CN103540658A - 检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒 - Google Patents

检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN103540658A
CN103540658A CN201310457040.4A CN201310457040A CN103540658A CN 103540658 A CN103540658 A CN 103540658A CN 201310457040 A CN201310457040 A CN 201310457040A CN 103540658 A CN103540658 A CN 103540658A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
gene
xpd
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310457040.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103540658B (zh
Inventor
薛群
李文静
王淑一
徐建成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Original Assignee
HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd filed Critical HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority to CN201310457040.4A priority Critical patent/CN103540658B/zh
Publication of CN103540658A publication Critical patent/CN103540658A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103540658B publication Critical patent/CN103540658B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/30—Detection characterised by liberation or release of label
    • C12Q2565/301—Pyrophosphate (PPi)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于检测人着色性干皮病D组(xerodermapigmentosumgroupD，XPD)基因热点突变位点（Lys751Gln）的方法、引物和试剂盒，所述方法和试剂盒利用外侧特异性扩增引物SEQNO1及SEQNO2；内侧特异性测序引物SEQNO3。可检测出XPD基因热点突变位点（Lys751Gln）多态性，特异性好，准确度高。

Description

检测人XPD基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒
 
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及用于检测人着色性干皮病D组 (xeroderma pigmentosum group D，XPD) 基因热点突变位点（Lys751Gln）的方法、引物和试剂盒，能够对XPD基因突变位点进行检测，特异性好，准确度高，可提高突变检出率。
 
背景技术
人着色性干皮病D组 (xeroderma pigmentosum group D，XPD)基因又称切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complementing group2，ERCC2)，位于第19号染色体长臂q1313，有23个外显子，在核苷酸剪切修复过程中负责松解受损DNA 双螺旋；且参与基因转录过程, 是RNA 聚合酶Ⅱ介导转录过程中不可缺少的组成部分。XPD能打开损伤部位的DNA双链，为后续的切除和修复过程提供必要的条件。因而它可识别与修复基因结构无关的大范围损伤，清除体内多种DNA损伤。
目前已在XPD基因的编码区上发现8个单核苷酸多态性(SNP)位点(4个同义，4个为非同义)，而大部分研究集中在第751密码子的Lys751Gln这个多态性位点。XPD基因第751密码子A→C突变导致Lys751 →Gln751 氨基酸替代，大量的研究认为与Lys/ Lys 基因型相比，携带Lys/ Gln 或Gln / Gln基因型可显著降低染色单体型畸变的修复能力。而且不同的种族人群中，这个位点的等位基因频率有很大的差异，如第751密码子Gln/Gln纯合子发生频率在非洲裔美国人为6.9%，而在亚洲人群和高加索人群中分别为1.1%和13.4%。可见人类不同种群的遗传背景是有明显差异的。
随着检测技术和检测结果评价的规范化，可以通过检测外周血DNA修复基因XPD第751密码子单核甘酸多态性初步预测不同癌患者对化疗药物的敏感度，从而实现个体化治疗。
目前针对XPD基因热点突变位点的检测普遍采用的是聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该方法简便，结果容易判定，但是也同时存在诸多弊端，①靶片段的扩增产物要纯，如有非特异产物（特别是大片段可能含有酶识别序列）将竞争酶活性，使样品消化不完全或及出现酶消化杂带；②酶消化过程要充分（即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证），避免假阴性结果；③酶切阳性结果可以确定所检测具体序列，阴性结果仅可说明非酶识别序列，但不能准确判定具体序列。④酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。
 
