CN109777868A - 一种检测jak3基因内含子2基因突变的引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测JAK3基因内含子2区域3821C＞T、3839G＞A、3841G＞A、3895C＞T位点突变的引物和方法，其包括(i)扩增JAK3基因内含子2序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。采用Sanger测序技术，可快速发现这些突变位点。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助检查该区域的突变情况。本发明可快速地将JAK3基因内含子2区域3821C＞T、3839G＞A、3841G＞A、3895C＞T突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，对疾病的病因探究的具有参考意义。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测JAK3基因内含子2基因突变的引物和检测方法，采用普通PCR技术，可用于快速检测JAK3基因内含子2的突变情况。
背景技术
JAK3基因位于19号染色体p12.13.1，其开放读码框有3372个碱基，编码1124个氨基酸，共24个外显子。从羧基到氨基酸端分别为JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、JH7。JH1为激酶域，对调节激酶活性有重要作用。JH2为伪激酶结构域，尽管缺乏催化活性，但却具有某些必需的调节作用，许多在此区域的病人或人为的突变将导致激酶活性尚失。JH3～JH5区域的功能目前尚未研究明确，考虑可能与JAKs在体内的装配有关。JH6与JH7的N端是JAKs与γc相结合所必需的，在信号传导中起重要作用。JH6、JH7又称之为FERM，共编码约300个氨基酸，介导部分细胞因子与细胞因子受体之间的相互作用，同时在调节细胞表面同源受体的表达中也起重要作用，并与激酶域共同促进、调节激酶催化活性。
JAK3主要表达于造血干细胞，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15的共同受体共同γ链(γc)相结合，对信号从γc至转录激活家族(STATs)的传导尤为重要，对细胞发育与活性具有重要调节作用。IL-7所介导的信号通路对T细胞的发育起关键作用，IL-2则促进外周T细胞的稳定以及抗原特异性T细胞的增殖，IL-15是NK细胞发育所必需的，而IL-4却只对终末B细胞的分化以及同型间的转换起作用。JAK3缺陷的患儿临床表现为反复细菌或病毒感染，外周血T细胞及NK细胞严重减少，B细胞数量正常或稍减少但存在功能障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测JAK3基因内含子2突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测患者体内JAK3基因内含子2突变位点的情况。所述检测JAK3基因内含子2位点突变情况的引物，包括：
扩增JAK3基因内含子2的引物，其碱基序列为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测JAK3基因内含子2的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，引物序列JAK3-Int 2-F和JAK3-Int 2-R是扩增JAK3基因内含子2序列的引物。
本发明还提供了检测JAK3基因内含子2突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提血液/中的DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定JAK3基因内含子2是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增JAK3基因内含子2的引物，其碱基序列为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
进一步地，测序引物碱基序列为：
检测JAK3基因内含子2的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测JAK3基因内含子2位点突变的试剂盒，包括：
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
(扩增)JAK3基因内含子2的引物，其碱基序列为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
有益效果：本发明设计了扩增JAK3基因内含子2的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测JAK3基因内含子2区域的方法，可以一次将JAK3基因内含子2的突变检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为引物JAK3-Int 2-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，如图1所示，引物JAK3-Int 2-F/R扩增有效，且条带单一。
图2、3、4分别为样本1、3、4的JAK3基因内含子2突变型测序截图。
图5、6、7分别为样本2、5的JAK3基因内含子2野生型测序截图
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测JAK3基因内含子2基因位点突变的引物，该引物的设计是针对JAK3基因内含子2设计的扩增引物，包括：
扩增JAK3基因内含子2的引物，其碱基序列为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
一种检测JAK3基因内含子2位点突变的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；JAK3基因内含子2的上、下游引物引物JAK3-Int 2-F/R引物浓度均为10μM。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测JAK3基因内含子2的上、下游引物分别为M13-F(3.2μm)、M13-R(3.2μm),以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国AppliedBiosystems公司)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即血液样本以JAK3-Int 2-F/R为引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度为458bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物JAK3-Int 2-F/R扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与JAK3基因内含子2野生型参考序列(Genbank：NG_007273.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取5例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系PCR反应液中加入样本1μl。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物JAK3-Int 2-F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样本的检测结果如图2、3、4、5、6、7所示：
图2显示是样本1、3、4的JAK3基因内含子2突变型3821C＞T位点测序截图，说明样本1、3、4的内含子2发生3821C＞T突变。
图3显示是样本1、3、4的JAK3基因内含子2突变型3839G＞A和3841G＞A位点测序截图，说明样本1、3、4的内含子2发生3839G＞A和3841G＞A突变。
图4显示是样本1、3、4的JAK3基因内含子2突变型3895C＞T位点测序截图，说明样本1、3、4的内含子2发生3895C＞T突变。
图5显示是样本2、5的JAK3基因内含子2野生型3821C＞T位点测序截图，说明样本2、5的JAK3基因内含子2未发生3821C＞T突变。
图6显示是样本2、5的JAK3基因内含子2野生型3839G＞A和3841G＞A位点测序截图，说明样本2、5的JAK3基因内含子2未发生3839G＞A和3841G＞A突变。
图7显示是样本2、5的JAK3基因内含子2野生型3895C＞T位点测序截图，说明样本2、5的JAK3基因内含子2未发生3895C＞T突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物能够扩展出JAK3基因内含子2序列，并且测序结果完全准确，无论是野生型还是突变型。
序列表
<110> 合肥艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 一种检测JAK3基因内含子2基因突变的引物和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagttt acaggcataa gccaccg 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgacac ccttctccat tacaaaa 37
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatg 16
Claims (4)
1.一种检测JAK3基因内含子2突变的试剂盒，包括扩增引物，其特征在于，扩增JAK3基因内含子2的引物碱基序列为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列JAK3-Int 2-F和JAK3-Int 2-R是扩增JAK3基因内含子2序列的引物。
3.一种检测JAK3基因内含子2突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的组织DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定JAK3基因内含子2 3821C＞T、3839G＞A、3841G＞A、3895C＞T是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
JAK3-Int 2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT TTACAGGCATAAGCCACCG
JAK3-Int 2-R：AACAGCTATGACCATG ACACCCTTCTCCATTACAAAA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
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2019
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