CN112166118A - 治疗自身免疫性疾病和癌症的可溶性白介素-7受体(sIL7R)调节疗法 - Google Patents
治疗自身免疫性疾病和癌症的可溶性白介素-7受体(sIL7R)调节疗法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明包括用于治疗有相应需要的受试者的自身免疫性疾病或癌症的组合物和方法，所述方法包括：施用有效量的包含寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸特异性结合影响外显子6剪接的白介素‑7受体(IL7R)前mRNA的互补序列，其中SM‑ASO增加或减少IL7R前mRNA中外显子6的包含，并分别减少或增加IL7R的可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM‑ASO)。
Description
相关申请的交叉引用
无。
联邦赞助研究的声明
本发明根据由NIH授予的F32-NS087899在美国政府支持下进行。美国政府具有本发明中的某些权利。
发明的技术领域
本发明总体上涉及分别减少或增加可溶性IL7R(sIL7R)以治疗自身免疫性疾病(例如，多发性硬化)或癌症的新疗法领域。
发明背景
在不限制本发明范围的情况下，结合多发性硬化作为实例描述本发明的背景。
多发性硬化(MS)是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是自反应性免疫细胞介导的中枢神经系统(CNS)中神经元髓鞘的损伤，导致轴突脱髓鞘、神经元死亡和进行性神经功能障碍。迄今为止，这种疾病还没有治愈的方法，并且现有的治疗方法只能减缓疾病的发展，通常是通过全局地抑制免疫系统，导致大量可能严重或致命的不利副作用。这种全局性的免疫抑制是现有疗法的主要局限。
导致MS的免疫耐受破坏被认为是由环境和遗传因素之间的复杂相互作用引起的。根据这种观点，个体的遗传背景可以产生允许自身反应性淋巴细胞存活的环境，该环境随后可以通过环境触发物(通常以病毒或细菌感染的形式)的存在而被激活。
本发明人和其他人以前已经表明，白介素-7受体(IL7R)基因外显子6内的变体rs6897932(C/T，其中C是风险等位基因)与MS风险增加密切相关(Gregory等人,2007；International Multiple Sclerosis Genetics等人,2007；Lundmark等人,2007)。此外，本发明人表明，这种变体的风险'C'等位基因增加了该外显子的跳过(Evsyukova等人,2013；Gregory等人,2007)，导致sIL7R的上调(Hoe等人,2010；Lundstrom等人,2013)。重要的是，已经显示sIL7R在MS的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中会加剧疾病的临床进展和严重程度，推测是通过增强IL7细胞因子的生物利用度和/或生物活性(Lundstrom等人,2013)。进一步支持sIL7R在多发性硬化发病机制中的作用，以及可能在一般自身免疫中的作用，已报道在多发性硬化(McKay等人.2008)、类风湿性关节炎(Badot等人,2011)、1型糖尿病(Monti等人,2013)和系统性红斑狼疮(Lauwerys等人,2014)患者中sIL7R蛋白或RNA水平升高。总的来说，这些数据将高水平的sIL7R与MS和自身免疫的发病机制联系起来，并将IL7R外显子6的选择性剪接(alternative splicing)定位为MS和自身免疫的新治疗靶点。
虽然这些参考文献教导了sIL7R的存在与多发性硬化相关，并且动物研究表明，sIL7R加剧了MS样状况，但是仍然需要通过靶向sIL7R的产生来治疗自身免疫性疾病诸如MS的新组合物和方法。
自身免疫性疾病存在许多不同的病因，并且其中每一种可以成为精确或个性化治疗的靶点。在本发明中，本发明人解决了一种由sIL7R水平升高引起的这样的病因学，其可能影响多达60％的MS患者和大量患有由sIL7R升高引起的其他自身免疫性疾病的患者。
免疫肿瘤学是一个迅速发展的领域，对迄今为止难以治愈的癌症患者有很大的希望；然而，免疫疗法的强大作用受到某些癌症和个体中非常低的响应率的限制。
反义寡核苷酸疗法用与靶序列互补的短寡核苷酸靶向引起特定疾病的特定基因的遗传序列。通常，设计成与靶序列的信使RNA(mRNA)或前mRNA结合的一条核酸链(DNA、RNA或化学类似物)。在剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)的情况下，设计结合前mRNA中改变所得mRNA的外显子含量的特定序列的互补核酸。反义寡核苷酸已被用于靶向疾病，诸如癌症、糖尿病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、杜氏肌营养不良症、脊髓性肌萎缩、共济失调-毛细血管扩张症、哮喘和关节炎。美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了几种反义寡核苷酸药物，用于治疗巨细胞病毒视网膜炎、纯合家族性高胆固醇血症、杜氏肌营养不良症和脊髓性肌萎缩，仅举几个实例，后两种是SM-ASO。然而，在每种情况下，必须对所讨论疾病潜在的特定病因定制寡核苷酸靶序列。
发明概述
在一种实施方案中，本发明包括治疗有相应需要的受试者的白介素7受体的可溶性同种型(sIL7R)水平升高的疾病或状况的方法，该方法包括：施用有效量的组合物，所述组合物包含特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而增强IL7R前mRNA中外显子6的包含，并减少sIL7R的表达。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的组合。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。在另一方面，寡核苷酸特异性结合选自表1中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQID NO:1-13)或其部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。在另一方面，寡核苷酸完全或部分地靶向表1中的任何SEQ ID(SEQ ID NO:1-13)。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。在另一方面，疾病或状况是选自以下中的至少一种的自身免疫性疾病：多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化或炎性肠综合征诸如溃疡性结肠炎、克罗恩病或其中与没有疾病或状况的正常受试者相比sIL7R升高的任何其他状况。在另一方面，疾病或状况是炎性疾病或状况。在另一方面，寡核苷酸通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的降解，例如，用减少sIL7R RNA稳定性(例如，增加降解)的ASO、siRNA、shRNA和/或减少sIL7R RNA翻译的ASO。在另一方面，该方法还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗自身免疫性疾病的活性剂的联合治疗，所述活性剂诸如但不限于米托蒽醌、干扰素β-1a、PEG-干扰素β-1a、硫唑嘌呤、芬戈莫德、那他珠单抗、甲基强的松龙或奥瑞珠单抗(ocrelizumab)。在另一方面，该方法还包括从患者获得细胞并修饰细胞以瞬时或永久表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的步骤。在另一方面，该方法还包括产生表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的载体，用于基因治疗，并用该载体治疗患者。
在另一种实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸是特异性结合白介素7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一方面，组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而增强IL7R前mRNA中外显子6的包含，并减少sIL7R的表达。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。在另一方面，寡核苷酸特异性结合选自表1中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQ ID NO:1-13)或其部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。在另一方面，寡核苷酸完全或部分地靶向表1中的任何SEQID(SEQ ID NO:1-13)。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。在另一方面，组合物适于施用以治疗选自以下至少一种的自身免疫性疾病：多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠综合征诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病或其中sIL7R升高的任何其他状况。在另一方面，寡核苷酸通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的降解，例如，用减少sIL7R RNA稳定性(例如，增加降解)的ASO、siRNA、shRNA和/或减少sIL7RRNA翻译的ASO。
在又另一种实施方案中，本发明包括一种增加白介素-7受体(IL7R)前mRNA的外显子6的包含的方法，该方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，组合物中的SM-ASO在由外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而增强IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少sIL7R的表达。在另一方面，组合物中的SM-ASO在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。在另一方面，SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架、诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。在另一方面，SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。在另一方面，SM-ASO通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的降解，例如，用减少sIL7R RNA稳定性(例如，增加降解)的ASO、siRNA、shRNA和/或减少sIL7RRNA翻译的ASO。在另一方面，SM-ASO阻断缺乏外显子6的IL7R mRNA的翻译。在另一方面，SM-ASO特异性结合选自表1中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQ ID NO:1-13)或其部分，或所述SM-ASO的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。在另一方面，寡核苷酸完全或部分地靶向表1中的任何SEQ ID(SEQ ID NO:1-13)。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。在另一方面，自身免疫性疾病选自以下中的至少一种：多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠综合征诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病、或其中sIL7R升高的任何状况。在另一方面，该方法还包括从患者获得细胞并修饰细胞以瞬时或永久表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的步骤。在另一方面，该方法还包括产生表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的载体，用于基因治疗，并用该载体治疗患者。
在另一种实施方案中，本发明包括一种用于增加白介素-7受体(IL7R)前mRNA中外显子6的包含的组合物，该方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，该组合物还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗自身免疫性疾病的活性剂的联合治疗，所述活性剂选自但不限于米托蒽醌、干扰素β-1a、PEG-干扰素β-1a、硫唑嘌呤、芬戈莫德、那他珠单抗、甲基强的松龙或奥瑞珠单抗。
在另一种实施方案中，本发明包括表达包含寡核苷酸的核酸的载体，所述寡核苷酸是特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，载体是病毒载体或质粒。
在另一种实施方案中，本发明包括表达核酸的载体，所述核酸包含反义寡核苷酸(ASO)、剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)、翻译阻断反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或miRNA，其特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中增强缺乏外显子6的IL7R RNA的抑制或降解的序列，其中所述核酸减少IL7R的可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，载体是病毒载体或质粒。
在另一种实施方案中，本发明包括治疗有相应需要的受试者的多发性硬化的方法，该方法包括：施用有效量的组合物，该组合物在药学上可接受的赋形剂中包含特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R的可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，该方法还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗多发性硬化疾病的活性剂的联合治疗。在另一方面，用于治疗多发性硬化的一种或更多种剂选自但不限于米托蒽醌、干扰素β-1a、PEG-干扰素β-1a、硫唑嘌呤、芬戈莫德、那他珠单抗、甲基强的松龙或奥瑞珠单抗。
在另一种实施方案中，本发明包括治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：施用有效量的组合物，该组合物包含特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸，其中该寡核苷酸减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R的可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接增强子(ESE)和/或内含子剪接增强子(ISE)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而减少外显子6的包含，并增加sIL7R的表达。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架、诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的组合。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。在另一方面，寡核苷酸特异性结合选自表2中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQ ID NO:14-50)或其部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7RRNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。在另一方面，寡核苷酸靶向表2中的任何SEQ ID(SEQ ID NO:14-50)或其部分。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。在另一方面，癌症对常规免疫疗法表现出低响应(例如肝细胞癌)。在另一方面，该方法还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗癌症的活性剂的联合治疗，所述活性剂诸如但不限于免疫检查点抑制剂(例如，纳武单抗)、治疗性抗体(例如，赫赛汀)、常规化疗(例如，紫杉醇)或治疗性放射。在另一方面，该方法还包括从患者获得细胞并修饰细胞以瞬时或永久表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的步骤。在另一方面，该方法还包括产生表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的载体，用于基因治疗，并用该载体治疗患者。
在另一种实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸是特异性结合白介素7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接增强子(ESE)和/或内含子剪接增强子(ISE)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而减少外显子6的包含，并增加sIL7R的表达。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。在另一方面，寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。在另一方面，寡核苷酸特异性结合选自表2中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQ ID NO:14-50)或其部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。在另一方面，寡核苷酸完全或部分地靶向表2中的任何SEQ ID(SEQ IDNO:14-50)。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。在另一方面，该组合物适用于施用以治疗癌症。
在又另一种实施方案中，本发明包括一种减少白介素-7受体(IL7R)前mRNA中外显子6的包含的方法，该方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在另一方面，组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接增强子(ESE)和/或内含子剪接增强子(ISE)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而减少外显子6的包含，并增加sIL7R的表达。在另一方面，组合物中的SM-ASO在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。在另一方面，SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。在另一方面，SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。在另一方面，SM-ASO通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的稳定性。在另一方面，SM-ASO增强缺乏外显子6的IL7R mRNA的翻译。在另一方面，SM-ASO特异性结合选自表2中的单独或组合的任何靶SEQ ID或其部分，或所述SM-ASO的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。在另一方面，寡核苷酸完全或部分地靶向表2中的任何SEQ ID。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。在另一方面，疾病是一种癌症。在另一方面，该方法还包括从患者获得细胞并修饰细胞以瞬时或永久表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的步骤。在另一方面，该方法还包括产生表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的载体，用于基因治疗，并用该载体治疗患者。
在另一种实施方案中，本发明包括一种用于增加白介素-7受体(IL7R)前mRNA中外显子6的包含的组合物，该方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，该组合物还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗癌症的活性剂的联合治疗，所述活性剂诸如但不限于免疫检查点抑制剂(例如，纳武单抗)、治疗性抗体(例如，赫赛汀)、常规化疗(例如，紫杉醇)或治疗性放射。
在另一种实施方案中，本发明包括一种载体，所述载体表达包含寡核苷酸的核酸，所述寡核苷酸是特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含，并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。在一个方面，载体是病毒载体或质粒。
附图简述
为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，在附图中：
图1A至图1C显示了用于筛选剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)的GFP-IL7R荧光剪接报告物的验证。
图2A至图2E显示了与外显子6中的序列互补的IL7R剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)的靶向筛选。
图3A至图3E显示了IL7R内含子5和6中的SM-ASO步移筛选靶向序列。
图4A至图4D显示了所选的SM-ASO对IL7R蛋白同种型表达的影响。
图5A至图5D显示了减少sIL7R的主要SM-ASO对IL7R外显子6剪接的调节的剂量响应性效应。
图6A至图6D显示了增加sIL7R的主要SM-ASO对IL7R外显子6剪接的调节的剂量响应性效应。
图7A至图7B显示了IL7R-005对增加MS中IL7R外显子6的排除和sIL7R水平的遗传异常效应的校正。
发明详述
