CN107475398A - 检测ikzf1基因突变分型的引物和方法 - Google Patents

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牛林梅
吴鹏飞
王淑
王淑一
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Abstract

本发明公开了一种检测IKZF1基因突变分型的引物和方法，其包括扩增检测全外显子序列的1对引物；采用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳技术，本发明可快速地将IKZF1基因突变分型检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，对急性淋巴细胞白血病的辅助诊断及预后判断等具有重要的参考意义。

Description

检测IKZF1基因突变分型的引物和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与急性淋巴细胞白血病有关的基因突变的引物和方法。
背景技术
人类IKZF1基因定位于7p12，DNA序列全长125kb，共有8个外显子，其编码蛋白IKAROS是一种极为重要的造血转录调控因子，属锌指蛋白家族成员，尤其在淋巴系造血方面发挥着关键性调控作用。IKAROS蛋白具有两个功能域，一为邻近N端由4个锌指结构域组成的DNA结合区(由4、5、6号外显子编码)，具有DNA结合能力与转录活性；另一为邻近C端由2个锌指结构域组成的二聚体形成区(由8号外显子编码)，参与IKAROS蛋白二聚体的形成。由于IKZF1基因外显子的可变剪接，目前已发现IKZF1具有13种不同的转录本(如图1)，其相应的蛋白亚型分别为：IK1、2、2a、3、3a、4、4a、5、6、7、8、9、10(具体的缺失片段以及对应的条带大小见表1)。
各种蛋白亚型之间差异主要在于N端DNA结合区中锌指结构不同程度的缺失，从而影响DNA结合能力和转录活性。IKAROS蛋白必须具有3个及以上的N端锌指结构才具有正常的DNA结合能力，如IK1、2、2a、3、3a，称为长型IK，能发挥转录调节作用；而少于3个N端锌指结构域的IKAROS蛋白，如IK4、4a、5、6、7、8、9、10，称为短型IK，其DNA结合能力下降或丧失。但无论是长型IK还是短型IK，相互间仍能通过C端二聚体形成区形成纯(或杂)二聚体。当短型IK与长型IK形成二聚体时，该杂合二聚体的DNA结合和转录调节能力较长型纯二聚体能力降低，称为显性负相型(dominantnegativeisoform,DN型)二聚体，影响淋巴系造血调控，尤其是IK6影响最为严重。据研究报道，DN型IKAROS在急性B淋巴细胞白血病(acuteB-lineagelymphoblasticleukemia,B-ALL)患儿中的表达率为10％～20％，其在具有融合基因BCR-ABL+的ALL中表达率较高，可达80％。且表达DN型IKAROS的患者通常具有高复发率和低生存率的特点。因此，IKZF1基因突变分型检测具有重要临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测IKZF1基因突变分型的方法，采用PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术，可用于快速检测IKZF1基因突变分型情况。所述检测IKZF1基因突变分型的引物：
IKZF-F：TCTTCGCACCCGAGGATCAG
IKZF-R：CATTTCGTTCTCCTTCTCGTAGC。
本发明还提供了检测IKZF1基因突变分型情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血中的总RNA并逆转录为cDNA；
2.用步骤1中的cDNA为模板PCR扩增IKZF全外显子；
3.对步骤2中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
4.对琼脂糖凝胶电泳结果进行判断，确定IKZF基因的分型；
本发明还提供了一种检测IKZF1基因突变分型的试剂盒，包括：
(i)全血基因组RNA抽提试剂及逆转录试剂；
(ii)PCR扩增反应液；
(iii)琼脂糖凝胶电泳试剂。
所述试剂盒的PCR扩展反应液中包括检测IKZF1基因突变分型的引物：
IKZF-F：TCTTCGCACCCGAGGATCAG
IKZF-R：CATTTCGTTCTCCTTCTCGTAGC。
有益效果：本发明设计了扩增IKZF1基因的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。IKZF1基因分型的种类较多，本发明利用PCR技术及琼脂糖凝胶电泳技术可快速进行基因分型。相比较荧光定量PCR法和Sanger测序法降低了检测的成本和难度，节省时间。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。Sanger测序法需进行测序，检测周期长，成本高。
IKZF1基因编码具有锌指结构的转录因子蛋白IKAROS，在淋巴细胞的分化和发育过程中起着重要的调控作用。IKZF1的失活、缺失或突变可导致IKAROS表达的单倍不足、显性失活或完全丧失，从而使淋巴细胞不能沿正常的途径分化、发育，而导致血液疾病。只表达显性负相IK亚基的突变小鼠，由于缺少结合DNA的N端锌指结构，在出生后不久即发生侵袭性淋巴细胞白血病。IK6是最常见的显性负相亚基之一，它可与BCR-ABL1协同作用，介导人类CD34+造血细胞异常增殖。