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用快速，准确，高通量地检测XPD基因热点突变（Lys751Gln）的方法、引物和试剂盒。
本发明提供用于检测检测人XPD基因热点突变位点的引物，所述引物包括：
(1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：
SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；
SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT
(2) 一条特异性内侧测序引物SEQ NO3，其碱基序列为：
SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。
进一步地，所述突变位点为Lys751Gln。
本发明还提供一种用于检测检测人XPD基因热点突变位点的方法，所述方法包括：
（i）提取样品中的DNA；
（ii）利用一对特异性外侧扩增引物SEQ NO1和SEQ NO 2，进行PCR扩增，获得扩增产物，其中SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT；
（iii）将（ii）中的扩增产物进行电泳鉴定，确定是否扩增成功；
（iv）若扩增成功，利用一条特异性内侧测序引物SEQ NO3对所述扩增产物进行焦磷酸测序，获得所述扩增产物的基因序列，其中 SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.；
（v）将所述基因序列与人XPD基因第23外显子野生型基因序列进行比对，判断是否存在热点突变位点。
优选地，步骤(ii)的PCR扩增反应条件为94℃ 5min；98℃ 30s、 58℃ 30s、68℃ 30s，35个循环；最后68℃ 5min。
本发明还提供一种用于检测人XPD基因热点突变位点的试剂盒，包括血液DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述PCR扩增反应液包括一对用于扩增人XPD基因第23外显子的外侧特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：
SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；
SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT
所述焦磷酸测序反应液包括一条内侧特异性测序引物SEQ NO3，其碱基序列为：
SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。
进一步地，所述PCR扩增反应液还包括2*PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNA Polymerase和ddH2O。
进一步地，所述阳性对照品为含有人XPD基因纯合突变样本DNA的溶液，所述阴性对照品ddH2O，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
本发明根据XPD基因热点突变位，设计了第23外显子PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物。虽然特异性扩增引物与测序引物均是通过专业的软件设计，但通过软件设计往往会有很多对引物，要综合分析判断，还要在试验中验证，引物很关键，对扩增产物以及测序位点的特异性、准确性有重大影响，不同引物对扩增出来的产物质量及突变位点的峰形判读是有差异的。本专利设计的引物是通过精密分析，反复验证而选择出来的最佳引物对，保证了准确性和特异性。所设计出的扩增产物和测序引物的序列如表1所示。
表1. 第23外显子引物序列
SEQ NO1及SEQ NO2为用于扩增人XPD基因第23外显子的引物，其中SEQ NO1作为正向引物，SEQ NO2作为反向引物，可以扩增待测血液样品中相应的DNA片段，与此同时还对反向引物SEQ NO2的5’端进行生物素(Biotin)标记，使测序结果更直观显示特异性基因的序列，同时生物素高度稳定，也是一大优势；SEQ NO3为焦磷酸测序正向测序引物，对前述扩增所得片段进行测序。
焦磷酸测序技术是一种新的序列分析技术，是通过由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应来实现的。在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往只需对长几十个碱基的序列进行测序就可以满足需要。在这种情况下，焦磷酸测序技术是最适合作为这些应用中的DNA序列分析技术。其具有高重复性、高并行性和高度的自动化等优势，可程序化，便于构建标准化操作流程和规范，从而可以保证实验结果的稳定性和准确性，很适合对大样本的快速检测。最终根据峰值对序列的突变位点进行判读，从而实现XPD基因突变位点的定点检测。
有益效果：将焦磷酸测序技术应用于XPD基因热点突变位点的检测，可检测出其热点突变位点（Lys751Gln）多态性，特异性好，准确度高。PCR试剂用量和程序是经优化后确定；退火温度亦经优化后确定。将PCR 与焦磷酸测序技术的结合，可通过基因序列的直观确认减少由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果，即提高检测的准确性和特异性，又避免了常规的DNA 测序技术在速度和消耗上不能满足对大规模样本快速检测的现象，是一项非常强大而有用的短序列适时检测技术，通量大、并行性好、自动化程度高，很适合对大样本的快速检测，省时省力、节约费用，具有PCR-RFLP法不可比拟的优势。总之，将PCR 与焦磷酸测序技术的结合使用不仅提高检测的准确性和特异性，又避免了常规的DNA 测序技术在速度和消耗上不能满足对大规模样本快速检测的现象。
 
附图说明
图1是XPD基因第23外显子扩增后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。
图2A为1号样本经第23外显子引物扩增后，焦磷酸测序结果。
图2B为1号样本Sanger测序结果。
图3A为2号样本经第23外显子引物扩增后，焦磷酸测序结果。
图3B为2号样本Sanger测序结果。
图4A为3号样本经第23外显子引物扩增后，焦磷酸测序结果。
图4B为3号样本Sanger测序结果。
 
