CN108977449B - 原发性免疫缺陷病的致病突变及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了与原发性免疫缺陷病相关的两种新的致病突变及其应用。上述两个新的致病突变具体为：1)位于IL2RG基因上的c.220T>A突变；2)位于CYBB基因上的c.141+3A>T突变。本申请提供的关于PID的新的致病突变，为该疾病的诊断和治疗了新的可检测位点；同时，采用本申请提供的试剂盒，可快速有效的检测出PID的上述相关突变。

Description

原发性免疫缺陷病的致病突变及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物医学领域，具体涉及原发性免疫缺陷病的致病突变及其应用，具体的，涉及与该病症相关的核酸、多肽、载体、重组细胞以及相关应用，还涉及一种能检测原发性免疫缺陷病的致病突变的试剂盒。

背景技术

原发性免疫缺陷病(Primary immunodeficiency disorder,PID)是免疫系统发生基因变异，导致免疫细胞和分子功能缺陷的一类疾病，临床表现为易患感染、恶性肿瘤、过敏、炎症和自身免疫病。由于PID罕见疾病，加之临床表型复杂，临床医生难以在早期确诊，使得严重PID患者多于早年死亡；存活病例常因诊断延误导致反复严重感染和其他慢性进程，最终发生器官衰竭和致残。PID属罕见病，真实发病率尚不清楚，近年PID发病率有增高趋势。由于PID是遗传异质性疾病，临床表型多变，致病基因多，目前仍有很多其相关的致病基因和致病突变未被发现，因此，关于PID的研究工作仍需不断深入开展。

发明内容

基于对PID的深入研究，本申请提出了两个关于PID的新的致病突变，并对其进行了应用领域的相关研究。

根据本申请的第一方面，本申请提供了一种核酸，该核酸与原发性免疫缺陷病相关，该核酸与野生型IL2RG基因相比，存在c.220T>A突变；或该核酸与野生型CYBB基因相比，存在c.141+3A>T突变。

根据第二方面，本申请提供了一种多肽，该多肽与原发性免疫缺陷病相关，该多肽与野生型IL2RG蛋白相比，其存在p.Trp74Arg突变，或该多肽与野生型CYBB蛋白相比，其缺失野生型CYBB蛋白的第48至84位的氨基酸序列。

根据第三方面，本申请提供了一种用于检测PID致病突变的试剂盒，该试剂盒含有用于检测IL2RG基因和CYBB基因突变中的至少一种的试剂，其中，上述突变包括：相比野生型IL2RG基因，该突变具有c.220T>A突变；相比野生型CYBB基因，该突变具有c.141+3A>T突变。

进一步的，上述试剂包括核酸探针和引物中的至少一种。

在本申请的一种具体实施方式中，上述检测PID基因突变的试剂盒中，该试剂盒中的试剂包括引物对，具体包括如下两组引物对中的至少一组：1)引物对具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列，可用于检测IL2RG基因上的c.220T>A突变。2)引物对具有如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，可用于检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变。

在本申请的一种具体实施方式中，上述检测PID基因突变的试剂盒中，该所述试剂包括带有可识别标记的核酸探针，所述核酸探针的序列选自如如SEQID NO:5-SEQ ID NO:15所示的序列中的至少一种。其中，如SEQ ID NO:5-SEQID NO:12所示序列，可用于检测IL2RG基因上的c.220T>A突变。如SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:15所示的序列，可用于检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变。

根据本申请的第四方面，本申请提供了一种载体，该载体包含本申请第一方面所述的核酸。

需要说明的是，载体是指用于将目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的遗传载体。本申请提供的载体中的目的基因即为本申请第一方面提供的核酸。本领域技术人员应该理解，适用于本申请的载体的具体形式是多种多样的，包括但不限于质粒、人工染色体(BAC)、Cosmid等。本领域技术人员可以根据需要选择合适载体形式。

根据本申请的第五方面，本申请提供了一种重组细胞，该重组细胞通过本申请第四方面所述的载体转化受体细胞而获得。

需要说明的是，转化后获得的重组细胞携带上述致病突变中的至少一种。本领域技术人员知晓，通过重组细胞可以有效的获得本领域第一方面提供的核酸，也可以获得本申请第二方面提供的多肽。本领域技术人员可以根据需要选择受体细胞或者也可称为宿主细胞的类型。

根据本申请的第六方面，本申请还提供了本申请提供的核酸、多肽、载体和重组细胞中的至少一种在PID领域中的应用，具体涉及PID的检测、治疗、药物开发等。

需要说明的是，上述核酸、多肽、载体和重组细胞在PID领域中的应用的具体方式是多种多样的，包括直接应用和间接应用。本领域技术人员应当明白，本申请的核酸和多肽可直接应用于PID的检测、治疗领域，例如，在本申请的一种具体实施方式中，通过对样品中的核酸序列进行检测，判定其是否具有本申请提供的两种致病突变。而载体和重组细胞可以作为获得本申请的核酸和多肽的原料，重组细胞还可以作为PID治疗或药物开发领域的模型。

本申请的有益效果在于：本申请提供了关于PID的新的致病突变，为该疾病的诊断和治疗了新的可检测位点；同时，采用本申请提供的试剂盒，可快速有效的检测出PID的相关突变。

