カメラを使用して細胞を撮像するため、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍを備えるオリンパス株式会社のＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡を使用した。細胞間の均等なシグナル比較のため、曝露を３秒（Ｃｙ５）、２秒（ＰＥ）、１００ミリ秒〜７５０ミリ秒（ＦＩＴＣ）及び１０ミリ秒〜５０ミリ秒（ＤＡＰＩ）としてプリセットした。Ｚｅｎ２０１１ Ｂｌｕｅ（Carl Zeiss）を使用して画像を処理した。
幾つかの癌はＣＫ及びＥｐＣＡＭの高い発現を必ずしも示すとは限らないことから、フィルタ上の細胞をＣＤ３１及び／又はＣＤ１４で再染色し、ＣＡＭＬ数を改善した。再染色技術は公開されている通りである［５］。その後、細胞を再び撮像した。ＣＤ３１は、肺癌に対するＣＡＭＬ数を増加させた。
癌患者の血液中のＣＴＣ及びＣＡＭＬの頻度
ＰＤＣＴＣは、癌の初期段階ではめったに見られない。ＰＤＣＴＣがステージＩＩＩ及びステージＩＶの乳癌及び前立腺癌の患者でより頻繁に見られるが、その他の大半の固形腫瘍で見られる頻度は低い。ＣＡＭＬはより一般的に見られる。
例として、末梢全血７．５ｍＬは、２９３名の癌患者（乳癌（ｎ＝５９）、前立腺癌（ｎ＝５２）、膵臓癌（ｎ＝５９）、肺癌（ｎ＝５９）、食道癌（ｎ＝２７）、及び腎細胞癌（ｎ＝３７））及び３０名の健康な対照から得られた。試料を、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）精密濾過アッセイを使用して分析した。
図２からわかるように、ＣＡＭＬはＰＤＣＴＣよりも一般的であることがわかった。ＣＡＭＬは、ステージＩ（ｎ＝６０）（８４％）、ステージＩＩ（ｎ＝６２）（９４％）、ステージＩＩＩ（ｎ＝６５）（９５％）の転移前の患者、及び転移性ステージＩＶ（ｎ＝９７）（９７％）の患者、及び９名の未分類（判定していない）を含む患者試料の９３％で見られたが、全ての健康な対照では存在しなかった。したがって、ＣＡＭＬは固形腫瘍の初期段階において高確率で見られるが、ＣＴＣはそうではなかった。
ステージに応じたＣＡＭＬの数及びサイズの変化
図３Ａ及び図３Ｂは、図２からの試料に対するステージに基づいてＣＡＭＬの数及びサイズを分析した。ステージが増加するにつれて、ＣＡＭＬの平均数は増加する。端から端まで２５μｍ〜５０μｍのサイズを有するＣＡＭＬの平均数は、全てのステージでほぼ同じである。しかしながら、サイズが５０μｍ〜１００μｍ及びサイズが１００μｍ超のＣＡＭＬの平均数は、図３Ｂに示されるように、ステージと共に増加する。
ＣＡＭＬサイズと核区域のＣＥＰ１７ドットの数との相関
ＣＡＭＬサイズの増加を、腫瘍細胞及び腫瘍物質のＣＡＭＬ貪食の結果であると仮定した。実際に、実験により、貪食された核の数の指標である染色体計数プローブ１７（ＣＥＰ１７）のドット数が、細胞のサイズと十分相関することが実証された。図４は、サイズが２５μｍ〜５０μｍのＣＡＭＬよりも、サイズが５０μｍ超のＣＡＭＬはより多くのＣＥＰ１７のドットを有することを示す。また、データは、５０μｍのＣＡＭＬサイズが、図３Ｂに提示される疾患進行に関する結果と一致する、境界線であることを示唆する。
疾患の侵攻性を決定するサイズ基準の開発
図３及び図４は、侵攻性疾患を区別するため５０μｍが使用され得ることを示唆する。末梢全血７．５ｍＬを、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）精密濾過アッセイを使用して分析した。様々な癌及びステージに由来する、２４カ月に亘って追跡した１５７名の患者の探索セットを、ＯＳ（図５中、点線の曲線）及び無増悪生存期間（図６中、点線の曲線）について分析した。ＯＳに対するハザード比は３．４であり、ｐ＜０．００１で９５％ＣＩ＝２．１〜５．６である。ＰＦＳに対するハザード比は３．２であり、ｐ＜０．００１で９５％ＣＩ＝２．１〜５．０である。これは、５０μｍ以上のＣＡＭＬサイズを有する患者は、より短いＰＦＳ及びＯＳを有することを示す。
類似する様々な癌及びステージに由来する１５８名の患者の検証セットを、ＯＳ（図５中、実線の曲線）及びＰＦＳ（図６中、実線の曲線）について分析した。ＯＳに対するハザード比は４．２であり、ｐ＜０．００１で９５％ＣＩ＝２．３〜７．７である。ＰＦＳに対するハザード比は３．８であり、ｐ＜０．００１で９５％ＣＩ＝２．７〜６．８である。検証結果は探索結果と十分一致する。
ＣＡＭＬサイズの多変量解析及び予後の情報
図５及び図６に示されるデータに基づいて、ＯＳ及びＰＦＳに対する多変量解析を、上に記載されるｎ＝２９３患者試料に対して行った。患者を２４カ月に亘って追跡した。下記表に示されるように、多変量解析を行った。５０μｍのＣＡＭＬサイズは、ＯＳ及びＰＦＳを決定する最も重要なパラメーターであることを示す。ｐ値が小さいほど、統計が正確である確率が高い。
