CN106967799A - 检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用 - Google Patents

检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106967799A
CN106967799A CN201710182437.5A CN201710182437A CN106967799A CN 106967799 A CN106967799 A CN 106967799A CN 201710182437 A CN201710182437 A CN 201710182437A CN 106967799 A CN106967799 A CN 106967799A
Authority
CN
China
Prior art keywords
btk
pair
oligonucleotides
gene
sequencing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710182437.5A
Other languages
English (en)
Inventor
林筱剑
吴鹏飞
王淑
王淑一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Original Assignee
HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd filed Critical HANGZHOU ADICON CLINICAL LABORATORY CENTER Co Ltd
Priority to CN201710182437.5A priority Critical patent/CN106967799A/zh
Publication of CN106967799A publication Critical patent/CN106967799A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了检测无丙种球蛋白血症(XLA)患者的BTK基因突变的寡核苷酸、方法和试剂盒，主要涉及至少一对扩增BTK基因PH区外显子的引物；设计一对测序引物进行Sanger测序。本发明可快速地将XLA患者体内BTK基因PH区外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断重症联合免疫缺陷病，对早期干预及早期治疗有重要的参考意义。

Description

检测BTK基因突变的方法、寡核苷酸及其应用
背景技术
X-染色体连锁的无丙种球蛋白血症(XLA)是一种遗传免疫缺陷病，以B淋巴细胞分化障碍为病因，多数患者在出生后不久出现反复且又严重的细菌感染、低丙种球蛋白血症、外周血B细胞的显著减少和缺乏。1993年，Vetrie等通过定位克隆的方法找到了XLA的致病基因BTK。
BTK基因包含19个外显子，其编码的蛋白由659个氨基酸残基构成，包括C末端的一个激酶区(SH1)和N末端的4个功能区(PH、TH、SH3、SH2)。研究表明，BTK蛋白参与了B淋巴细胞的分化、肥大细胞的脱颗粒、血小板的聚集和脱颗粒，也参与调节细胞凋亡。当BTK基因发生突变时，这种突变将影响其编码蛋白的正常功能而导致不同程度的XLA的发生。据目前研究表明BTK突变遍布整个BTK基因，而没有一种突变的发生率超过3％，但其中PH区域为相对的突变多发区，故对BTK基因进行PH区外显子测序对检测XLA无疑有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供检测BTK基因突变的寡核苷酸，采用PCR技术，可用于快速检测XLA患者体内的BTK基因PH区外显子突变情况。所述寡核苷酸包括至少一对扩增BTK基因PH区外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R，其碱基序列为：
BTK-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTACAGTTGAGGGGGTGGAATAG；
BTK-1R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTCTCTAATCACCAGAAG；
BTK-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAAGAGGGATGAGGAT；
BTK-2R：AACAGCTATGACCATGCTTTGACTTTCCGGCTTTAGC；
BTK-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCCACATGACAGGTC；
BTK-3R：AACAGCTATGACCATGCAAATCTGCTGTTCCCCATC；
BTK-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTTGGTGTATGGTGTAGCA；
BTK-4R：AACAGCTATGACCATGCAGTCTCATTTCTTGGTTCAGC；
BTK-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCTTTTAAACGCTACATTCC；
BTK-5R：AACAGCTATGACCATGCTTTTCCTCCCGTCTATCTCCT；
BTK-6+F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGTTGCTTGAAGTTCACCA；
BTK-6+R：AACAGCTATGACCATGTGATTGGATTACATGGTTGCTG。
进一步地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，BTK-1F：BTK-1R、BTK-2F：BTK-2R、BTK-3F：BTK-3R、BTK-4F：BTK-4R、BTK-5F：BTK-5R和BTK-6+F：BTK-6+R的比值均为1。
进一步地，M13F：M13R的比值为1。
进一步地，BTK-1F、BTK-1R、BTK-2F、BTK-2R、BTK-3F、BTK-3R、BTK-4F、BTK-4R、BTK-5F、BTK-5R、BTK-6+F和BTK-6+R与M13F的比值均为3.125。
进一步地，所述寡核苷酸在辅助检测无丙种球蛋白血症中的应用。