尽管在下文详细讨论了制作和使用本发明的各种实施方案，但是应当理解，本发明提供了可以在各种具体背景中实现的许多可应用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅仅是制造和使用本发明的具体方式的说明，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，以下定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明的相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”的术语并不旨在仅指单个实体，而是包括可以被用于说明的特定实例的一般类别。本文中的术语被用于描述本发明的具体实施方案，但是除了权利要求中所概述的以外，其用法不限制本发明的范围。
本发明涉及分别减少或增加可溶性IL7R(sIL7R)以治疗自身免疫性疾病(例如多发性硬化)或癌症的新组合物和方法。本发明使用SM-ASO来控制白介素7受体(IL7R)前mRNA的选择性剪接，以防止或减少sIL7R的表达或相反增加sIL7R的表达。例如，鉴于sIL7R增强自身反应性的能力，本文展示，增加sIL7R水平可增强对目前采用的免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂)的响应。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学、有机合成、核酸化学和核酸杂交中的实验程序是本领域中熟知的并且普遍地采用的那些。此外，标准技术可用于核酸和肽的合成。这样的技术和程序通常根据本领域已知的常规方法和各种一般参考文献(例如，Sambrook和Russell,2012,MolecularCloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，以及Ausubel等人,2012,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)进行，相关部分通过引用并入本文。
本文使用常规符号来描述多核苷酸序列，例如，单链多核苷酸序列的左手端是5'端，并且对于3'端(右手端)反之亦然；对于序列，例如成为编码序列的序列，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'-方向，并且对于3'-方向(右手方向)反之亦然。核苷酸向新生RNA转录物的5'至3'添加的方向被称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链被称为“编码链”。DNA或RNA链上位于距离DNA或RNA上参考点5'的序列被称为“上游序列”，并且DNA或RNA链上位于距离DNA或RNA上参考点3'的序列被称为“下游序列”。
如本文所用，术语“反义”是指具有通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以与靶序列(通常与mRNA或前mRNA)形成RNA:寡核苷酸异源双链体的序列的寡核苷酸。反义寡核苷酸可以与靶序列具有精确的序列互补性或接近互补性。这些反义寡核苷酸可以阻断或抑制mRNA的翻译，改变mRNA的加工以产生mRNA的剪接变体，和/或促进给定mRNA或mRNA变体的特异性降解。一个非限制性实例也可以是RNA酶H依赖性降解。反义序列不必只与RNA分子的编码部分互补。反义序列可以与编码蛋白质的RNA分子的非编码区(例如内含子、非翻译区)上指定的调节序列互补，该调节序列控制编码序列的表达。反义寡核苷酸的长度通常在约5至约100个核苷酸之间，更典型地，长度在约7和约50个核苷酸之间，并且甚至更典型地，长度在约10个核苷酸和约30个核苷酸之间。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”是指任何单链或双链的DNA或RNA分子，无论是线性还是环状的。关于本发明的核酸，当应用于DNA或RNA时，术语“分离的核酸”是指与在DNA或RNA分子来源的生物体的天然存在的基因组或基因产物中与其紧邻的序列分离的DNA或RNA分子。例如，“分离的核酸”可以包含插入到载体诸如质粒或病毒载体中，或者整合到原核或真核细胞或宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。
如本文所用，术语“特异性地杂交”或“基本上互补”是指具有足够互补性以允许在本领域通常使用的预定条件下杂交的两个核苷酸分子之间的关联。低、中或中等和高严格性杂交条件的实例是技术人员熟知的，例如使用Sambrook和Russell,2012,MolecularCloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，或Ausubel等人,2012,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY，相关部分通过引用并入本文。
如本文所用，短语“化学修饰的寡核苷酸”是指短核酸(DNA或RNA)，其可以是有义或反义的，包括修饰或取代，诸如由Wan和Seth,“The Medicinal Chemistry ofTherapeutic Oligonucleotides”,J.Med.Chem.2016,59,21,9645-9667教导的那些，相关部分并入其中，其可包括以下修饰：(1)核糖或其他糖单元\(2)碱基或(3)骨架，其本质上包括磷酸酯，如本领域已知的。修饰或核苷酸类似物的非限制性实例包括但不限于具有磷酸酯修饰的核苷酸，其包含一个或更多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代(参见，例如，Hunziker和Leumann(1995)Nucleic Acid Analogues:Synthesis andProperties,in Modem Synthetic Methods,VCH,331-417；Mesmaeker等人.1994)NovelBackbone Replacements for Oligonucleotides,in Carbohydrate Modifications inAntisense Research,ACS,24-39)；具有修饰糖的核苷酸(参见，例如，美国专利申请公布第2005/0118605号)和糖修饰，诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)和2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分或双环糖部分，以及核苷酸模拟物，诸如但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)、以及部分或完全地修饰的骨架，诸如完全修饰的糖磷酸酯骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架，以及上述任意两种或更多种的组合(参见例如美国专利第5,886,165；6,140,482；5,693,773；5,856,462；5,973,136；5,929,226；6,194,598；6,172,209；6,175,004；6,166,197；6,166,188；6,160,152；6,160,109；6,153,737；6,147,200；6,146,829；6,127,533和6,124,445号，相关部分通过引用并入本文)。
如本文所用，术语“表达盒”是指包含可操作地连接到编码序列的转录、加工和任选地翻译或剪接必需的启动子/调节序列的编码序列的核酸分子。
减少sIL7R的IL7R SM-ASO可用于治疗疾病或病症，诸如自身免疫性和/或炎性疾病。增加sIL7R的IL7R SM-ASO可用于免疫肿瘤学应用。无论是增加还是减少sIL7R信使或蛋白质的表达，本发明都可以与基因治疗和离体应用结合使用。例如，寡核苷酸可用于这样的方法中：其中从受试者或另一受试者分离细胞，并且修饰细胞以表达修饰sIL7R表达的寡核苷酸，并且然后细胞可被转移回受试者。本发明可与多种已知的递送和表达方法，诸如质粒或病毒载体一起使用。此外，本发明可与细胞修饰的所有方法一起使用，例如基因编辑、核酸(任何核酸，天然的、合成的或修饰的)、蛋白质(全长蛋白质或肽)的递送，无论是瞬时的还是永久的，或在可调节启动子的控制下。寡核苷酸或表达该寡核苷酸的载体可以通过已知方法递送，诸如转染、电穿孔、载体介导、病毒等。
如本文所用，术语“启动子/调节序列”是指基因产物的表达所需的、可操作地连接到启动子/调节序列的核酸序列。在一些情况下，启动子/调节序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组成型和/或诱导型方式驱动基因产物表达的序列。如本文所用，术语“诱导型启动子”是指当与编码或指定(specifies)基因产物的多核苷酸可操作地连接时，仅当对应于该启动子的诱导物存在时，才导致基因产物显著产生的核苷酸序列。
如本文所用，术语“相似性百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”，当指两个特定序列之间的比较时，指沿着特定序列相同的百分比或碱基。相似性、同一性或同源性的百分比可以使用例如University of Wisconsin GCG软件程序或等同物来计算。
如本文所用，术语“复制子”是指任何遗传元件，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒，其能够在其自身控制下大量复制。复制子可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链的。
如本文所用，术语“载体”是指遗传元件，诸如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒，其上可附接另一种遗传序列或元件(DNA或RNA)。载体可以是复制子，从而导致所附接的序列或元件的复制。“表达载体”是促进核酸诸如寡核苷酸或编码多肽的核酸序列在宿主细胞或生物体中表达的载体。
如本文所用，术语“可操作地连接的”是指与另一个核酸序列放置成功能关系的核酸序列。可被可操作地连接的核酸序列的实例包括但不限于启动子、转录终止子、增强子或激活子以及异源基因，当被转录时，并且如果合适的话，异源基因被翻译后将产生功能性产物，诸如蛋白质、核酶或RNA分子。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指单链或双链的核酸链，其长度通常小于基因的编码序列，例如，寡核苷酸的长度通常为至少4-6个碱基或碱基对，并且最多约200个，最典型的寡核苷酸在8-20个、10-25个、12-30个碱基或碱基对的范围内或约30个、35个、40个或50个碱基或碱基对。在本发明的一个具体实例中，寡核苷酸是具有调节白介素-7受体(IL7R)基因的前mRNA中外显子6的包含的序列的核酸链，并且被定义为包括两个或更多个、优选地多于四个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的核酸分子。寡核苷酸的确切大小将取决于多种因素和寡核苷酸的具体应用和用途，其可被改变，如本领域技术人员根据本文的教导以及以下中教导的无需过度实验已知的：例如Sambrook和Russell,2012,MolecularCloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，或Ausubel等人,2012,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY，相关部分通过引用并入本文。
如本文所用，术语“mRNA的剪接变体或同种型”是指变体mRNA，其可能是有缺陷的或致病的，并且是编码蛋白质的RNA的选择性剪接的结果。产生有缺陷或导致病理的mRNA剪接变体的剪接事件在本发明中称为剪接缺陷。这种剪接缺陷的一个实例是IL7R的外显子6的排除，导致从细胞分泌的较短的可溶性蛋白质IL7R(sIL7R)的表达，导致其存在于例如血流或其他体液中。本发明针对IL7R前mRNA中控制IL7R外显子6在最终成熟或加工的mRNA中的包含或排除的元件(即序列)，或sIL7R mRNA中控制其翻译或稳定性的序列。
