CN110218773A

CN110218773A - 一种检测bcorl1基因内含子7基因突变的引物和方法

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Publication number: CN110218773A
Application number: CN201910529910.1A
Authority: CN
Inventors: 刘赵玲; 裘振亚; 王淑一
Original assignee: JINAN ADICON MEDICAL EXAMINATION CENTER Co Ltd
Current assignee: JINAN ADICON MEDICAL EXAMINATION CENTER Co Ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2019-09-10

Abstract

本发明公开了一种检测BCORL1基因内含子7区域51318 A＞AG位点突变的引物和方法，其包括(i)扩增BCORL1基因内含子7序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。采用Sanger测序技术，可快速发现此突变位点。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助检查该区域的突变情况。本发明可快速地将BCORL1基因内含子7区域51318 A＞AG突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断AML和再生障碍性贫血，对疾病的诊断和预后有重要的参考意义。

Description

一种检测BCORL1基因内含子7基因突变的引物和方法

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测BCORL1基因内含子7 基因突变的引物和检测方法。

背景技术

BCORL1基因位于X染色体Xq25-q26.1细胞带，大约在129.14至129.19Mb 之间，含有13个外显子，编码1711个氨基酸，是一个转录共抑制因子。在大部分人正常组织中BCORL1呈现低表达或表达缺失，仅仅在睾丸和前列腺组织呈现高表达。

BCORL1基因的功能研究发现，其与Ⅱ类组蛋白脱乙酰基酶(histonedeacetylase，H D A C)存在相互作用，如HDAC4、HDAC5和HDAC7，BCOR1 通过结合启动子区域特定位点抑制E—cadherin基因转录，另外，BCORL1也可以与c端结合蛋白(C—terminalbinding protein，CtBP)协同作用，发挥E —cadherin转录抑制功能。E—cadherin表达受损NSCIC、胃癌、肝细胞癌和卵巢癌等肿瘤侵袭转移相关，而在包括NSCLC在内的多种肿瘤中，E—cadherin 启动子甲基化状态与其基因表达调控相关。提示BCORL1是一个肿瘤相关促进基因。

80％BCORL1基因突变发生在原始细胞，细胞系中的所有BCORL1突变都会截断编码蛋白，从而引起无义突变、剪接位点突变或插入或缺失。所有BCORL1 截断突变都被预测会导致缺乏LXXLL核受体募集模体和C端的多肽严重缩短。 BCORL1突变在AML发病机制中起重要作用，在6％的急性髓性白血病(AML) 患者以及21％的AML细胞系中的存在BCORL1基因突变，BCORL1是一个新的候选肿瘤促进基因。

除此之外，BCORL1基因突变还和再生障碍性贫血(AA)有关，研究结果显示，AA突变最常累及的5个基因为PIGA、BCOR/BCORL1、DNMT3A和 ASXL1。BCOR、BCORL1和PIGA基因突变在AA患者中更为显著，而JAK2、 RUNX1、TET2和TP53基因突变在AA中则相对少见。并且，AA患者基因突变在位点分布上与MDS/AML有高度重叠，主要表现为移码、无义和剪接突变。因此，对再生障碍性贫血的患者检测BCORL1基因突变，有助于了解疾病进程，而且AA高度特异性突变(如BCOR、BCORL1和PIGA突变)通常提示对免疫抑制疗法有好的效果并预后良好，生存率高。

由此表明，BCORL1基因突变的检测对再生障碍性贫血疾病进程演变及预后观测有重要的作用，尤其是在成人急性髓系白血病中的预后判断及治疗药物的选择具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测BCORL1基因内含子7突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测患者体内BCORL1基因内含子7突变位点的情况。所述检测BCORL1基因内含子7位点突变情况的引物，包括：

扩增BCORL1基因内含子7的引物，其碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测BCORL1基因内含子7的测序引物碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

进一步地，引物序列BCORL1-Int7-F和BCORL1-Int7-R是扩增BCORL1 基因内含子7序列的引物。

本发明还提供了检测BCORL1基因内含子7突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提血液中的DNA；

2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

4.对测序结果进行判断，确定BCORL1基因内含子7是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

扩增BCORL1基因内含子7的引物，其碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

进一步地，测序引物碱基序列为：

检测BCORL1基因内含子7的测序引物碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

本发明还提供了一种检测BCORL1基因内含子7位点突变的试剂盒，包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中PCR扩增反应液引物为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

进一步地，测序引物碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

有益效果：本发明设计了扩增BCORL1基因内含子7的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测BCORL1基因内含子7区域的方法，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为引物BCORL1-Int 7-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000。

图2为样本1的BCORL1基因内含子7突变型测序截图。

图3为样本2的BCORL1基因内含子7野生型测序截图

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测BCORL1基因内含子7基因位点突变的引物，该引物的设计是针对BCORL1基因内含子7设计的扩增引物，包括：

扩增BCORL1基因内含子7的引物，其碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

一种检测BCORL1基因内含子7位点突变的试剂盒，包括

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；BCORL1基因内含子7的上、下游引物BCORL1-Int7-F/R 引物浓度均为10μM。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测BCORL1基因内含子7的上、下游引物分别为M13-F(3.2μm)、M13-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)， 12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3 中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液 PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm 离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl 分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl 无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与BCORL1基因内含子7野生型参考序列(Genbank：NG_021274.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取2例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系PCR反应液中加入样本1μl。电泳结果如图1所示(文字说明是5例临床样本，电泳图是只有两例样本，请确认并修改)，表明本发明所述引物BCORL1-Int 7-F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本的检测结果如图2和图3所示：

图2显示是样本1的BCORL1基因内含子7突变型51318A位点测序截图，说明样本1的内含子7发生51318A＞AG突变。

图3显示是样本2的BCORL1基因内含子7野生型51318A位点测序截图，说明样本2的内含子7未发生51318A＞AG突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物能够扩展出BCORL1基因内含子7 序列，并且测序结果完全准确，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110> 济南艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 一种检测BCORL1基因内含子7基因突变的引物和方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttcctgttt cttgccttca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcccattct gcaaatccac 20

Claims

1.一种检测BCORL1基因内含子7突变的扩增引物，其特征在于，

扩增BCORL1基因内含子7的引物碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

2.根据权利要求1所述的扩展引物，其特征在于，还包括测序引物，

所述测序引物序列为

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC 。

3.一种检测BCORL1基因内含子7突变情况的方法，包括以下步骤：

1)抽提血液中的组织DNA；

2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

3)对步骤2中的扩增产物进行测序；

4)对测序结果进行判断，确定BCORL1基因内含子7 51318 A位点是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：

BCORL1-Int7-F：TTTCCTGTTTCTTGCCTTCA

BCORL1-Int7-R：TTCCCATTCTGCAAATCCAC。