本研究中只设计一对引物涵盖IKZF1显性负相亚基缺失的部分，由于不同亚基缺少DNA片段的大小不同，通过琼脂糖凝胶电泳实验将具有不同片段大小的亚基区分开来，尤其是IK6可通过这种简单的方法快速检测出来。引物设计的时候考虑既要将缺失DNA包括在内，又要以较短的DNA片段来检测，这样在不影响检测结果的同时，可达到扩增效率最大化。
附图说明
图1为IKZF1基因分型情况示意图；
图2和图3为30例临床标本的电泳图，M为Marker DL 1000，B为阴性对照，如图2和图3所示，引物扩增有效，且条带单一。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
本发明是一种快速检测IKZF1基因突变分型的方法主要包括以下试剂：
(i)RNA提取试剂：红细胞裂解液；TRIzol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；
(ii)ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)；琼脂糖
(iii)PCR扩增反应液：KOD buffer；dNTP；KOD FX；
所述检测IKZF1基因突变分型的引物：
IKZF-F：TCTTCGCACCCGAGGATCAG
IKZF-R：CATTTCGTTCTCCTTCTCGTAGC
PCR所用KOD FOX及ReverTra Ace qPCR RT Kit由TOYOBO公司提供。引物由上海英潍捷基公司合成。
阴性对照为ddH2O。
实施例2
本发明方法的操作流程：
(1)抽提血液中的总RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mlTRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlRNase-free水溶解沉淀。
(2)参考TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA，-20℃保存备用。
第一步：
试剂：
反应程序
反转录条件:
65℃ 5min
第二步 冰浴 2min
试剂：
反应程序
反转录条件:
37℃ 50min
98℃ 5min
(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(4)模板：在分装好的PCR反应管中加入cDNA，空白对照加1μL生理盐水或不加任何物质。PCR扩增模板要求如下：
(5)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
(6)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
(7)结果判断：根据PCR产物片段大小将IKZF1进行基因突变分型，具体分型如下表所示。
实施例3
为了验证引物和整个检测系统的可行性，取30例临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取RNA、逆转录、配制试剂、扩增和电泳。样本加入检测体系PCR反应液中1μl，阴性对照为ddH2O。电泳结果如图2和3所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。
根据电泳结果可以将30例样本分为8型，其中22例样本携带正常型IK1，但这些样本也可能携带DN型IK4或IK5或IK7；5号、13号、16号以及30号可能携带DN型IK4或IK5或IK7；20号、21号及28号携带IK6型突变型。结果如下表
由于IK2和IK3；IK2a、IK4、IK5和IK7；IK4a和IK8基因型剪切条带大小十分接近，因此出现该类结果时，还需要结合病人的临床表现进行综合判断。
从检测结果可以看出，本发明所述引物可以较为准确的对IKZF1基因进行分型。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测IKZF1基因突变分型的引物和方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tcttcgcacc cgaggatcag 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
catttcgttc tccttctcgt agc 23

Claims (6)

1.检测IKZF1基因突变分型的引物，其特征在于所使用的扩增模板为cDNA,扩增引物为：
IKZF-F：TCTTCGCACCCGAGGATCAG
IKZF-R：CATTTCGTTCTCCTTCTCGTAGC。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述扩增引物在如下扩增体系中使用：
3.根据权利要求3所述的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系在如下扩增程序下进行：
4.检测IKZF基因突变分型的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的总RNA并逆转录为cDNA；
(2)用步骤1中的cDNA为模板PCR扩增IKZF1全外显子；
(3)对步骤2中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(4)对琼脂糖凝胶电泳结果进行判断，确定IKZF1基因的分型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增时的引物为：
IKZF-F：TCTTCGCACCCGAGGATCAG
IKZF-R：CATTTCGTTCTCCTTCTCGTAGC。
6.根据权利要求4所述的方法，其特在于，扩增程序为：
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