如本文所用，术语“蛋白质的剪接变体或同种型”是指变体蛋白质，其可能是有缺陷的或致病的，并且是编码蛋白质的RNA的选择性剪接的结果。可选地，当讨论那些增加降解的变体时，那些剪接变体会减少或消除蛋白质的产生。产生有缺陷或导致病理的蛋白质剪接变体的剪接事件在本发明中称为剪接缺陷。这种剪接缺陷的一个实例是IL7R的外显子6的排除，导致从细胞分泌的较短的可溶性蛋白质IL7R(sIL7R)的表达，导致其存在于例如血流或其他体液中。本发明针对IL7R前mRNA中控制IL7R外显子6在最终成熟或加工的mRNA中的包含或排除的元件(即序列)，或sIL7R mRNA中控制其翻译或稳定性的序列。
如本文所用，术语“治疗”是指逆转、减轻、延迟疾病或病症或其一种或更多种症状的发作、抑制其进展和/或防止疾病或病症，该术语适用于受试者，例如自身免疫性疾病或病症。在一些实施方案中，治疗可以在一种或更多种症状已经发展之后施加。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状出现之前(例如，鉴于症状的病史和/或一个或更多个其他易感性因素)或在症状消失之后施用治疗，例如以防止或延迟其复发。一个这样的非限制性实例是复发-缓解MS。
如本文所用，术语“有效量”和“药物有效量”是指足以提供所需生物学结果的剂的量。优选地，足量的剂不会引起毒副作用。本发明使用减少sIL7R的IL7R SM-ASO将导致自身免疫性疾病或病症的体征、症状或原因的减少和/或缓解。如所设计的，预计本发明不会引起宿主免疫应答的减少，并且因此具有很少或很低的与广泛免疫抑制相关的副作用。在任何个例中，适当的有效量可由本领域中普通技术人员之一使用例行实验确定。本发明使用增加sIL7R的IL7R SM-ASO将导致癌症的体征、症状或原因的减少和/或缓解。如所设计的，预计本发明引起宿主免疫应答的增强，并且从而增强当前的免疫疗法。在任何个例中，适当的有效量可由本领域中普通技术人员之一使用例行实验确定。
本发明可以联合一种或更多种“药学上可接受的”剂、载体、缓冲剂、盐或美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于动物，更具体地用于人类的其他试剂一起提供，其通常表示由联邦政府或州政府的监管机构批准。与寡核苷酸一起使用的典型药学上可接受的制剂包括但不限于盐，诸如：氯化钙二水合物(美国药典(USP))、氯化镁六水合物USP、氯化钾USP、氯化钠USP；并且可以包括缓冲剂，诸如“磷酸氢二钠无水USP、磷酸二氢钠二水合物USP和水USP。通常，产品的pH可使用盐酸或氢氧化钠调节至pH为～6.8、6.9、7.0、7.1或7.2。
本发明可以与一种或更多种用于展示治疗有效性的诊断测试结合提供。
如本文所用，术语“载体”是指与本发明的活性剂一起施用的例如稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂、赋形剂、辅助剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液(aqueous saline solutions)以及右旋糖和甘油水溶液(aqueous dextrose andglycerol solutions)可用作载体。合适的药物载体在“Remington's PharmaceuticalSciences”2012中描述。
在一种实施方案中，本发明涉及治疗自身免疫性疾病，包括但不限于多发性硬化(MS)的新组合物和方法。MS是成年早期最常见的神经疾病，并且由自身免疫机制介导，导致中枢神经系统脱髓鞘和神经元损伤，导致进行性神经功能障碍。迄今为止，这种疾病还没有治愈的方法，并且目前可用的治疗主要是通常通过抑制免疫系统来预防未来的免疫攻击。这种免疫抑制方法会导致过多的不利副作用，其中有增加癌症和感染的风险，这些风险可能是严重的或致命的。因此，本发明人开发了新的治疗方法，以满足对开发有效且耐受性良好的治疗的明确的、未满足的需求，以阻止MS的发展，而没有不利的免疫抑制副作用。
本发明还涉及治疗癌症的新组合物和方法。癌症是美国的第二大死因，并且由多种病因介导。迄今为止，许多癌症无法治疗；然而，最近基于免疫识别和杀伤癌细胞的疗法带来了新的希望。不幸的是，许多接受免疫治疗的患者响应不佳，并且一些癌症类型(例如肝细胞癌)的响应率较低。因此，本发明人开发了新的疗法，以满足增强常规免疫疗法的明确的、未满足的需求。
本发明人已经开发了靶向反义寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸(ASO)和/或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，以纠正特定的MS病因。SM-ASO已被证明是治疗由异常RNA剪接引起的疾病的一种新的和有价值的治疗工具。两种这样的SM-ASO最近获得了FDA的批准，用于治疗脊髓性肌萎缩症(Spinraza,Biogen)和杜兴肌营养不良症(Exondys 51,SareptaTherapeutics)。
新的靶向治疗纠正了白介素7受体(IL7R)RNA的异常剪接，其中可选外显子6的排除导致IL7R的致病可溶性形式(sIL7R)的水平升高。多种证据直接关联并强烈支持IL7R外显子6的选择性剪接在MS和其他自身免疫性疾病发病机制中的作用：(1)增加该外显子排除的遗传变体与MS风险增加密切相关(Galarza-Munoz等人,2017；Gregory等人,2007)；(2)sIL7R加重了实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠MS模型中疾病的严重程度和进展(Lundstrom等人,2013)；(3)在患有多种自身免疫性疾病(包括MS、I型糖尿病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)的患者中，sIL7R升高(Badot等人,2011；Badot等人,2013；Lauwerys等人,2014；McKay等人,2008；Monti等人,2013)。
本发明人已经开发了几种SM-ASO(表1)，其中主要的ASO是IL7R-005和IL7R-006，它们促进IL7R前mRNA中外显子6的包含和IL7R蛋白同种型在培养细胞中的正确表达。对这种治疗方法至关重要的是，这些SM-ASO减少sIL7R水平，而对膜结合IL7R(mIL7R)的表达没有负面影响。为了治疗自身免疫，本发明用于阻断IL7R前mRNA中驱动外显子6排除的特定序列，从而促进外显子6包含并减少sIL7R水平。此外，为了治疗癌症，本发明用于阻断IL7R前mRNA中驱动外显子6包含的特定序列，从而减少外显子6包含并增加sIL7R水平。本领域技术人员将认识到，本发明的SM-ASO可以单独使用或与其他疗法结合使用。此外，通过简单的单碱基突变，SM-ASO可以适用于控制人类IL7R或不同动物中IL7R的等位基因变体中，或携带多态性或在靶向序列处发生突变的个体中外显子6的剪接，从而定制SM-ASO与变体序列的互补性。
*以粗体和下划线突出显示的核苷酸表示在SM-ASO中的互补位置被工程化以破坏可能限制SM-ASO活性的潜在二级结构的错配的位置。
＾功效等级：低(+)、中(++)和高(+++)。
本发明可以使用各种各样的SM-ASO，例如包含对SM-ASO的各种各样的碱基或骨架修饰的那些。SM-ASO的非限制性实例可以包括天然核酸，但也可以包括例如骨架或碱基修饰(化学修饰的寡核苷酸)，其增加SM-ASO的结合效率，增加SM-ASO的稳定性(例如半衰期)，增加其表达，控制其表达、分布或定位的位置等。
目前对自身免疫性疾病诸如MS的治疗有助于自身免疫性疾病患者控制其症状，但这些药物远非理想，因为它们会引起可能是严重的或致命的各种各样的不利副作用。疾病的复杂性质阻碍了有效但更安全的MS药物的开发，其中多种病因导致MS的发病机制。鉴于所有这些病因最终导致对髓鞘免疫耐受的破坏，迄今为止，该领域一直致力于开发通过多种机制减少免疫反应的疗法。例如，那他珠单抗被设计用来阻断白细胞穿过血脑屏障的迁移和它们在炎症部位的募集。另一个实例是奥瑞珠单抗，它耗尽B细胞。然而，这两种机制(尽管通过不同的作用)最终导致免疫抑制。为了向患者提供有效但更安全的药物，而不是通过免疫调节来处理给定病因的后果，必须开发针对特定MS病因的校正的新疗法，本发明人在本文将其称为免疫校正(immune correction)。
典型的膜结合白介素7受体(mIL7R)是MS和许多自身免疫性疾病治疗干预的先前候选物。然而，mIL7R对T细胞稳态和正常免疫功能至关重要，并且人类和小鼠IL7R功能的丧失都会导致严重的免疫缺陷(Maraskovsky等人,1996；Peschon等人,1994；Puel等人,1998；Roifman等人,2000)。因此，抑制mIL7R表达或功能的新MS疗法将导致严重的免疫缺陷。这里开发的治疗性SM-ASO纠正了IL7R外显子6的异常剪接，并且这样做，它们减少了sIL7R水平，同时防止了对mIL7R表达和/或功能的负面影响。因此，不同于依赖免疫抑制机制的现有MS治疗，本发明的减少sIL7R的治疗性SM-ASO(表1)是避免免疫抑制的治疗MS的有效且更安全的选择。本发明的减少sIL7R的SM-ASO(表1)代表了对现有药物的重大改进，因为它们纠正了问题的根源，而不是通过抑制免疫系统来处理其后果。
此外，sIL7R水平的增加(与没有自身免疫性疾病的受试者中sIL7R的正常水平相比)与其他自身免疫性疾病诸如I型糖尿病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮有关，并且这些疾病的患者已被显示具有升高的循环sIL7R水平(Badot等人,2011；Badot等人,2013；Lauwerys等人,2014；Monti等人,2013)。因此，治疗性SM-ASO可用于治疗具有sIL7R水平升高的许多疾病或病症。
癌症是美国第二大死亡原因。许多癌症缺乏有效的治疗选择，因为有许多病因在起作用。免疫肿瘤学是一个快速发展的领域，它利用人体免疫系统作为以前难治的癌症的新疗法。免疫检查点抑制剂，诸如靶向负性免疫调节剂CTLA-4(Ipilimumab(Yervoy,Bristol-Myers Squibb)和PD-l(Pembrolizumab(Keytruda,Merck)的单克隆抗体和纳武单抗(Opdivo,Bristol-Myers Squibb)，得到FDA批准。它们的潜力的一个实例是对患有以前未治疗的黑色素瘤和不能手术的黑色素瘤或转移性黑色素瘤的患者的研究，对这些患者用纳武单抗和Ipilimumab治疗，报告的总响应率为50％(Larkin J,Chiarion-Sileni V,Gonzalez R,Grob JJ,Cowey CL,等人.2015.N Engl J Med 373:23-34)。
虽然最近的癌症免疫疗法提供了新的希望，不幸的是，许多接受免疫治疗的患者响应不佳，并且一些癌症类型(例如肝细胞癌)的响应率较低。例如，虽然纳武单抗经FDA批准用于对激酶抑制剂索拉非尼无反应的肝细胞癌患者，但154名受试患者的总响应率仅为14.3％，并且在仅3名患者中观察到完全响应(NCT01658878)。尽管令人鼓舞，但这些数据表明，迫切需要提高响应率。
提高免疫治疗响应率的需要激发了对标志物(例如，PD-L1表达和肿瘤细胞中的高度微卫星不稳定性)的深入研究，这些标志物预测当前部署的免疫检查点阻断剂的成功。同样令人兴奋的是(尽管开发较少)对能够与检查点阻断协同作用的促免疫调节剂的研究。sIL7R水平升高被认为通过增强细胞因子IL7的生物利用度和/或生物活性增强免疫反应，从而提高T细胞的存活率(Lundstrom等人,2013)。这创造了一个促炎性环境，有可能增加对癌症的免疫应答。因此，本发明使用增加sIL7R的SM-ASO，诸如主要的SM-ASO IL7R-001和IL7R-004、以及表2中的另外的SM-ASO，作为针对癌症的新免疫疗法。
