CN104131095A - 用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物和试剂盒 - Google Patents

用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物和试剂盒 Download PDF

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CN104131095A CN201410360259.7A CN201410360259A CN104131095A CN 104131095 A CN104131095 A CN 104131095A CN 201410360259 A CN201410360259 A CN 201410360259A CN 104131095 A CN104131095 A CN 104131095A
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Abstract

本发明提供了一种用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物和试剂盒，所述引物组合物包括分别针对与原发性免疫缺陷病相关的90个基因非重复区域的多个引物序列。

Description

用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物和试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域，具体地说，涉及一种用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物和试剂盒。
背景技术
免疫缺陷病(immunodeficiency diseases，IDD)是一组由于免疫系统发育不全或遭受损害所致的免疫功能缺陷引起的疾病。有两种类型：1、原发性免疫缺陷病，又称先天性免疫缺陷病，与遗传有关，多发生在婴幼儿；2、继发性免疫缺陷病，又称获得性免疫缺陷病，可发生在任何年龄，多因严重感染，尤其是直接侵犯免疫系统的感染、恶性肿瘤、应用免疫抑制剂、放射治疗和化疗等原因引起。
免疫缺陷病的病因比较复杂，在临床表现及实验室检查方面，原发性与继发性免疫缺陷病往往不容易区别。在临床上，原发性免疫缺陷往往也会伴有其他系统的继发免疫缺陷，如性联无丙种球蛋白血症患者可出现继发的抑制正常B细胞产生抗体的T细胞或单核细胞亚群。同样的临床表现和实验室检查异常可以由于不同的基因缺陷或致病因子作用引起，而同一基因不同的点突变可引起病变严重程度的不一致，由于这些因素的影响，有时要做出明确的免疫缺陷病病因诊断是比较困难的。在台湾儿童的原发性免疫缺陷病的发病率是2.17/10万，新加坡2.65/10万，瑞典8.4/10万，而我国10/10万，每年约有3-6万累计病例。大约40％的原发性免疫缺陷病起病于1岁以内，另外40％在5岁以内，15％于16岁以内，仅5％发病于成人期。原发性免疫缺陷病种类较多，近年来分子生物学和遗传学技术快速发展，诊断技术不断改进，新原发性免疫缺陷病数目随之增加，仅2003年就发现12种新型原发性免疫缺陷病，使原发性免疫缺陷病疾病总数达到110种。
随着科学进步和人民生活水平不断提高，儿童期的疾病谱已发生了很大变化，外源性感染、中毒、外伤、缺氧、营养不良等非遗传因素造成的疾病得到了极大控制，遗传性因素在病因构成中日显突出。目前，人类的遗传性疾病的发病率和死亡率有逐年增高的趋势，人类的遗传性疾病已成为威胁人类健康的一个重要因素。原发性免疫缺陷病是遗传病中的一大类疾病，免疫球蛋白疾病、补体系统疾病、白细胞分化抗原疾病、细胞因子疾病、粘附分子疾病、淋巴细胞疾病、粒细胞疾病、炎症性疾病、免疫系统疾病、肉芽肿疾病、伴免疫缺陷疾病、综合征疾病，目前已发现的超过100种，虽然每种疾患均属少见病，但累积患病率相当可观，危害极大。
目前基因诊断方法较单一，主要是根据临床症状选择候选基因，进行单个或几个基因的重测序，费时费力。因此，寻找有效、快速、经济、简单的免疫缺陷病诊断技术，降低儿童/人类死亡率和致残率，已成为保障儿童健康中急待解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物和试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物，所述引物组合物包括分别针对CD79B(ID:974)、BTK(ID:695)、C5(ID:727)、IRAK4(ID:51135)、TNFRSF13B(ID:23495)、C6(ID:729)、IL1RN(ID:3557)、STAT3(ID:6774)、C7(ID:730)、IL2RA(ID:3559)、CD40LG(ID:959)、SERPING1(ID:710)、MASP1(ID:5648)、IL2RG(ID:3561)、AICDA(ID:57379)、CFP(ID:5199)、MASP2(ID:10747)、CD40(ID:958)、CFH(ID:3075)、RFXAP(ID:5994)、UNG(ID:7374)、CFI(ID:3426)、RFX5(ID:5993)、OSMR(ID:9180)、ICOS(ID:29851)、CFB(ID:629)、RFXANK(ID:8625)、IL31RA(ID:133396)、ITPKC(ID:80271)、CFD(ID:1675)、TAP1(ID:6890)、IL7R(ID:3575)、IGLL1(ID:3543)、C2(ID:717)、TAP2(ID:6891)、CD3D(ID:915)、CD79A(ID:973)、C3(ID:718)、TAPBP(ID:6892)、CD3E(ID:916)、BLNK(ID:29760)、C4A(ID:720)、CD8A(ID:925)、FAS(ID:355)、LRRC8A(ID:56262)、C4B(ID:721)、CD247(ID:919)、RAG1(ID:5896)、BRWD3(ID:254065)、JAK3(ID:3718)、NCF1(ID:653361)、CHST11(ID:50515)、SLC35C1(ID:55343)、NCF2(ID:4688)、FSTL3(ID:10272)、FERMT3(ID:83706)、NCF4(ID:4689)、BCL2(ID:596)、CD40L(ID:959)、CYBA(ID:1535)、KLHDC8B(ID:200942)、WAS(ID:7454)、CYBB(ID:1536)、RARA(ID:5914)、TYK2(ID:7297)、PML(ID:5371)、RAG2(ID:5897)、PNP(ID:4860)、ELANE(ID:1991)、ROBLD3(ID:28956)、AIRE(ID:326)、GFI1(ID:2672)、MYD88(ID:4615)、BTG1(ID:694)、HAX1(ID:10456)、BCL3(ID:602)、IRAK4(ID:51135)、IKBKG(ID:8517)、TIRAP(ID:114609)、UNC93B1(ID:81622)、TLR3(ID:7098)、G6PC3(ID:92579)、CARD9(ID:64170)、CLEC7A(ID:64581)、IL17RA(ID:23765)、LBR(ID:3930)、IL17F(ID:112744)、CSF3R(ID:1441)、STAT1(ID:6772)、和CXCR4(ID:7852)基因非重复区域的多个引物序列。
进一步地，所述引物组合物具体包括如下引物序列：
1)CD79B
2)BTK
3)C5
4)IRAK4
5)TNFRSF13B
6)C6
7)IL1RN
8)STAT3
9)C7
10)IL2RA
11)CD40LG
12)SERPING1
13)MASP1
14)IL2RG
15)AICDA
16)CFP
17)MASP2
18)CD40
19)CFH
20)RFXAP
21)UNG
22)CFI
23)RFX5
24)OSMR
25)ICOS
26)CFB
27)RFXANK
28)IL31RA
29)ITPKC
30)CFD
31)TAP1
32)IL7R
33)IGLL1
34)C2
35)TAP2
36)CD3D
37)CD79A
38)C3
39)TAPBP
40)CD3E
41)BLNK
42)C4A
43)CD8A
44)FAS
45)LRRC8A
46)C4B
47)CD247
48)RAG1
49)BRWD3
50)JAK3
51)NCF1
52)CHST11
53)SLC35C1
54)NCF2
55)FSTL3
56)FERMT3
57)NCF4
58)BCL2
59)CD40L
60)CYBA
61)KLHDC8B
62)WAS
63)CYBB
64)RARA
65)TYK2
66)PML
67)RAG2
68)PNP
69)ELANE
70)ROBLD3
71)AIRE
72)GFI1
73)MYD88
74)BTG1
75)HAX1
76)BCL3
77)IRAK4
78)IKBKG
79)TIRAP
80)UNC93B1
81)TLR3
82)G6PC3
83)CARD9
84)CLEC7A
85)IL17RA
86)LBR
87)IL17F
88)CSF3R
89)STAT1
90)CXCR4
本发明还提供了用于先天性免疫缺陷病基因筛查的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括：5x PCR离子扩增mix(0.1U Tag Polymerase/μl，500μMdNTP，20mM Tris-HCl(PH8.3)，100mM KCl，3mM MgCl2)，96孔板，96孔板封口膜。