本发明的目的还在于提供一种检测BTK基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)抽提样本中的基因组DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物M13F和M13R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与BTK基因PH区外显子野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其中，所述至少一对扩增引物选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R，所述至少一对扩增引物和所述一对测序引物的碱基序列为：
BTK-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTACAGTTGAGGGGGTGGAATAG；
BTK-1R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTCTCTAATCACCAGAAG；
BTK-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAAGAGGGATGAGGAT；
BTK-2R：AACAGCTATGACCATGCTTTGACTTTCCGGCTTTAGC；
BTK-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCCACATGACAGGTC；
BTK-3R：AACAGCTATGACCATGCAAATCTGCTGTTCCCCATC；
BTK-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTTGGTGTATGGTGTAGCA；
BTK-4R：AACAGCTATGACCATGCAGTCTCATTTCTTGGTTCAGC；
BTK-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCTTTTAAACGCTACATTCC；
BTK-5R：AACAGCTATGACCATGCTTTTCCTCCCGTCTATCTCCT；
BTK-6+F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGTTGCTTGAAGTTCACCA；
BTK-6+R：AACAGCTATGACCATGTGATTGGATTACATGGTTGCTG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，BTK-1F：BTK-1R、BTK-2F：BTK-2R、BTK-3F：BTK-3R、BTK-4F：BTK-4R、BTK-5F：BTK-5R和BTK-6+F：BTK-6+R的比值均为1。
进一步地，M13F：M13R的比值为1。
进一步地，BTK-1F、BTK-1R、BTK-2F、BTK-2R、BTK-3F、BTK-3R、BTK-4F、BTK-4R、BTK-5F、BTK-5R、BTK-6+F和BTK-6+R与M13F的比值均为3.125。
本发明的目的还在于提供一种检测BTK基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其中，检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R，所述至少一对扩增引物和所述一对测序引物的碱基序列为：
BTK-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTACAGTTGAGGGGGTGGAATAG；
BTK-1R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTCTCTAATCACCAGAAG；
BTK-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAAGAGGGATGAGGAT；
BTK-2R：AACAGCTATGACCATGCTTTGACTTTCCGGCTTTAGC；
BTK-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCCACATGACAGGTC；
BTK-3R：AACAGCTATGACCATGCAAATCTGCTGTTCCCCATC；
BTK-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTTGGTGTATGGTGTAGCA；
BTK-4R：AACAGCTATGACCATGCAGTCTCATTTCTTGGTTCAGC；
BTK-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCTTTTAAACGCTACATTCC；
BTK-5R：AACAGCTATGACCATGCTTTTCCTCCCGTCTATCTCCT；
BTK-6+F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGTTGCTTGAAGTTCACCA；
BTK-6+R：AACAGCTATGACCATGTGATTGGATTACATGGTTGCTG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，BTK-1F：BTK-1R、BTK-2F：BTK-2R、BTK-3F：BTK-3R、BTK-4F：BTK-4R、BTK-5F：BTK-5R和BTK-6+F：BTK-6+R的比值均为1。
进一步地，M13F：M13R的比值为1。
进一步地，BTK-1F、BTK-1R、BTK-2F、BTK-2R、BTK-3F、BTK-3R、BTK-4F、BTK-4R、BTK-5F、BTK-5R、BTK-6+F和BTK-6+R与M13F的比值均为3.125。
进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FXDNA Polymerase。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、牛小肠碱性磷酸酶、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I、牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，所述试剂盒在辅助检测无丙种球蛋白血症中的应用。
进一步地，BTK-1F/BTK-1R是一对扩增BTK基因PH区第1外显子序列的引物，BTK-2F/BTK-2R是一对扩增BTK基因PH区第2外显子序列的引物，BTK-3F/BTK-3R是一对扩增BTK基因PH区第3外显子序列的引物，BTK-4F/BTK-4R是一对扩增BTK基因PH区第4外显子序列的引物，BTK-5F/BTK-5R是一对扩增BTK基因PH区第5外显子序列的引物，BTK-6+F/BTK-6+R除了能够扩增BTK基因PH区第6外显子之外，还能够扩增与BTK基因PH区相邻的一个区域上的一个外显子。