*以粗体和下划线突出显示的核苷酸表示在SM-ASO中的互补位置被工程化，以破坏可能限制SM-ASO活性的潜在二级结构的错配的位置。
＾功效等级：低(+)、中(++)和高(+++)。
图1A至图1C显示了用于筛选剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)的GFP-IL7R荧光剪接报告物的验证。图1A显示了GFP-IL7R报告物的示意图，说明了SM-ASO靶(红色)和相应的顺式剪接元件的突变(蓝色)的位置。图1B显示了来自GFP-IL7R报告物的转录物中IL7R外显 子6的剪接分析。将稳定表达WT(C)或突变形式报告物(5'Mut、5'Cons、ΔESE2&ΔESS2)的Hela细胞用对照(Ctrl)或实验(IL7R-001&IL7R-002)SM-ASO转染。外显子6剪接通过RT-PCR分析，使用对GFP-IL7R报告物特异的引物(+E6＝包含外显子6；-E6＝排除外显子6)，并且外显子6包含的百分比计算如下：[包含/(包含+排除)]*100。图1C显示了GFP表达的分析。通过流式细胞术定量GFP平均荧光强度(MFI)。显示针对对照SM-ASO(Ctrl)进行归一化的数据。
为了评估这种报告物系统筛选调节IL7R外显子6剪接的SM-ASO的可行性，本发明人比较了阻断外显子6中特定顺式作用剪接元件与相应元件突变的效果。例如，SM-ASOIL7R-001阻断外显子6的5'-剪接位点，并迫使外显子的几乎完全排除相当于破坏该5'-剪接位点的突变(5'Mut)。同样，IL7R-002对先前鉴定的外显子剪接增强子2(ESE2)的阻断导致与该增强子的突变(ΔESE2)相当的效果。IL7R-002对IL7R RNA的亲和力较低，这可能解释了与ΔESE2相比，IL7R-002的亲和力数量级稍低。SM-ASO介导的给定的顺式剪接元件的阻断或突变引起的等效效应展示了SM-ASO在该报告物系统中控制剪接决定的能力。更重要的是，观察到的外显子6剪接的变化导致了GFP表达的预期变化，从而验证了GFP表达在该报告物系统中作为剪接结果读出的用途。
图2A至2E显示了与外显子6内的顺式作用剪接元件互补的IL7R SM-ASO的靶向筛选。图2A显示了用于筛选的GFP-IL7R剪接荧光报告物的示意图。跨越内含子5和6的IL7R的基因组序列被克隆，中断了GFP编码序列，因此GFP表达由IL7R外显子6的剪接决定。图2B和图2C显示了GFP表达的分析。将稳定表达荧光报告物的HeLa细胞用对照(ASO-Ctrl)或实验性吗啉代SM-ASO(IL7R-001-IL7R-005)转染，并通过流式细胞术定量GFP表达。图2B显示了所选择的SM-ASO的GFP平均荧光强度(MFI)的代表性柱状图，而图2C显示了针对对照ASO(ASO-ctrl)进行归一化的GFP MFI的定量。红色虚线表示在任一方向上GFP表达变化1.5倍的功效截止值。图2D显示了来自GFP-IL7R报告物的转录物中IL7R外显子6的剪接分析。IL7R外显子6的剪接在来自报告物的转录物中通过RT-PCR分析，使用对GFP-IL7R报告物特异的引物(+E6＝包含外显子6；-E6＝排除外显子6)，并且外显子6包含的百分比如下确定：[包含/(包含+排除)]*100。红色虚线表示外显子6包含百分比变化1.5倍的功效截止值。图2E显示来自内源IL7R基因的转录物中IL7R外显子6的剪接分析。IL7R外显子6的剪接在来自内源IL7R基因的转录物中分析，使用对内源转录物特异的引物(FL＝包含外显子6；ΔE6＝排除外显子6)，并且外显子6包含的百分比如下确定：[FL/(FL+ΔE6)]*100。在所有图中，通过双尾Student's t检验评估统计显著性，比较实验ASO和对照(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。
这一靶向筛选发现了若干在任一方向调节IL7R外显子6剪接的SM-ASO。例如，阻断5'-剪接位点(IL7R-001)或先前鉴定的ESE2(IL7R-002)诱导外显子的几乎完全排除。最重要的是，发现了IL7R-005，它阻断了外显子剪接沉默子3(ESS3)，促进了几乎完全的外显子包含。发现这一种SM-ASO对治疗自身免疫性疾病特别有用。此外，本发明人发现了四种增强外显子6排除的SM-ASO(IL7R-001、IL7R-002、IL7R-003和IL7R-004)，它们是免疫肿瘤学应用的候选物。对治疗目的至关重要的是，所有测试的SM-ASO都诱导了来自GFP-IL7R报告物和内源IL7R基因的转录物中外显子6剪接的类似调节。
图3A至图3E显示了IL7R内含子5和6中的SM-ASO步移筛选靶向序列。图3A显示了SM-ASO步移方法的示意图。例如，本发明人设计了长度为15-25nt的吗啉代SM-ASO，其与IL7R外显子6附近的内含子区域内每5nt的重叠序列互补。这些区域包括IL7R内含子5的最后209nt，避免了含有核心剪接元件诸如分支点序列、多嘧啶束和3'剪接位点的最后40nt，以及IL7R内含子6的前169nt，避免了包括5'剪接位点的前15nt。将对照(ASO-Ctrl)或靶向这些内含子区域的实验性SM-ASO(例如IL7R-006-IL7R-065)转染到如图2A所示的稳定表达报告物系统的HeLa细胞中。IL7R-001和IL7R-005用作阳性对照。图3B和图3C显示了靶向内含子5(图3B)和内含子6(图3C)的SM-ASO的GFP表达分析。如前所述，通过流式细胞术确定GFP平均荧光强度(MFI)。红线和蓝线分别表示GFP MFI减少或增加20％的截止值。图3D和3E显示了对于靶向内含子5(图3D)和内含子6(图3E)的所选的SM-ASO，来自GFP-IL7R报告物的转录物中IL7R外显子6的剪接分析。来自报告物的转录物中外显子6包含的百分比如前所述确定。红色虚线表示对照(ASO-Ctrl)中外显子6包含的水平。在所有图中，通过双尾Student's t检验评估统计显著性，比较实验SM-ASO和对照(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。
这种方法发现了IL7R-006，另一种SM-ASO，它通过阻断内含子6内的序列来促进外显子6包含的高水平。在SM-ASO IL7R-006的靶序列(UAAUAAAGAGGGUGAUUGUG)中，内含子6的5'剪接位点附近有一个多腺苷酸化信号(AAUAAA)，发明人以前发现它促进外显子6的跳过，最有可能是通过在与CPSF1结合时阻断5'剪接位点(Evsyukova等人,2013)。然而，本发明的IL7R-006寡核苷酸阻断了含有另外的剪接调节序列的20nt序列，这与Evsyukova等人,2013发表的结果不同。
除了IL7R-006，本发明人还发现了增加外显子6包含的另外的靶序列(列于表1)。这些包括两簇SM-ASO，簇1(内含子5)和簇2(内含子6)，以及若干其他SM-ASO，它们增加外显子6包含，尽管效率低于主要SM-ASO IL7R-005和IL7R-006。本发明人目前正在改进新发现的SM-ASO的最终的靶序列，以提高其效率。
该筛选还发现了若干减少外显子6包含的SM-ASO(参见如图3B和图3C中GFP表达增加，并列于表2)。后者是免疫肿瘤学中用于治疗干预的候选物。重要的是，这种方法为自身免疫和癌症鉴定了新的SM-ASO靶点，将在临床前模型中进行测试。
图4A至图4D显示了所选的SM-ASO对IL7R蛋白同种型表达的影响。如前所述，使用Endo-Porter转染系统(Gene Tools)用对照(ASO-Ctrl)或实验(IL7R-001、IL7R-004、IL7R-005和IL7R-006)吗啉代SM-ASO转染HeLa细胞。图4A显示了来自内源IL7R基因的转录物中外显子6的剪接分析。如前所述，从细胞分离总RNA，并通过RT-PCR确定外显子6包含的百分比。图4B显示了可溶性IL7R(sIL7R)分泌的定量。通过ELISA定量从图A的细胞收集的上清液中sIL7R的分泌。数据显示为针对对照(ASO-Ctrl)进行归一化的实验SM-ASO的平均吸光度。图4C显示了膜结合IL7R(mIL7R)的细胞表面表达的定量。用完整细胞中的IL7R染色通过流式细胞术确定mIL7R的细胞表面表达。数据显示为针对对照进行归一化的IL7R染色的平均荧光强度(MFI)。图4D显示了IL7R蛋白同种型表达的比率。mIL7R与sIL7R的比率(mIL7R/sIL7R)通过将mIL7R细胞表面表达的值(图4C)除以sIL7R分泌(图4B)来确定。在所有图中，通过双尾Student's t检验评估统计显著性，比较实验SM-ASO和对照(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。
这些结果表明，IL7R外显子6或内含子6中的SM-ASO靶向序列不仅诱导外显子6剪接的预期结果，而且更重要的是诱导IL7R蛋白质同种型的比率(mIL7R/sIL7R)。值得注意的是，IL7R-005和IL7R-006减少了sIL7R水平，并且对mIL7R细胞表面表达的影响最小。后者对MS和自身免疫的治疗至关重要，因为抑制mIL7R表达或活性会导致免疫抑制。SM-ASO IL7R-005和IL7R-006满足第一个功效终点，即恢复IL7R蛋白同种型。重要的是，通过防止免疫抑制的机制，这些SM-ASO被预测为MS和其他自身免疫性疾病的安全而有效的治疗药物。
此外，这些分析表明，减少外显子6包含的IL7R SM-ASO(IL7R-001和IL7R-004)，有效地增加了sIL7R水平，满足了潜在癌症免疫治疗的第一个功效终点。预测这些SM-ASO增强免疫系统对抗和根除癌细胞的能力。
图5A至图5D显示了减少sIL7R的主要SM-ASO对IL7R外显子6剪接的剂量-响应调节。如前所述，将稳定表达荧光报告物的HeLa细胞用递增浓度[0μM、1μM、5μM和10μM]的对照(ASO-Ctrl＝0μM)或实验(IL7R-005和IL7R-006)吗啉代SM-ASO转染。图5A和图5B显示了GFP表达的分析。如前所述，通过流式细胞术测量GFP平均荧光强度(MFI)。图5A显示了对于在不同浓度的IL7R-005，GFP MFI的代表性柱状图，而图5B显示了归一化的GFP MFI随着SM-ASO浓度变化。图5C和图5D显示了来自报告物(图5C)或内源基因(图5D)的转录物中IL7R外显子6的剪接分析。来自报告物或内源基因的转录物中外显子6包含的百分比如前所述确定，并显示为随着SM-ASO浓度变化。在所有图中，通过双尾Student's t检验评估统计显著性，比较实验浓度和对照(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。
图6A至图6D显示了增加sIL7R的主要SM-ASO对IL7R外显子6剪接的剂量-响应调节。如前所述，将稳定表达荧光报告物的HeLa细胞用递增浓度[0μM、1μM、5μM和10μM]的对照(ASO-Ctrl＝0μM)或实验(IL7R-001和IL7R-004)吗啉代SM-ASO转染。图6A和图6B显示了GFP表达的分析。如前所述，通过流式细胞术测量GFP平均荧光强度(MFI)。图6A显示了对于在不同浓度的IL7R-001，GFP MFI的代表性柱状图，而图6B显示了归一化的GFP MFI随着SM-ASO浓度变化。图6C和图6D显示了来自报告物(图6C)或内源基因(图6D)的转录物中IL7R外显子6的剪接分析。来自报告物或内源基因的转录物中外显子6包含的百分比如前所述确定，并显示为随着SM-ASO浓度变化。在所有图中，通过双尾Student's t检验评估统计显著性，比较实验浓度和对照(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。