本发明的有益效果在于：
本发明引物组合物和试剂盒可一次性地对免疫球蛋白疾病(12种类型)、白细胞分化抗原疾病(4种类型)、细胞因子疾病(5种类型)、淋巴细胞疾病(9种类型)、粒细胞疾病(15种类型)和粘附分子疾病(5种类型)等49种先天性免疫缺陷病进行基因诊断(具体诊断的疾病见表1)，对先天性免疫缺陷病的分子诊断覆盖率达到90％以上，特异性好，灵敏度高。很好的改变了以往一次实验只能检测一种类型疾病的现状，大大提高了检测效率，可明确致病原因和致病基因，对于后续的治疗也有重要的意义。
表1 49种先天性免疫缺陷病及相应基因
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1用于先天性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物
根据Genbank中公开的CD79B(ID:974)、BTK(ID:695)、C5(ID:727)、IRAK4(ID:51135)、TNFRSF13B(ID:23495)、C6(ID:729)、IL1RN(ID:3557)、STAT3(ID:6774)、C7(ID:730)、IL2RA(ID:3559)、CD40LG(ID:959)、SERPING1(ID:710)、MASP1(ID:5648)、IL2RG(ID:3561)、AICDA(ID:57379)、CFP(ID:5199)、MASP2(ID:10747)、CD40(ID:958)、CFH(ID:3075)、RFXAP(ID:5994)、UNG(ID:7374)、CFI(ID:3426)、RFX5(ID:5993)、OSMR(ID:9180)、ICOS(ID:29851)、CFB(ID:629)、RFXANK(ID:8625)、IL31RA(ID:133396)、ITPKC(ID:80271)、CFD(ID:1675)、TAP1(ID:6890)、IL7R(ID:3575)、IGLL1(ID:3543)、C2(ID:717)、TAP2(ID:6891)、CD3D(ID:915)、CD79A(ID:973)、C3(ID:718)、TAPBP(ID:6892)、CD3E(ID:916)、BLNK(ID:29760)、C4A(ID:720)、CD8A(ID:925)、FAS(ID:355)、LRRC8A(ID:56262)、C4B(ID:721)、CD247(ID:919)、RAG1(ID:5896)、BRWD3(ID:254065)、JAK3(ID:3718)、NCF1(ID:653361)、CHST11(ID:50515)、SLC35C1(ID:55343)、NCF2(ID:4688)、FSTL3(ID:10272)、FERMT3(ID:83706)、NCF4(ID:4689)、BCL2(ID:596)、CD40L(ID:959)、CYBA(ID:1535)、KLHDC8B(ID:200942)、WAS(ID:7454)、CYBB(ID:1536)、RARA(ID:5914)、TYK2(ID:7297)、PML(ID:5371)、RAG2(ID:5897)、PNP(ID:4860)、ELANE(ID:1991)、ROBLD3(ID:28956)、AIRE(ID:326)、GFI1(ID:2672)、MYD88(ID:4615)、BTG1(ID:694)、HAX1(ID:10456)、BCL3(ID:602)、IRAK4(ID:51135)、IKBKG(ID:8517)、TIRAP(ID:114609)、UNC93B1(ID:81622)、TLR3(ID:7098)、G6PC3(ID:92579)、CARD9(ID:64170)、CLEC7A(ID:64581)、IL17RA(ID:23765)、LBR(ID:3930)、IL17F(ID:112744)、CSF3R(ID:1441)、STAT1(ID:6772)、和CXCR4(ID:7852)基因序列，针对上述基因序列注释的外显子及外显子和内含子交界的区域设计18-40bp长度的引物序列；得到的扩增产物长度为125-175bp之间。得到说明书中所述序列组合物。
实施例2用于先天性免疫缺陷病基因筛查的试剂盒
本实施例所述试剂盒主要包括：2x引物组合物，5xPCR离子扩增mix(PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶等)，96孔板和96孔板封口膜。
所述试剂盒还包括如下成分(由Life technologies公司提供)：
Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16Kit(Cat.no.4471250)；
MyOneTM Streptavidin C1beads(Cat.no.IVGN65001)；