Figure 2020509360
ＣＡＭＬの数に基づくＯＳ及びＰＦＳの分析を図７に示す。このデータは、末梢血試料７．５ｍＬ中のＣＡＭＬの数が６個以上のＣＡＭＬである場合、ＯＳとＰＦＳはいずれも、同じサイズの試料中に６個未満のＣＡＭＬを有する患者と比較して減少することを示す。
ＯＳ及びＰＦＳと関連する更なるデータを図８に提示する。図８に提示されるデータは、ＣＡＭＬサイズ：５０μｍ以上対５０μｍ未満に基づく。ｐ値によって示されるように、５０μｍ以上のＣＡＭＬサイズは、予後不良の予測に非常に重要である。
図９は、５０μｍ未満、５０μｍ〜１００μｍ、及び１００μｍ超の３つの異なるＣＡＭＬサイズにプロットを分離した。ＣＡＭＬサイズが大きくなるほど、予後がより悪くなることが明らかである。また、たとえステージＩ及びステージＩＩ（左図）に対する予後の決定であっても、ＣＡＭＬサイズが重要であることに注目することが大切である。
全てのステージ及び様々な癌において生存及び進行のコンセプトを予測するＣＡＭＬサイズの有用性の実証を可能とするため、ｎ＝３１５のより大きな試料サイズを使用した。３１５名の癌患者は、（乳癌（ｎ＝５９）、前立腺癌（ｎ＝７４）、膵臓癌（ｎ＝５９）、肺癌（ｎ＝５９）、食道癌（ｎ＝２７）、及び腎細胞癌（ｎ＝３７））に由来する。それらの患者は、ステージＩ（６２）、ステージＩＩ（７２）、ステージＩＩＩ（ｎ＝６９）、ステージＩＶ（１０６）及び６名の未分類であった。
図１０Ａ〜図１０Ｄは、それぞれ、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ及びステージＩＶに関して、５０μｍ以上及び５０μｍ未満のＣＡＭＬサイズに対するＯＳ（左図）及びＰＦＳ（右図）の詳細な情報を提供する。
図１１Ａ〜図１１Ｆは、それぞれ、乳癌、食道癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、前立腺癌及び腎細胞癌に関して、５０μｍ以上及び５０μｍ未満のＣＡＭＬサイズに対するＯＳ（左図）及びＰＦＳ（右図）の詳細な情報を提供する。ステージによって又は癌によって、５０μｍ超のＣＡＭＬサイズはＯＳ及びＰＦＳの不良を示す。最適なサイズカットオフは、最適なｐ値に関して、癌の種類に応じてわずかに変化する可能性がある。
参考文献
1. Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. PNAS 2014, 111(9):3514-3519. 2. International Patent Application Publication No. WO 2013/181532, dated December 5, 2013.3. Adams, D. L., et al., Cytometric characterization of Circulating Tumor Cells captured by microfiltration and their correlation to the CellSearch(R) CTC test. Cytometry Part A 2015; 87A:137-144.4. Adams DL, et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfilters. RSC Adv 2014, 4:4334-4342.5. Adams et al., Multi-phenotypic subtyping of circulating tumor cells using sequential fluorescent quenching and restaining, Scientific Reports 2016, 6:33488 | DOI: 10.1038/srep33488.6. International Patent Application Publication No. WO 2013/078409, dated May 30, 2013.7. International Patent Application Publication No. WO 2016/33103, dated March 3, 2016.8. Zhu P, et al., Detection of Tumor-Associated Cells in Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples for Retrospective Analysis, J of Translational Medicine, 2016, 14:198. DOI: 10.1186/s12967-016-0953-2.