图5A至图5D和图6A至图6D的分析表明，IL7R外显子6剪接可以通过操纵所用SM-ASO的剂量以剂量依赖的方式进行微调，并揭示了细胞培养物中IL7R剪接调节的最小有效浓度。重要的是，这些结果可用于推断非人灵长类动物临床前研究和人类临床试验中的体内剂量。该剂量-响应分析说明了主要SM-ASO的剂量-响应性的实例，并没有将我们的应用限制在测试的浓度范围。
图7A至图7B显示了IL7R-005对由MS相关SNP rs6897932驱动的IL7R外显子6的异常排除的校正。用对照SM-ASO(ASO-Ctrl)或IL7R-005转染稳定表达在IL7R外显子6中含有MS相关变体rs6897932的保护性'T'等位基因或风险'C'等位基因的GFP-IL7R报告物形式的Hela细胞。图7A显示了来自包含rs68978932的可变等位基因(C或T)的GFP-IL7R报告物的转录物中IL7R外显子6的剪接分析。如前所述，通过RT-PCR确定外显子6包含百分比。图7B显示了来自图7A的细胞中GFP表达的分析。如前所述，通过流式细胞术测量GFP平均荧光强度(MFI)，并显示为对用对照SM-ASO处理的表达“T”报告物的细胞归一化。在所有图中，通过双尾Student's t检验评估统计显著性，比较实验SM-ASO和对照或如所示(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。
本发明人和其他人以前的研究发现，IL7R外显子6中遗传变体rs6897932(C或T)的风险'C'等位基因通过增强外显子6的排除和sIL7R水平来增加MS风险(Gregory等人,2007；Evsyukova等人,2013；Hoe等人,2010；Lundstrom等人,2013)。上述分析表明，IL7R-005，用于治疗自身免疫的主要SM-ASO，恢复了rs6897932的风险'C'等位基因的作用，这有力地支持了IL7R-005的治疗潜力。
因此，本发明人已经描述了用于自身免疫和癌症的治疗干预的使用反义寡核苷酸来控制白介素7受体(IL7R)RNA的外显子6的选择性剪接的组合物和方法。这些反义寡核苷酸通过阻断IL7R RNA中夹杂(embed)的特定信号来控制IL7R外显子6的剪接。这些信号是决定IL7R外显子6的剪接结果的特定序列。此外，表1列出了IL7R RNA中将被反义寡核苷酸阻断以减少sIL7R的特定序列，包括这些序列的变体、这些序列的任何部分或这些序列侧翼的任何核苷酸，它们增加IL7R外显子6的包含，从而减少sIL7R分泌。此外，表2列出了IL7R RNA中将被反义寡核苷酸阻断以增加sIL7R的另外的信号，包括这些序列的变体、这些序列的任何部分或这些序列侧翼的任何核苷酸，它们减少IL7R外显子6的包含，从而增加sIL7R分泌。阻断这些序列中的仅仅几个核苷酸可以影响外显子6的剪接，因为驱动排除/包含的实际元件不是整个靶向序列，而通常是靶向序列中4-8nt的序列。例如，IL7R-005靶序列中的一个重要序列是最后5nt UGGUC，因此，阻断仅这个5nt序列或这个序列的几个nt的ASO可能足以产生预期的效果。然而，为了使功能序列的靶向特异性和效率最大化，寡核苷酸通常被制成较长的互补序列。最后，公知可能替换反义寡核苷酸中的一个或更多个碱基来修饰碱基配对，同时保持对所述靶序列的高亲和力、选择性和有效反义活性。根据SM-ASO的长度，非限制性的实例是具有15、20或25个核苷酸的那些，它们可以与表1和表2中的任何SEQ ID或其部分，单独或组合地，全部或部分地，或这些SEQ ID的任何生物活性排列具有70％、75％、80％、84％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、94％、95％或96％同一性，分别用于治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症，或与其互补的序列，用于用作以下的组合物和在方法中使用：通过增强IL7R外显子6的包含来减少可溶性IL7R的表达，用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病，或通过减少IL7R外显子6的包含来增强可溶性IL7R的表达，用于治疗癌症。对于具有5、10、15、20或25个核苷酸的SM-ASO，错配可以是例如1、2、3、4、5或更多个错配。
表3.对于IL7R-005和IL7R-006的每一种，具有最多8个错配的同一性百分比(同一性％)的概述。
设想可以关于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施本说明书中讨论的任何实施方案，并且反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
将理解，本文描述的特定实施方案是通过说明而非作为本发明的限制的方式来示出。本发明的主要特征可应用在各种实施方案中而不偏离本发明的范围。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规实验确定本文描述的具体程序的许多等同物。这样的等同物被认为在本发明的范围内，并由权利要求书所涵盖。
在说明书中提到的所有出版物和专利申请表示本发明所属的领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请在此通过引用并入，其程度如同每个单独出版物或专利申请被具体和单独指明通过引用并入的相同程度。
当连同权利要求书和/或说明书中的术语“包含”使用时，使用词"一个(a)"或"一个(an)"可意指“一个(one)”，但它还与“一个或更多个”、“至少一个”、和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指示为仅指替代品或替代品是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指替代品和“和/或”的定义。遍及本申请，术语“约”用于指示，值包括设备、确定值所采用的方法的固有误差变化，或在研究受试者中间存在的变化。
如本说明书和权利要求书中所用，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(include)”和包括“(include)”)，或“包含(containing)”(和“包含(containing)”的任何形式，诸如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含”可以用“基本上由...组成”或“由...组成”代替。如本文所用，短语“基本上由...组成”要求指定的整数或步骤，以及不实质上影响要求保护的发明的特征或功能的那些整数或步骤。如本文所用，术语“由...组成”用于指示仅有所述整数(例如，特征、元件、特性、属性、方法/过程步骤或限制)或整数的组(例如，特征、元件、特性、属性、方法/过程步骤或限制)的存在。
如本文所用的术语“或其组合”是指在术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，"A、B、C，或其组合意图包括以下的至少一种：A、B、C、AB、AC、BC、或ABC，且如果顺序在特定上下文中是重要的，还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或CAB。继续这个实例，明确包括了包含一个或更多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，通常不存在对任何组合中的项目或术语的数目限制，除非从上下文另有明显的。
如本文所用，近似的词语，诸如“没有限制”、“约”、“实质的”或“实质地”是指这样的条件，当如此修饰时，被理解为不一定是绝对的或完美的，而是将被认为对于本领域普通技术人员而言足够接近的，以保证指定该条件存在。描述可以变化的程度将取决于可以进行多大的改变，并且本领域的普通技术人员仍然认识到修改的特征仍然具有未修改的特征所需的特征和能力。一般来说，但是根据前面的讨论，本文由近似词诸如“约”修饰的数值可以与所述值相差至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％。
本文公开并要求保护的所有组合物和/或方法，可根据本公开内容作出并执行，无需过量实验。虽然本发明的组合物和方法已依据优选的实施方案进行描述，变化可应用至在本文描述的组合物和/或方法以及步骤中或在方法的步骤的顺序中，不偏离本发明的概念、精神和范围，这将对本领域技术人员是明显的。对于本领域技术人员明显的所有这样类似的替代和修改被认为是在本发明的精神、范围和概念之内，如由所附权利要求所限定的。
为了帮助专利局和根据本申请发布的任何专利的任何读者解释所附的权利要求书，申请人希望注意，他们不希望任何所附权利要求援引35U.S.C.§112第6段或AIA35U.S.C.§112第(f)段或其等同物，在本文申请日存在，除非在特定权利要求中明确使用词语“用于...的手段”或“用于...的步骤”。
对于每个权利要求，每个从属权利要求可以既依赖于独立权利要求，也依赖于每个和每一个权利要求的每个在先从属权利要求，只要该在先权利要求为权利要求条目或要素提供适当的在先基础。
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的引物
<400> 3
uuguguggga ucacg 15
<210> 4
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 4
ugggaucacg gacag 15
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<211> 15
<212> RNA
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<220>
<223> 合成的引物
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ucacggacag ucaga 15
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<212> RNA
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<400> 6
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gacccuaccc ccacu 15
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ccugagaccc uaccc 15
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agcacccuga gaccc 15
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<212> RNA
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agcacccuga gacccuaccc ccacu 25
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<212> RNA
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aggugaccuu cuucaacuaa uaaag 25
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caucagcauu uugag 15
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<212> RNA