Ion PITM Template OT2 200Kit v3(Cat.no.4488318)；
Ion Library Quantitation Kit(Cat.no.4468802)。
实施例3用于先天性免疫缺陷病基因筛查的试剂盒的应用
1. 样本要求
要求DNA样品30ng以上。
2. DNA文库的构建
2.1 PCR扩增基因组DNA的目标区域
2.1.1 将每一个DNA和引物组合物混合，并5XPCR离子扩增mix(PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶等)和去离子水加入PCR 96孔板的每个反应孔内。如扩增20ul体系，5X PCR离子扩增mix加4ul，引物组合物加10ul，去离子水加5ul，DNA样本加10ng。
2.1.2 用96孔板封口膜密封PCR板，充分震荡，简单离心PCR板尽可能回收样本到管底部。然后置于PCR仪内，运行一下程序以扩增基因组上目标区域。
2.2 消化部分引物序列
2.2.1 轻度离心PCR板将反应后溶液收集到管底。慢慢揭掉96孔板的封膜。往每个混合反应液中加入2微升FuPa Reagent(Life technologies)，总体系达到22微升。
2.2.2 使用96孔板封口膜将96孔板封紧，充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)。
2.2.3 将96孔版放入PCR仪，按以下程序运行。
2.3 将接头连接至扩增产物并纯化
2.3.1 如果有可见的沉淀物在Switch(Life technologies)溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。
2.3.2 小心去除PCR板上的封膜并加入以下成分到每个反应孔内消化样本。在加入之前可先混合Switch溶液和接头。
2.3.3 在每个反应孔内加入2微升DNA连接酶。
2.3.4 使用96孔板封口膜将96孔板封紧，充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)。
2.3.5 将96孔版放入PCR仪，按以下程序运行。
2.4 纯化未扩增的文库
使用XP试剂1.5x样本体积。
2.4.1 小心地揭去封板膜并向每个文库中加入45微升(1.5x样本体积)的 XP试剂。用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。
2.4.2 将混合液置于室温5分钟。
2.4.3 将96孔板置于磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠。
2.4.4 向孔中加入150μL新鲜配制的70％乙醇，在磁力上来回移动96孔板来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠。
2.4.5 重复第4步，进行第二次洗涤。
2.4.6 确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。
2.4.7 将96孔板从磁力架上拿开，在每孔中加入50μL Low TE充分浸润磁珠。使用96孔板封口膜将96孔板封紧，充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)。
2.4.8 将96孔板置于磁力架上2分钟。上清液中含有文库。取出5μL上清，结合495μL无核酸水，用于文库定量。
2.5 文库定量和稀释
通过qPCR试剂盒Ion Library Quantitation Kit(Cat.no.4468802)来确定Ion Ampliseqlibrary的浓度。每个样本，标准文库和阴性对照必须在20微升反应体系内做两次技术重复。
外显子文库通常产量在100-500pM。
2.5.1 准备3个连续10倍稀释的E.coli DH10B标准文库(原始浓度68Pm,该文库来至于Ion Library Quantitation Kit)分别浓度为6.8pM，0.68pM，0.068pM。标记这些作为标准文库和在定量PCR仪器软件内记录这些浓度。
2.5.2 准备反应混合溶液。对每一个样本，对照和标准文库，都混合20微升2XMasterMix和2微升的20X IonAssay并混合均匀。分装11微升的混合液到每个PCR反应孔内。
2.5.3 加9微升的稀释100倍的Ion AmpliSeq 　library或9微升的每个已稀释好的标准文库到每个PCR反应孔内(每个样两个PCR孔做重复)。总反应体系20微升。
2.5.4 编辑定量PCR仪的反应程序如下：
输入已稀释好的标准文库的浓度；
ROXTM参考荧光作为背景参考荧光；
选择反应体系20微升；
TaqMan探针报告子和淬灭子：FAM dye/MGB