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测检测人XPD基因热点突变位点的引物，所述引物包括：
(1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：
SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；
SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT
(2) 一条特异性内侧测序引物SEQ NO3，其碱基序列为：
SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。
一种用于检测人XPD基因热点突变位点的试剂盒，包括血液DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒还包括，其中
血液DNA抽提试剂购自天根生物。
PCR扩增反应液：2*PCR Buffer(10.0 μL)、dNTPs (2mM)、KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)、ddH2O、一对用于扩增人XPD基因第23外显子的外侧特异性扩增引物SEQ NO1 (10μM)和SEQ NO2 (10μM)；
焦磷酸测序反应液：PyroMark Binging Buffer(购买自Qiagen)、Streptavidin Sepharase High Performance（bead）(购买自Qiagen)、PyroMark Annealing Buffer(购买自Qiagen) 、测序引物SEQ NO3（10μM）；
阳性对照品：含有人XPD基因纯合突变样本DNA的溶液，严禁反复冻融。
阴性对照品：ddH2O为阴性对照品。
空白对照品：空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
 
实施例2：血液样本DNA抽提
1）血液样本DNA抽提（根据天根生物血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒说明书）：抽提人血液标本DNA，样本抽提方法如下。
1.1 抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5 分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1 分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。加入20 μl 蛋白酶K 溶液，混匀。
1.2 加入200 μl 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.3 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.4 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3 中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放回收集管中。
1.5 向吸附柱CB3 中加入500 μl 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。
1.6 向吸附柱CB3 中加入700 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400×g)离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。
1.7 向吸附柱CB3 中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm (13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
1.8 将吸附柱CB3 放回收集管中，12,000 rpm(13,400×g)离心2 分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.9 将吸附柱CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 分钟，12,000 rpm (13,400×g)离心2 分钟，将溶液收集到离心管中。
 
实施例3：DNA扩增以及电泳
按照实施例2提取血液样本DNA，然后利用一对扩增引物SEQ NO1、SEQ NO2进行扩增。
(i)按样品数n（样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个）取预混PCR反应液每管47μL分装于反应管中。
(ii)将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取3μL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，获得扩增产物，具体反应体系及循环扩增体系如下：
表2. 第23外显子PCR 反应体系
试剂名称 用量
ddH2O 9.6 μL
2*PCR Buffer 25.0 μL
dNTP(2mM) 10.0 μL
SEQ NO1 (10uM) 1.2 μL
SEQ NO2 (10uM) 1.2 μL
KOD FX(1U/μl) 1.0 μL
Template DNA 2.0 μL
表3. 第23外显子PCR 循环体系
步骤1 步骤2 步骤3 步骤4
循环数: 1 循环数:  35 循环数: 1 循环数: 1
94 ℃，5min 98℃，30sec 68℃，5min 4℃，∞
  58℃，30sec    
  68℃，30sec    
(iii)电泳鉴定：1.5%琼脂糖凝胶电泳，120V，20min，凝胶成像系统观察。XPD第23外显子扩增目的片段为337bp，Marker为DL2000。
 
实施例4：焦磷酸测序
(i)单链模板的制备：将按照表4事先配好并充分混匀的试剂加入到按照实施例3中的方法获得PCR扩增产物里，室温孵育10~15min，期间震荡2~3次，以免bead下沉。链霉亲和素包被的磁珠试剂配制如表4所示。
表4. 链霉亲和素包被的磁珠试剂配制表
    试剂名称 反应体积 ×N
PyroMark Binging Buffer 47μL 47×N μL
Streptavidin Sepharase High Performance（bead） 3μL 3×N μL
合计 50μL 50×N μL
与磁珠结合后的PCR扩增产物分别在75%乙醇，0.2mol/L的NaOH溶液及Tris洗脱液中各孵育10秒，充分反应后变性得到单链DNA。将与磁珠结合后的单链释放悬浮于45μL退火缓冲液 (100 mM Tris-acetate pH 7.75, 20 mM Mg-acetate)(含10 pmol测序引物SEQ NO3) 中，具体试剂配制见表5。在80℃下孵育2分钟，然后在室温下放置5分钟。
表5. 退火缓冲液表
    试剂名称 反应体积 ×N
PyroMark Annealing Buffer 43μL 43×N μL
SEQ NO3（10μM） 2μL 2×N μL
合计 45μL 45×N μL
(ii) 将按照(i)得到的反应产物进行测序反应，该步骤在28℃下自动在PYROMARK ID仪器的SQA模式下进行检测，随着酶促的反应的进行，CCD摄像机检测并收集光信号，最终得到检测序列。
(iii)焦磷酸测序结果分析：对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，与野生型基因序列进行比较，确定是否存在突变。第23外显子的突变类型主要为置换突变，第751位密码子中出现A→C转换，引起蛋白中该位点的赖氨酸转变为谷氨酸 (K751Q)。将以上结果与Sanger测序结果进行比对验证，发现结果一致，准确率为100%。
 