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<400> 16
uuuuuucucu gucgcucugu ugguc 25
<210> 17
<211> 15
<212> RNA
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ucucugucgc ucugu 15
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<212> RNA
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ggugauugug uggga 15
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<211> 22
<212> RNA
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gcuuaagccc cauuuauuga ug 22
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cauuuauuga ugagaaaacc a 21
<210> 21
<211> 15
<212> RNA
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aaaccacaaa gggga 15
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<212> RNA
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<400> 22
acaaagggga uuaagg 16
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ggggauuaag gcauuuca 18
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uuaaggcauu ucacga 16
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cccacauuac uaaguaaa 18
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<212> RNA
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ggcccacauu acuaa 15
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<212> RNA
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aagugggccc acauu 15
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<212> RNA
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auaauaagug ggccc 15
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<212> RNA
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ucucuuaacu gaaaagcaa 19
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<212> RNA
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caaauauguc ucuuaacuga aa 22
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<212> RNA
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ugucaaauau gucucuuaac 20
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gcugucaaau augucuc 17
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auaaagcugu caaauau 17
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uccauaaagc uguca 15
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aucccuccau aaagc 15
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aaccaaaauc ccuccau 17
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ugccuuuuaa accaaaaucc c 21
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<211> 21
<212> RNA
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gucaaugccu uuuaaaccaa a 21
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cccaagucaa ugccuuuuaa a 21
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gucacccaag ucaau 15
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gccuggucac ccaag 15
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agugcccagu auccc 15
<210> 45
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ccaguauccc uaucu 15
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aucccuaucu auccuca 17
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auccucagcg aauuuc 16
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cagcgaauuu ccaca 15
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成的引物
<400> 50
aauuuccaca guuaauuuca uaag 24
Claims (73)
1.一种治疗有相应需要的受试者的白介素7受体的可溶性同种型(sIL7R)水平升高的疾病或病症的方法，所述方法包括：施用有效量的组合物，所述组合物包含特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而增强IL7R前mRNA中外显子6的包含，并减少sIL7R的表达。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸特异性结合选自表1中的单独或组合的任何靶SEQ ID或其任何部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病或状况是选自以下中的至少一种的自身免疫性疾病：多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化或炎性肠综合征诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病，或其中与没有疾病或状况的正常受试者相比sIL7R升高的任何其他状况。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病或状况是炎性疾病或状况。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的降解。
12.根据权利要求1所述的方法，还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗为自身免疫或炎性疾病的疾病或状况的活性剂的联合治疗，所述活性剂选自以下中的至少一种：米托蒽醌、干扰素β-1a、PEG-干扰素β-1a、硫唑嘌呤、芬戈莫德、那他珠单抗、甲基强的松龙或奥瑞珠单抗。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括从患者获得细胞并修饰所述细胞以瞬时或永久表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的步骤。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括产生表达特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸的载体，用于基因治疗，并用所述载体治疗患者。
15.一种组合物，所述组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸是特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而增强IL7R前mRNA中外显子6的包含，并减少sIL7R的表达。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。
20.根据权利要求15所述的组合物，其中所述寡核苷酸特异性结合选自表1中的单独或组合的任何靶SEQ ID，或其任何部分的全部或部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。
21.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。
22.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物适于施用以治疗选自以下至少一种的自身免疫性疾病：多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化或炎性肠综合征诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病，或其中sIL7R升高的任何其他状况。
23.根据权利要求15所述的组合物，其中所述寡核苷酸通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的降解。
24.根据权利要求15所述的组合物，其中所述寡核苷酸在表达载体中。