有益效果：(1)本发明设计了扩增BTK基因PH区全部6个外显子序列的扩增引物，通过加接头，使所有6对引物的PCR产物均可以用一对测序引物进行测序，而现有的测序技术要对每种扩增产物设计特异性的测序引物，这就需要设计6条测序引物(单向测序)或12条测序引物(双向测序)，因此，本发明采用的引物在覆盖突变多发区域的同时显著地减少了引物的使用对数，同时也显著降低引物使用成本；(2)本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳；(3)常用的荧光定量PCR法要针对BTK基因PH区的不同突变类型设计多个探针，因此，在PH区的6个外显子中，如果每个外显子存在5个突变位点，则要设计30个探针，检测成本显著增加，而本发明通过给设计的扩增引物添加接头，仅需使用一对测序引物就可检测这30个突变位点以及还未被发现的其他突变类型，从而使得检测成本显著降低。
附图说明
图1为BTK基因在染色体上的定位图。
图2为BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R、BTK-6+F/BTK-6+R的电泳图。
图3、4、5、6、7、8分别为样本1BTK第1、2、3、4、5、6+号外显子测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测BTK基因突变的寡核苷酸，该寡核苷酸是针对BTK基因PH区外显子突变所设计的，包括至少一对扩增引物，所述至少一对扩增引物选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R，其碱基序列为：
BTK-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTACAGTTGAGGGGGTGGAATAG；
BTK-1R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTCTCTAATCACCAGAAG；
BTK-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAAGAGGGATGAGGAT；
BTK-2R：AACAGCTATGACCATGCTTTGACTTTCCGGCTTTAGC；
BTK-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCCACATGACAGGTC；
BTK-3R：AACAGCTATGACCATGCAAATCTGCTGTTCCCCATC；
BTK-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTTGGTGTATGGTGTAGCA；
BTK-4R：AACAGCTATGACCATGCAGTCTCATTTCTTGGTTCAGC；
BTK-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCTTTTAAACGCTACATTCC；
BTK-5R：AACAGCTATGACCATGCTTTTCCTCCCGTCTATCTCCT；
BTK-6+F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGTTGCTTGAAGTTCACCA；
BTK-6+R：AACAGCTATGACCATGTGATTGGATTACATGGTTGCTG。
所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
一种检测BTK基因突变的试剂盒，包括检测体系PCR扩增反应液和测序体系反应液，其中，
测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer(10.0μL)；dNTPs(2mM)；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；BTK基因PH区各个外显子的上、下游引物BTK-1F(10μM)、BTK-1R(10μM)、BTK-2F(10μM)、BTK-2R(10μM)、BTK-3F(10μM)、BTK-3R(10μM)、BTK-4F(10μM)、BTK-4R(10μM)、BTK-5F(10μM)、BTK-5R(10μM)、BTK-6+F(10μM)、BTK-6+R(10μM)。
测序体系反应液包括：测序纯化液(核酸外切酶I:0.6U，牛小肠碱性磷酸酶:1.2U)；EDTA(125mM)；无水乙醇；75％乙醇；HIDI(高度去离子甲酰胺)；一对测序引物M13F(3.2μM)、M13R(3.2μM)；Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。
优选地，该试剂盒还包括血液DNA抽提试剂。
优选地，该试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。阳性对照品为含有人BTK基因PH区外显子DNA的溶液，严禁反复冻融。阴性对照品为ddH2O。空白对照品为2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2血液样本DNA抽提
血液样本DNA抽提(根据天根生物血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒说明书)：抽提人血液样本DNA，具体抽提方法如下：
(1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀；
(2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；
(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
实施例3样本DNA扩增
按照实施例2抽提的血液样本DNA，然后利用实施例1中的扩增引物扩增BTK基因PH区外显子，进行扩增。扩增时在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。详情如下所示：
(i)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个+空白对照1个)取测体系PCR扩增反应液，每管19μL分装于反应管中；
(ii)将上述处理好的待测样本和阴性对照品、阳性对照品各取1μL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，获得扩增产物。测体系PCR扩增反应液配制方法如表1所示。PCR扩增扩增反应条件如表2所示。每对扩增引物的详细信息如表3所示。
表1.测体系PCR扩增反应液配制
注：表中的PrimerF和PrimerR选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R。
表2.PCR扩增扩增反应条件
表3.每对扩增引物信息
注：表中的“6+”的含义是一对引物BTK-6+F/BTK-6+R，除了能够扩增BTK基因PH区第6外显子之外，还能够扩增与BTK基因PH区相邻的一个区域上的一个外显子。
实施例4 Sanger测序
取9μl实施例3中的扩增产物和2μl实施例1中的测序纯化液按照表4中所述的程序进行纯化，从而获得纯化产物。
表4纯化程序
将1μl所获得的纯化产物分别与实施例1中的测序引物M13F(3.2μM)、M13R(3.2μM)按照表5中的体系进行混合，然后按照表6中的测序反应程序进行测序。
表5
表6.测序反应程序
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mM的EDTA，静置5min；加入15l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50l 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性试验步骤如表7所示。
表7变性试验步骤
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与BTK基因野生型参考序列(Genbank accn：NC_000005.10)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例5临床样本检测
取3例临床血液样本(样本编号为1～3)先后按照实施例1、实施例2、实施例3和实施例4，配制试剂、抽提样本DNA、扩增(获得扩增产物)和测序。
利用所获得的扩增产物，开展DNA电泳，电泳条件为1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。电泳结果如图2所示。
图2为这3例血液样本以BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R、BTK-6+F/BTK-6+R等6对扩增引物扩增后所得扩增产物的电泳图谱，M为Marker DL 2000，1～3为送检的血液样本编号1～3号。这6对引物扩增的片段长度分别为443bp、408bp、266bp、537bp、368bp、820bp，通过电泳图的分析表明这6对引物扩增有效，且条带单一。
在这3例样品中，以样本1为例进行详细说明。样本1的测序结果如图3-8所示。
图3显示是样本1的BTK基因PH区1号外显子野生型测序截图，说明样本1的1号外显子未发生突变。
图4显示是样本1的BTK基因PH区2号外显子野生型测序截图，说明样本1的2号外显子未发生突变。
图5显示是样本1的BTK基因PH区3号外显子野生型测序截图，说明样本1的3号外显子未发生突变。
图6显示是样本1的BTK基因PH区4号外显子野生型测序截图，说明样本1的4号外显子未发生突变。
图7显示是样本1的BTK基因PH区5号外显子野生型测序截图，说明样本1的5号外显子未发生突变。
图8显示是样本1的BTK基因PH区6+号外显子野生型测序截图，说明样本1的6+号外显子未发生突变，其中“6+”的含义是一对引物BTK-6+F/BTK-6+R，除了能够扩增BTK基因PH区第6外显子之外，还能够扩增与BTK基因PH区相邻的一个区域上的一个外显子。
从检测结果可以看出，本发明已经把BTK基因PH区外显子序列包括在内了，能够扩增出BTK基因PH区全部外显子，以及与BTK基因PH区相邻的一个区域上的一个外显子，并且测序结果完全准确。由检测结果可知，样本1的BTK基因PH区的6个外显子和相邻一个区域上的一个外显子均为野生型。另外，对BTK基因PH区突变阳性样本的检测也表明本发明的寡核苷酸、方法和试剂盒能够检测出BTK基因PH区外显子及其相邻一个区域上的一个外显子的突变情况。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测BTK基因突变的方法、寡核苷酸及其应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtac agttgagggg gtggaatag 39
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatgcggc ctctctaatc accagaag 38
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtgg aaccaagagg gatgaggat 39
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatgcttt gactttccgg ctttagc 37
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagttt cccccacatg acaggtc 37
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagctatg accatgcaaa tctgctgttc cccatc 36
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagttt ctttggtgta tggtgtagca 40
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagctatg accatgcagt ctcatttctt ggttcagc 38
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtga gcttttaaac gctacattcc 40
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacagctatg accatgcttt tcctcccgtc tatctcct 38
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtgc agttgcttga agttcacca 39
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacagctatg accatgtgat tggattacat ggttgctg 38
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacagctatg accatg 16

Claims (9)

1.检测BTK基因突变的寡核苷酸，其特征在于，包括：至少一对扩增BTK基因PH区外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R，其碱基序列为：
BTK-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTACAGTTGAGGGGGTGGAATAG；
BTK-1R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTCTCTAATCACCAGAAG；
BTK-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAAGAGGGATGAGGAT；
BTK-2R：AACAGCTATGACCATGCTTTGACTTTCCGGCTTTAGC；
BTK-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCCACATGACAGGTC；
BTK-3R：AACAGCTATGACCATGCAAATCTGCTGTTCCCCATC；
BTK-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTTGGTGTATGGTGTAGCA；
BTK-4R：AACAGCTATGACCATGCAGTCTCATTTCTTGGTTCAGC；
BTK-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCTTTTAAACGCTACATTCC；
BTK-5R：AACAGCTATGACCATGCTTTTCCTCCCGTCTATCTCCT；
BTK-6+F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGTTGCTTGAAGTTCACCA；
BTK-6+R：AACAGCTATGACCATGTGATTGGATTACATGGTTGCTG。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括一对测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，BTK-1F：BTK-1R、BTK-2F：BTK-2R、BTK-3F：BTK-3R、BTK-4F：BTK-4R、BTK-5F：BTK-5R和BTK-6+F：BTK-6+R的比值均为1。
4.如权利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，M13F：M13R的比值为1。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于，BTK-1F、BTK-1R、BTK-2F、BTK-2R、BTK-3F、BTK-3R、BTK-4F、BTK-4R、BTK-5F、BTK-5R、BTK-6+F和BTK-6+R与M13F的比值均为3.125。
6.一种检测BTK基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)抽提样本中的基因组DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物M13F和M13R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与BTK基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自BTK-1F/BTK-1R、BTK-2F/BTK-2R、BTK-3F/BTK-3R、BTK-4F/BTK-4R、BTK-5F/BTK-5R，或BTK-6+F/BTK-6+R，所述至少一对扩增引物和所述一对测序引物的碱基序列为：
BTK-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTACAGTTGAGGGGGTGGAATAG；
BTK-1R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTCTCTAATCACCAGAAG；
BTK-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAACCAAGAGGGATGAGGAT；
BTK-2R：AACAGCTATGACCATGCTTTGACTTTCCGGCTTTAGC；
BTK-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCCACATGACAGGTC；
BTK-3R：AACAGCTATGACCATGCAAATCTGCTGTTCCCCATC；
BTK-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTTTGGTGTATGGTGTAGCA；
BTK-4R：AACAGCTATGACCATGCAGTCTCATTTCTTGGTTCAGC；
BTK-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCTTTTAAACGCTACATTCC；
BTK-5R：AACAGCTATGACCATGCTTTTCCTCCCGTCTATCTCCT；
BTK-6+F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGTTGCTTGAAGTTCACCA；
BTK-6+R：AACAGCTATGACCATGTGATTGGATTACATGGTTGCTG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，M13F：M13R的比值为1。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，BTK-1F、BTK-1R、BTK-2F、BTK-2R、BTK-3F、BTK-3R、BTK-4F、BTK-4R、BTK-5F、BTK-5R、BTK-6+F和BTK-6+R与M13F的比值均为3.125。
9.如权利要求1～5之一所示的寡核苷酸在辅助检测无丙种球蛋白血症中的应用。
CN201710182437.5A 2017-03-24 2017-03-24 检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用 Pending CN106967799A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710182437.5A CN106967799A (zh) 2017-03-24 2017-03-24 检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710182437.5A CN106967799A (zh) 2017-03-24 2017-03-24 检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106967799A true CN106967799A (zh) 2017-07-21

Family

ID=59328959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710182437.5A Pending CN106967799A (zh) 2017-03-24 2017-03-24 检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106967799A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023092057A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating progranulin expression

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755132A (zh) * 2016-04-08 2016-07-13 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测was基因多态突变位点的方法、寡核苷酸和试剂盒
WO2016172053A1 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating ibrutinib-resistant disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016172053A1 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating ibrutinib-resistant disease
CN105755132A (zh) * 2016-04-08 2016-07-13 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 检测was基因多态突变位点的方法、寡核苷酸和试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SMITH,C.I.E. ET AL.: ""Homo sapiens Bruton tyrosine kinase (BTK), RefSeqGene (LRG_128) on chromosome X"，Accession Number：NG_009616.1", 《GENBANK》 *
Y-D. YANG ET AL.: ""Identification by whole-exome sequencing of novel mutation c.64C>G in the BTK gene of a fetus with X-linked agammaglobulinemia"", 《ULTRASOUND OBSTET GYNECOL》 *
张慧 等: ""X连锁无丙种球蛋白血症BTK基因突变类型及特点"", 《现代免疫学》 *
王莹 等: ""中国X连锁无丙种球蛋白血症40例基因型表型相关性分析"", 《中国循证儿科杂志》 *
王莹 等: ""无丙种球蛋白血症BTK基因突变研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023092057A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating progranulin expression

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593841A (zh) 检测f13a1基因突变的方法、试剂盒、寡核苷酸及其应用
CN104745697B (zh) 检测nf1基因第31‑34号全外显子的方法和引物
CN109486938A (zh) 检测smn1和smn2基因突变的方法、引物及应用
CN105506107A (zh) 检测dock2基因多态热点突变情况的引物和方法
CN106987642A (zh) 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法
CN110229880A (zh) 检测遗传性耳聋基因突变位点的引物、试剂盒和方法
CN108048553A (zh) 检测slc25a13基因突变的方法、引物和试剂盒
CN109402234A (zh) 检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物和方法
CN108998525A (zh) 检测atrx基因位点突变的引物、方法和试剂盒
CN104862407A (zh) 检测ezh2基因的引物和方法
CN108531575A (zh) 检测terc基因全外显子序列突变的引物、试剂盒和方法
CN106520967A (zh) 检测遗传性凝血因子xi（f11）基因的方法和引物
CN106399567A (zh) 检测wrap53基因突变的引物及其应用
CN111004849B (zh) 检测cdh1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒
CN108004309A (zh) 检测mthfr677、mthfr1298和mtrr66的引物、方法和试剂盒
CN105755132A (zh) 检测was基因多态突变位点的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN106967799A (zh) 检测btk基因突变的方法、寡核苷酸及其应用
CN106222287A (zh) 检测ela2基因的方法和引物
CN110358821A (zh) 检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症g6pd基因突变的引物、试剂盒和方法
CN106086215A (zh) 检测先天性角化不良症nhp2基因第4号全外显子序列突变位点的方法和引物
CN109628563A (zh) 检测piga基因启动子区域4972a&gt;g突变位点的引物、试剂盒和方法
CN106967819A (zh) 检测高IgE综合征STAT3基因突变的试剂盒和方法
CN109321638A (zh) 检测tsc1第15号外显子位点突变的引物、方法和试剂盒
CN106868184A (zh) 检测pklr基因突变的方法、试剂盒、寡核苷酸及其应用
CN107058531A (zh) 一种检测尼曼‑匹克病smpd1基因突变的试剂盒和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170721