Ion Library TaqMan qPCR Mix能被应用在多种定量PCR仪器上。下表的循环程序可作为应用该试剂盒的通用守则。快速循环模式是StepOnePlusTM系统的推荐模式。
2.5.5 qPCR反应结束后，计算未稀释过的Ion AmpliSeq　 library的平均浓度通过将qPCR的定量结果乘以100的稀释倍数。
2.5.6 基于以上计算的文库浓度，确认稀释倍数将文库稀释到100pM。
例如：
未稀释的文库浓度时300pM，那library的稀释因子应该是300pM/100pM＝3。
因此，1微升的文库混合2微升的Low TE(1比3稀释)得到100pM。
2.5.7 稀释文库到100pM后，接下来进行多个文库混合或模板制备。
2.6 储存文库
文库可以被保存在48℃最多一个月，也可以在20℃条件下储存更长的时间。
构建好的文库进行二代测序。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.用于原发性免疫缺陷病基因筛查的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括分别针对基因CD79B、BTK、C5、IRAK4、TNFRSF13B、C6、IL1RN、STAT3、C7、IL2RA、CD40LG、SERPING1、MASP1、IL2RG、AICDA、CFP、MASP2、CD40、CFH、RFXAP、UNG、CFI、RFX5、OSMR、ICOS、CFB、RFXANK、IL31RA、CFD、TAP1、IL7R、IGLL1、C2、TAP2、CD3D、CD79A、C3、TAPBP、CD3E、BLNK、C4A、CD8A、FAS、LRRC8A、C4B、CD247、RAG1、BRWD3、NCF1、CHST11、SLC35C1、NCF2、FSTL3、FERMT3、NCF4、BCL2、CD40L、CYBA、KLHDC8B、WAS、CYBB、RARA、TYK2、PML、RAG2、PNP、ELANE、ROBLD3、AIRE、GFI1、MYD88、BTG1、HAX1、BCL3、IRAK4、IKBKG、TIRAP、UNC93B1、TLR3、G6PC3、CARD9、CLEC7A、IL17RA、LBR、IL17F、CSF3R、STAT1、CXCR4、ITPKC和JAK3的非重复区域的多个引物序列。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物具体包括如下引物序列：
1)CD79B
2)BTK
3)C5
4)IRAK4
5)TNFRSF13B
6)C6
7)IL1RN
8)STAT3
9)C7
10)IL2RA
11)CD40LG
12)SERPING1
13)MASP1
14)IL2RG
15)AICDA
16)CFP
17)MASP2
18)CD40
19)CFH
20)RFXAP
21)UNG
22)CFI
23)RFX5
24)OSMR
25)ICOS
26)CFB
27)RFXANK
28)IL31RA
29)ITPKC
30)CFD
31)TAP1
32)IL7R
33)IGLL1
34)C2
35)TAP2
36)CD3D
37)CD79A
38)C3
39)TAPBP
40)CD3E
41)BLNK
42)C4A
43)CD8A
44)FAS
45)LRRC8A
46)C4B
47)CD247
48)RAG1
49)BRWD3
50)JAK3
51)NCF1
52)CHST11
53)SLC35C1
54)NCF2
55)FSTL3
56)FERMT3
57)NCF4
58)BCL2
59)CD40L
60)CYBA
61)KLHDC8B
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63)CYBB
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66)PML
67)RAG2
68)PNP
69)ELANE
70)ROBLD3
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72)GFI1
73)MYD88
74)BTG1
75)HAX1
76)BCL3
77)IRAK4
78)IKBKG
79)TIRAP
80)UNC93B1
81)TLR3
82)G6PC3
83)CARD9
84)CLEC7A
85)IL17RA
86)LBR
87)IL17F
88)CSF3R
89)STAT1
90)CXCR4
3.用于原发性免疫缺陷病基因筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：5xPCR离子扩增mix、96孔板和96孔板封口膜。
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