实施例5：临床样本琼脂糖凝胶电泳
取3例受检血液样本，分别按照实施例2至实施例4所示的方法进行样本DNA提取、扩增和电泳。结果如图1所示，3例样本的扩增产物大小大约为337bp。可知对这3例样本而言，扩增均取得成功。M为TAKARA 2000的Marker。
 
实施例6：1号样本XPD基因热点突变检测
取实施例5中的1号样本进行XPD基因热点突变检测，将按照实施例2和实施例3的方法进行样本DNA提取和扩增，获得扩增产物。再对扩增产物进行焦磷酸测序，结果如图2A所示，由于正向测序标准序列应为CTGAAGAGGATAGA，可知1号样本XPD基因为野生型。为了验证该方法的准确性，同时对扩增产物进行Sanger测序，测序结果如图2B所示，对751位点用方框作标记，即Lys751Lys，也证实1号样本是野生型的。所以利用焦磷酸测序获得的结果是可靠的。
 
实施例7：2号样本XPD基因热点突变检测
取实施例5中的2号样本进行XPD基因热点突变检测，将按照实施例2和实施例3的方法进行样本DNA提取和扩增，获得扩增产物。再对扩增产物进行焦磷酸测序，结果如图3A所示，由于正向测序标准序列应为CTGAAGAGGATAGA，可知2号样本XPD基因出现完全A→C转换，CTGCAGAGGATAGA，即为纯合突变样本。为了验证该方法的准确性，同时对扩增产物进行Sanger测序，测序结果如图3B所示，对751位点用方框作标记，即Gln751Gln，也证实2号样本是纯合突变样本。所以利用焦磷酸测序获得的结果是可靠的。
 
实施例8：3号样本XPD基因热点突变检测
取实施例5中的3号样本进行XPD基因热点突变检测，将按照实施例2和实施例3的方法进行样本DNA提取和扩增，获得扩增产物。再对扩增产物进行焦磷酸测序，结果如图4A所示，由于正向测序标准序列应为CTGAAGAGGATAGA，可知3号样本XPD基因出现部分A→C转换，CTGC/AAGAGGATAGA，即为杂合突变样本。为了验证该方法的准确性，同时对扩增产物进行Sanger测序，测序结果如图4B所示，对751位点用方框作标记，即Lys751Gln，也证实3号样本是杂合突变样本。所以利用焦磷酸测序获得的结果是可靠的。
 
序列表
<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120>检测人XPD基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1 
tctggattat acggacatct c                                                21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2 
tcacctgact tcataagacc t                                                21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3 
gctagaatca gaggagacg                                                 19
序列表
<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120>检测人XPD基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
 
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
tctggattat acggacatct c                                                21
 
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
tcacctgact tcataagacc t                                                21
 
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
gctagaatca gaggagacg                                                 19

Claims (7)

1.用于检测检测人XPD基因热点突变位点的引物，所述引物包括：
(1)一对用于扩增人XPD基因第23外显子的特异性外侧引物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：
SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；
SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT
(2) 一条特异性内侧测序引物SEQ NO3，其碱基序列为：
SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述突变位点为Lys751Gln。
3.一种用于检测检测人XPD基因热点突变位点的方法，所述方法包括：
（i）提取样品中的DNA；
（ii）利用一对特异性外侧扩增引物SEQ NO1和SEQ NO 2，进行PCR扩增，获得扩增产物，其中SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT；
（iii）将（ii）中的扩增产物进行电泳鉴定，确定是否扩增成功；
（iv）若扩增成功，利用一条特异性内侧测序引物SEQ NO3对所述扩增产物进行焦磷酸测序，获得所述扩增产物的基因序列，其中 SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.；
（v）将所述基因序列与人XPD基因第23外显子野生型基因序列进行比对，判断是否存在热点突变位点。
4.如权利要求3所述的方法，步骤(ii)的PCR扩增反应条件为94℃ 5min；98℃ 30s、 58℃ 30s、68℃ 30s，35个循环；最后68℃ 5min。
5.一种用于检测人XPD基因热点突变位点的试剂盒，包括血液DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述PCR扩增反应液包括一对用于扩增人XPD基因第23外显子的外侧特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2，其碱基序列为：
SEQ NO1：TCTGGATTATACGGACATCTC；
SEQ NO2：Biotin-TCACCTGACTTCATAAGACCT
所述焦磷酸测序反应液包括一条内侧特异性测序引物SEQ NO3，其碱基序列为：
SEQ NO3：GCTAGAATCAGAGGAGACG.。
6.如权利要求5所述的试剂盒，所述PCR扩增反应液还包括2*PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNA Polymerase和ddH2O。
7.如权利要求5所述的试剂盒，所述阳性对照品为含有人XPD基因纯合突变样本DNA的溶液，所述阴性对照品ddH2O，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
CN201310457040.4A 2013-09-30 2013-09-30 检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒 Active CN103540658B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310457040.4A CN103540658B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310457040.4A CN103540658B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103540658A true CN103540658A (zh) 2014-01-29
CN103540658B CN103540658B (zh) 2015-05-13