Claims (19)

  1. 癌を有する被験体の全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法であって、前記方法が、癌を有する第１の被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することと、癌を有する第２の被験体と結果を比較することとを含み、より大型の細胞を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳは、より小型の細胞を有する被験体のＯＳ及びＰＳＦよりも短いと予測される、方法。
  2. 癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法であって、前記方法が、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞のサイズを決定することを含み、前記試料中の少なくとも１個の細胞のサイズが約５０μｍ以上である場合に、前記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、どの細胞のサイズも約５０μｍを超えない癌を有する被験体よりも短いと予測される、方法。
  3. 癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法であって、前記方法が、癌を有する被験体に由来する生体試料の選択された体積中の循環細胞の比を決定することを含み、該比が生体試料７．５ｍＬ当たり約６個以上の細胞と等しい場合、前記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、生体試料７．５ｍＬ当たり６個未満の細胞と等しい比を持つ癌を有する被験体よりも短いと予測される、方法。
  4. 癌を有する被験体のＯＳ及びＰＦＳを予測する方法であって、前記方法が、癌を有する被験体に由来する生体試料中の循環細胞におけるＣＥＰ１７ドットの数を決定することを含み、前記試料中の少なくとも１個の細胞が約１０以上のＣＥＰ１７ドットを有する場合、前記被験体のＯＳ及びＰＦＳは、被験体に由来する生体試料中のどの細胞も約１０以上のＣＥＰ１７ドットを有しない癌を有する被験体よりも短いと予測される、方法。
  5. 前記ＯＳ及び／又はＰＦＳが少なくとも１２カ月の期間に及ぶ、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＯＳ及び／又はＰＦＳが少なくとも２４カ月の期間に及ぶ、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生体試料のサイズが５ｍＬ〜１５ｍＬである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記循環細胞が、以下の特徴：
    （ａ）サイズが約１４μｍ〜６４μｍの大型の異型倍数体核、又は単一細胞における複数の核、
    （ｂ）サイズが約２０μｍ〜３００μｍの細胞サイズ、並びに、
    （ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、楕円形、二本足、三本足以上、細い足、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状、
    を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記循環細胞が、以下の追加の特徴：
    （ｄ）ＣＤ１４陽性表現型、
    （ｅ）ＣＤ４５発現、
    （ｆ）ＥｐＣＡＭ発現、
    （ｇ）ビメンチン発現、
    （ｈ）ＰＤ−Ｌ１発現、
    （ｉ）単球ＣＤ１１Ｃマーカー発現、
    （ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現、
    （ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現、及び、
    （ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現、
    の１つ以上を有する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記生体試料の供給源が、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿の１つ以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記生体試料が、前肘静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血又は頸静脈血である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記癌が、固形腫瘍、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、ステージＩＶの癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又はその他の固形腫瘍癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  13. 循環細胞が、サイズ排除法、免疫捕獲、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び様々なマイクロ流体チップ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の手段を使用して、前記決定工程のため前記生体試料から単離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  14. 循環細胞が、マイクロフィルタを使用することを含むサイズ排除法を用いて、前記生体試料から単離される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記マイクロフィルタが約５ミクロン〜約２０ミクロンの範囲の孔径を有する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記マイクロフィルタの細孔が、円形、レーストラック形、楕円形、正方形、及び長方形の細孔形状を有する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記マイクロフィルタが、精密な細孔形状及び均一な細孔分布を有する、請求項１５に記載の方法。
  18. 循環細胞が、物理的なサイズに基づく選別、流体力学的なサイズに基づく選別、分類、捕捉、免疫捕獲、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除によってマイクロ流体チップを使用して単離される、請求項１３に記載の方法。
  19. 循環細胞が、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（商標）低圧精密濾過アッセイを使用して前記決定工程のため前記生体試料から単離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112074742A (zh) 2018-03-13 2020-12-11 创微技术公司 使用循环细胞监测受试者治疗应答和疾病进展的方法
CA3224082A1 (en) * 2021-07-06 2023-01-12 Creatv Microtech Inc. Methods for predicting multi-organ metastatic disease in subjects having hyper-engorged cancer associated macrophage-like cells (camls)
WO2023004038A1 (en) * 2021-07-21 2023-01-26 Creatv Microtech Inc. Methods for predicting and/or monitoring cancer treatment response using changes in circulating cancer associated macrophage-like cells (camls)
CN113640516B (zh) * 2021-08-16 2024-05-10 天津医科大学总医院 外周血EPCs作为老老年人生存时间预测标志物的应用
WO2024039761A1 (en) * 2022-08-18 2024-02-22 Creatv Microtech, Inc. Use of extracellular vesicles and micronuclei of circulating stromal cells as pan-cancer biomarkers for predicting clinical outcomes

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010005991A2 (en) * 2008-07-07 2010-01-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Circulating tumor and tumor stem cell detection using genomic specific probes
US20140315295A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-23 Creatv Microtech, Inc. Polymer microfilters, devices comprising the same, methods of manufacturing the same, and uses thereof
JP2015523559A (ja) * 2012-06-01 2015-08-13 クリエイティブ マイクロテック インコーポレイテッドＣ 体液中の固形腫瘍の新たなバイオマーカーの捕獲、特定及び使用
WO2016033103A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 Creatv Microtech, Inc. Use of circulating cell biomarkers in the blood for detection and diagnosis of diseases and methods of isolating them
US20160178630A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Creatv Microtech, Inc. Methods for predicting overall survival of cancer patients based on numbers of circulating tumor cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2856405C (en) 2011-11-21 2021-05-25 Creatv Microtech, Inc. Polymer microfiltration devices, methods of manufacturing the same and the uses of the microfiltration devices

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010005991A2 (en) * 2008-07-07 2010-01-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Circulating tumor and tumor stem cell detection using genomic specific probes
JP2015523559A (ja) * 2012-06-01 2015-08-13 クリエイティブ マイクロテック インコーポレイテッドＣ 体液中の固形腫瘍の新たなバイオマーカーの捕獲、特定及び使用
US20140315295A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-23 Creatv Microtech, Inc. Polymer microfilters, devices comprising the same, methods of manufacturing the same, and uses thereof
WO2016033103A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 Creatv Microtech, Inc. Use of circulating cell biomarkers in the blood for detection and diagnosis of diseases and methods of isolating them
US20160178630A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Creatv Microtech, Inc. Methods for predicting overall survival of cancer patients based on numbers of circulating tumor cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL L ADAMS: "Circulating Cancer-Associated Macrophage-Like Cells Differentiate Malignant Breast Cancer and Benign", CANCER EPIDEMIOL BIOMARKERS PREV., vol. 25(7), JPN6021025420, July 2016 (2016-07-01), pages 1037 - 42, ISSN: 0004539681 *
DANIEL L ADAMS: "Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 111(9), JPN6021025423, 4 March 2014 (2014-03-04), pages 3514 - 9, ISSN: 0004539680 *

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