25.一种增加白介素-7受体(IL7R)前mRNA的外显子6的包含的方法，所述方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物中的SM-ASO在由外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而增强IL7R前mRNA中外显子6的包含，并减少sIL7R的表达。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述组合物中的SM-ASO在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述SM-ASO通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的降解。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述SM-ASO阻断缺乏外显子6的IL7R mRNA的翻译。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述SM-ASO特异性结合选自表1中的单独或组合的任何靶SEQ ID或其部分，或其任何部分的全部或部分，或所述SM-ASO的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。
33.根据权利要求25所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。
34.根据权利要求25所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自以下中的至少一种：多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬化或炎性肠综合征诸如溃疡性结肠炎和克罗恩病，或其中sIL7R升高的任何其他状况。
35.一种组合物，所述组合物用于增加白介素-7受体(IL7R)前mRNA中外显子6的包含，方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合影响外显子6剪接的白介素-7受体(IL7R)前mRNA中的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
36.根据权利要求35所述的组合物，所述组合物还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗自身免疫或自身免疫性疾病的活性剂的联合治疗，所述活性剂选自米托蒽醌、干扰素β-1a、PEG-干扰素β-1a、硫唑嘌呤、芬戈莫德、那他珠单抗、甲基强的松龙或奥瑞珠单抗。
37.一种载体，所述载体表达包含寡核苷酸的核酸，所述寡核苷酸是特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
38.根据权利要求37所述的载体，其中所述载体是病毒载体或质粒。
39.一种治疗有相应需要的受试者的多发性硬化的方法，所述方法包括：施用有效量的组合物，所述组合物在药学上可接受的赋形剂中包含特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO增加IL7R前mRNA中外显子6的包含并减少IL7R的可溶性同种型(sIL7R)的表达。
40.根据权利要求39所述的方法，还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗多发性硬化疾病的活性剂的联合治疗。
41.根据权利要求40所述的方法，其中用于治疗多发性硬化的一种或更多种剂选自米托蒽醌、干扰素β-1a、PEG-干扰素β-1a、硫唑嘌呤、芬戈莫德、那他珠单抗、甲基强的松龙或奥瑞珠单抗。
42.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：施用有效量的组合物，所述组合物包含特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R的可溶性同种型(sIL7R)的表达。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接增强子(ESE)和/或内含子剪接增强子(ISE)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而减少外显子6的包含，并增加sIL7R的表达。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的组合，在另一方面，所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述寡核苷酸特异性结合选自表2中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQ ID NO:14-50)或其部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述寡核苷酸靶向表2中的任何SEQ ID(SEQ IDNO:14-50)，或其部分。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。
50.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌症对常规免疫疗法表现出低响应(肝细胞癌)。
51.根据权利要求42所述的方法，其中还包括提供SM-ASO和一种或更多种有效治疗癌症的活性剂的联合治疗，所述活性剂诸如但不限于免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、常规化疗或治疗性放射。
52.一种组合物，所述组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸是特异性结合影响外显子6剪接的白介素7受体(IL7R)的前mRNA中的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸在由外显子剪接增强子(ESE)和/或内含子剪接增强子(ISE)组成的组中的至少一个中特异性结合IL7R前mRNA中的序列，从而减少IL7R前mRNA中外显子6的包含，并增加sIL7R的表达。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述寡核苷酸中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述寡核苷酸特异性结合选自表2中的单独或组合的任何靶SEQ ID(SEQ ID NO:14-50)或其部分，或所述寡核苷酸的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。
58.根据权利要求52所述的方法，其中所述寡核苷酸完全或部分地靶向表2中的任何SEQ ID(SEQ ID NO:14-50)，在另一方面，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。
59.根据权利要求52所述的方法，其中所述组合物适用于施用以治疗癌症。
60.一种减少白介素-7受体(IL7R)前mRNA中外显子6的包含的方法，该方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述组合物中的寡核苷酸特异性结合IL7R前mRNA中的序列，所述序列在由外显子剪接增强子(ESE)和/或内含子剪接增强子(ISE)组成的组中的至少一个中，从而减少IL7R前mRNA中外显子6的包含，并增加sIL7R的表达。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述组合物中的SM-ASO在内含子-外显子剪接位点、分支点序列和/或多嘧啶束特异性结合IL7R前mRNA上的序列。
63.根据权利要求60所述的方法，其中所述SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含非天然存在的修饰，该修饰包括以下的修饰或取代：(1)核糖或其他糖单元、(2)碱基或(3)骨架，选自：一种或更多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛、硫代缩甲醛和/或烷基甲硅烷基取代、部分或完全修饰的骨架诸如完全修饰的磷酸糖骨架、锁核酸骨架、肽骨架、磷酸三酯骨架、氨基磷酸酯骨架、硅氧烷骨架、羧基甲基酯骨架、乙酰胺酯骨架、氨基甲酸酯骨架、硫醚骨架、桥接亚甲基膦酸酯骨架、硫代磷酸酯骨架、甲基膦酸酯骨架、烷基膦酸酯骨架、磷酸酯骨架、烷基硫代膦酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、碳酸酯骨架、磷酸三酯骨架、羧甲基酯骨架、甲基硫代磷酸酯骨架、二硫代磷酸酯骨架、具有p-乙氧基键的骨架、糖修饰诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧乙氧基(2'-O-MOE)、2'-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分、核苷酸模拟物、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、脱水己醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)，以及上述任意两种或更多种的任意组合，在另一方面，所述SM-ASO中的至少一个或更多个核苷酸包含对核苷酸碱基的非天然存在的修饰。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述SM-ASO通过靶向IL7R外显子5-外显子7的边界来增强缺少外显子6的IL7R mRNA的稳定性。
65.根据权利要求60所述的方法，其中所述SM-ASO增强缺乏外显子6的IL7R mRNA的翻译。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述SM-ASO特异性结合选自表2中的单独或组合的任何靶SEQ ID或其部分，或所述SM-ASO的序列与IL7R RNA内的完全靶序列具有至少70％、75％、80％、84％、85％、88％、92％、93％、94％、95％或96％互补性。
67.根据权利要求60所述的方法，其中所述寡核苷酸靶向表2中的任何SEQ ID。
68.根据权利要求60所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂、盐或载体。
69.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病是一种癌症。
70.一种用于减少白介素-7受体(IL7R)前mRNA中外显子6的包含的组合物，方法包括：使白介素-7受体(IL7R)前mRNA接触特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含，并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述组合物还包括SM-ASO和一种或更多种有效治疗癌症的活性剂的联合治疗，所述活性剂诸如但不限于免疫检查点抑制剂(例如，纳武单抗)、治疗性抗体(例如，赫赛汀)、常规化疗(例如，紫杉醇)或治疗性放射。
72.一种载体，所述载体表达包含寡核苷酸的核酸，所述寡核苷酸是特异性结合白介素-7受体(IL7R)前mRNA中影响外显子6剪接的序列的反义寡核苷酸(ASO)或剪接调节反义寡核苷酸(SM-ASO)，其中所述SM-ASO减少IL7R前mRNA中外显子6的包含，并增加IL7R可溶性同种型(sIL7R)的表达。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述载体是病毒载体或质粒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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