Family

ID=49964506

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310457040.4A Active CN103540658B (zh) 2013-09-30 2013-09-30 检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103540658B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337957A (zh) * 2018-12-25 2019-02-15 江苏医联生物科技有限公司 检测基因组多突变类型的方法
CN109767812A (zh) * 2018-12-25 2019-05-17 江苏医联生物科技有限公司 用于检测肿瘤外周血样本变异序列的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144101A (zh) * 2006-09-15 2008-03-19 上海主健生物工程有限公司 一种通过ERCC2基因的两个不同SNPs检测肺癌易感性的试剂盒
CN102690883A (zh) * 2012-03-01 2012-09-26 解码（上海）生物医药科技有限公司 肺鳞癌易感基因无创检测试剂盒
CN103074436A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144101A (zh) * 2006-09-15 2008-03-19 上海主健生物工程有限公司 一种通过ERCC2基因的两个不同SNPs检测肺癌易感性的试剂盒
CN102690883A (zh) * 2012-03-01 2012-09-26 解码（上海）生物医药科技有限公司 肺鳞癌易感基因无创检测试剂盒
CN103074436A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CR KING等: "Interethnic variability of ERCC2 polymorphisms", 《THE PHARMACOGENOMICS JOURNAL》 *
梁刚等: "DNA修复基因XPD 单核苷酸多态与胆道癌遗传易感性", 《肿瘤》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337957A (zh) * 2018-12-25 2019-02-15 江苏医联生物科技有限公司 检测基因组多突变类型的方法
CN109767812A (zh) * 2018-12-25 2019-05-17 江苏医联生物科技有限公司 用于检测肿瘤外周血样本变异序列的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103540658B (zh) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ulirsch et al. The genetic landscape of Diamond-Blackfan anemia
Schmid et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing
CN105917008B (zh) 用于前列腺癌复发的预后的基因表达面板
Ioannidis et al. Circulating microRNA profiles during the bovine oestrous cycle
US20090047656A1 (en) Molecular analysis of primary cells
JP6987393B2 (ja) 血液中の無細胞ｄｎａを用いた血液学的障害の検出
CN103436631B (zh) 一种检测cyp3a5基因多态性的试剂盒及方法
US20150293098A1 (en) Methods for head and neck cancer prognosis
CN108588230B (zh) 一种用于乳腺癌诊断的标记物及其筛选方法
CN102816839A (zh) 用于检测结直肠癌pik3ca基因热点突变位点的试剂盒
CN103540658B (zh) 检测人xpd基因热点突变位点的方法、引物和试剂盒
CN103911439A (zh) 系统性红斑狼疮羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用
TWI402502B (zh) Genome detection system
Pichon et al. Analysis and annotation of DNA methylation in two nonhuman primate species using the Infinium Human Methylation 450K and EPIC BeadChips
Tamassia et al. Fast and accurate quantitative analysis of cytokine gene expression in human neutrophils by reverse transcription real-time PCR
CN106754903A (zh) 一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对及方法
CN103805698B (zh) 检测aml1-eto融合基因相对表达量的引物和方法
CN106119406B (zh) 多发性肉芽肿血管炎及微小动脉炎的基因分型诊断试剂盒及使用方法
CN104087671A (zh) 一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒
CN102220422A (zh) 一种检测braf基因突变的方法
CN115298324A (zh) 游离dna断裂和核酸酶
CN110305947A (zh) 染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法
CN103710436B (zh) 检测wt1基因第7外显子多态性位点的方法和引物
CN108374041A (zh) 用于fbxo32基因启动子甲基化检测的引物、检测方法及其应用
TWI718474B (zh) 評估個體罹患泌尿上皮癌之風險的方法及其套組

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant