CN108998525A - 检测atrx基因位点突变的引物、方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测ATRX碱基突变的引物，其特征在于，包括ATRX基因7号内含子突变区域；采用Sanger测序技术，可用于快速检测该突变位点。利用本发明完成的检测结果准确，不仅可以辅助诊断热点区域的突变情况，还可以作为判断突变位点对相关疾病影响的标准。ATRX基因的非激活突变会引起ATRX蛋白的表达缺失，将导致端粒的不稳定，细胞出现无限分裂。因此，针对ATRX基因突变进行检测对疾病的辨别和治疗便刻不容缓。

Description

检测ATRX基因位点突变的引物、方法和试剂盒

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测ATRX基因突变的引物，采用普通PCR技术，可用于快速检测ATRX基因的突变情况。

背景技术

脑瘤，包括由脑实质发生的原发性脑瘤和由身体其他部位转移至颅内的继发性脑瘤。近年来，颅内肿瘤发病率呈上升趋势，据统计，颅内肿瘤约占全身肿瘤的5％，占儿童肿瘤的70％，而其它恶性肿瘤最终会有20-30％转入颅内，由于其膨胀的浸润性生长，在颅内一旦占据一定空间时，不论其性质是良性还是恶性，都势必使颅内压升高，压迫脑组织，导致中枢神经损害，危及患者生命。成人以大脑半球胶质瘤为最多见，如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤等。在胶质瘤中，ATRX突变主要发生在星形胶质瘤、少突星形胶质瘤和继发性GBM中。原发性GBM和少突胶质细胞瘤中较为少见。几乎所有发生ATRX突变的胶质瘤均同时存在IDH1突变，这两种突变的同时存在可作为星形胶质瘤的临床诊断方式，且目前研究表明具有这种分子特征的患者的存活时间明显延长。

ATRX基因定位于X染色体(Xql3.3)，包含35个外显子，ATRX基因是根据ATRX综合征命名，该病是由于ATRX基因突变导致严重智力障碍与轻型α地中海贫血等症状。其编码产物分子量为270kDa的ATRX蛋白，该蛋白为染色质重塑蛋白，ATRX与死亡结构域相关蛋白(death-domain associated protein，DAXX)形成复合体后可与组蛋白H3.3相互作用并聚集于染色质和端粒。ATRX基因突变引起ATRX蛋白的表达缺失，将导致端粒的不稳定，细胞出现无限分裂，且存在ATRX/DAXX基因突变的患者存活率高于未突变的患者。到目前为止，全世界已有125种该基因的突变报道，这些突变集中位于ATRX N端的PHD锌指结构域和C端的螺旋结构域中，因此，通过对ATRX基因进行突变检测对于肿瘤的诊断、辨别和预防就显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测ATRX基因7号内含子位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测ATRX基因位点的突变情况。

检测ATRX基因位点突变情况的引物，其特征在于，包括：

(1)扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(2)检测ATRX基因第7号内含子突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT。

本发明第二个目的在于提供检测ATRX基因位点突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的基因组DNA；

(2)用PCR扩增步骤(1)中提取的DNA；扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(3)对步骤(2)中的扩增产物进行测序；检测ATRX基因第7号内含子突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(4)对测序结果进行判断，确定ATRX基因位点是否发生突变。

本发明第三个目的是提供一种检测ATRX基因位点突变的试剂盒，包括

(1)血液DNA抽提试剂；

(2)PCR扩增反应体系试剂；包括扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(3)测序体系试剂；包括检测ATRX基因第7号内含子突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT

(4)阳性对照品和阴性对照品。

有益效果：本发明设计了扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测ATRX基因突变点的方法，可以一次将ATRX基因突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为ATRX基因在染色体上的定位图。

图2为ATRX基因7号内含子的1～15号样本的电泳截图。

图3为ATRX基因7号内含子的测序截图。

具体实施方式

实施例1

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

一种检测ATRX基因位点突变的引物，该引物的设计针对第7号内含子101175C>T突变位点，包括：

一种检测ATRX基因101175C>T位点突变的试剂盒，包括

(1)血液DNA抽提试剂；

(2)PCR扩增反应体系试剂；包括扩增ATRX基因突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(3)测序体系试剂；包括检测ATRX基因突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT

(4)阳性对照品和阴性对照品。

其中，血液DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；ATRX基因101175位点上、下游引物(10μM)。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI：0.6U，CIP：1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：ATRX-F和ATRX-R(3.2μm)。

实施例2

血液基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组DNA

1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加1μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT

(5)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合

测序反应程序：

(6)沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与ATRX(Genbank accn：NC_000023.11)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取15例临床样品，按实施例1和2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。检测体系PCR反应液中加入样本1μl。电泳结果如图2所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本的检测结果如图3所示：

图3为样本ATRX基因第7号内含子101175位碱基的测序截图。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把突变区域序列包括在内了，且能够扩展出ATRX基因第7号内含子，并且测序结果完全准确。其中第7号内含子101175位碱基发生突变，为101175C>T，该突变位点在已知文献中并未报道，经过对多个样本测序的结果显示，此突变为ATRX基因现发现的新的点突变，虽然突变点位于内含子区域，但便于判断和分析产生的基因突变是否会造成相关疾病以及辅助筛查造成疾病的病因。

序列表

<110> 北京艾迪康医学检验实验室有限公司

<120> 检测ATRX基因位点突变的引物、方法和试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtgtcctg gagattttc 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attacctacc tacattgttc at 22

Claims (3)

1.检测ATRX基因突变情况的引物，其特征在于，包括：

(1)扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(2)检测ATRX基因第7号内含子突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT。

2.检测ATRX基因突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的基因组DNA；

(2)用PCR扩增步骤(1)中提取的DNA；扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(3)对步骤(2)中的扩增产物进行测序；检测ATRX基因第7号内含子突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(4)对测序结果进行判断，确定ATRX基因位点是否发生突变。

3.检测ATRX位点突变的试剂盒，包括：

(1)血液DNA抽提试剂；

(2)PCR扩增反应体系试剂；包括扩增ATRX基因第7号内含子突变点序列的引物：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT；

(3)测序体系试剂；包括检测ATRX基因第7号内含子突变点序列的测序引物，其碱基序列为：

ATRX-F：CAGTGTCCTGGAGATTTTC

ATRX-R：ATTACCTACCTACATTGTTCAT

(4)阳性对照品和阴性对照品。