具体实施方式

目前，世界各国都十分重视原发性免疫缺陷病的研究工作，许多与其相关的致病基因及其突变已被发现。但事实上，仍有大量的相关致病突变并不为人所知，这为全面认识和对抗该类疾病带来很大的障碍，不利于其的诊断和治疗。基于此，申请人通过收集免疫缺陷病人样品，通过大量的基础研究对可能与PID相关的基因进行探针设计，定制了目标区域捕获芯片，结合Complete Genomics高通量测序技术对样品进行捕获测序，并通过一系列的研究和检测，突破性的得到了关于PID的两个新的致病突变。这两个突变分别涉及IL2RG基因和CYBB基因，其中，IL2RG基因是白细胞介素2受体(IL-2R)基因，CYBB基因则用于编码细胞色素b-245重链(cytochrome b-245heavy chain)。本申请提供关于上述两个新的致病突变具体为：1)位于IL2RG基因上的c.220T>A突变；2)位于CYBB基因上的c.141+3A>T突变。上述突变均由本申请人首次提出，在现有技术中均未见任何相关报导。

基于上述研究，本申请提供了一种分离的核酸，该核酸与原发性免疫缺陷病相关，进一步的，该核酸编码上述突变的相关突变体。具体的，编码IL2RG突变体的核酸，其核苷酸序列与野生型IL2RG基因相比，存在c.220T>A突变，即该突变体较野生型IL2RG基因，其cDNA序列的第220位由T突变成了A，产生了错义突变，造成该基因第二个外显子中74号氨基酸由疏水性的色氨酸突变为碱性的精氨酸，该改变会对高度保守的半胱氨酸残基(Conservedcysteineresidue)结构域/模体中的72号氨基酸造成影响，最终病患表现出重症联合免疫缺陷病(severe combined immune deficiency，SCID)症状，SCID是PID中最严重的一种疾病，患者一般在出生后三个月左右夭折。编码CYBB突变体的核酸，其核苷酸序列与野生型CYBB基因相比，存在c.141+3A>T突变，即该突变体较野生型CYBB基因，在对应其cDNA的第141位碱基后3位的位于非编码区的碱基了由A突变成T，该突变属于剪切位点突变，将造成CYBB第三个外显子丢失，该外显子区域是铁氧化还原酶结构域(ferric oxidoreductasedomain)一部分，蛋白截短会影响细胞色素B功能，最终使巨噬细胞NADPH氧化酶(phagocyteNADPH oxidase)不能正常工作，患者表现出慢性肉芽肿症状(chronicgranulomatous disease，CGD)，CGD是PID的一种，患者表现出反复性全身化脓性感染。在本申请的一种实施方式中，上述核酸为DNA。本领域技术人员应当理解的是，在此，本申请已经对突变位点的信息做了具体位置及突变类型的阐明，因此，适用于本申请的核酸包括但不限于DNA、mRNA、cDNA，同时，本申请中的核酸序列可以是互补双链中的任一条或两条。基于核酸序列的互补性和本申请提供的核酸序列信息，本领域技术人员可在明确了一条核酸序列的情况下得到与其互补的另一条核酸序列。关于上述分离的核酸，可以是通过提取、纯化的方式从样品获得，也可以是通过人工合成或人工突变等方式得到，可在检测、治疗、药物开发或研究等PID相关领域中自由使用。例如一种直接的应用方式是，通过对该核酸进行检测，得到样品中是否存在本申请提供的致病突变的信息。需要补充说明的是，野生型IL2RG基因的gDNA和cDNA序列的具体信息可通过在NCBI网站上分别搜索NG_009088.1和NM_000206.2获得，野生型CYBB基因的gDNA和cDNA序列的具体信息可通过NCBI网站上分别搜索NG_009065.1和NM_000397.3获得。

本申请提供了一种分离的多肽，该多肽与原发性免疫缺陷病相关的突变多肽。具体的，该突变多肽与野生型IL2RG蛋白相比，其氨基酸序列的第74位由野生型色氨酸(Trp，W)突变为精氨酸(Arg，R)。该突变多肽与野生型CYBB蛋白相比，其氨基酸序列缺失与野生型CYBB蛋白的第48至84位对应的那段氨基酸序列，共计37个氨基酸，具体的，缺失的氨基酸序列为“SAL ALARAPAACL NFNCM LILLP VCRN LLSFLR GSSA”，故，该突变多肽短于野生型野生型CYBB蛋白。关于上述分离的多肽，可以通过提取和纯化的方式获得，自由的在检测、治疗、药物开发或研究等PID相关领域中使用。例如一种直接的应用方式是，通过对该多肽进行检测，得到待检样品中是否存在本申请提供的致病突变的信息。需要补充说明的是，野生型IL2RG蛋白的序列的具体信息可通过在NCBI网站上搜索NP_000197.1获得，野生型CYBB蛋白序列的具体信息可通过NCBI网站上搜索NP_000388.2获得。

需要说明的是，关于上述致病突变在待测样品中的检测方法，一般包括如下步骤：样品处理、检测、结果判定。其中，样品处理，是指对待测样品进行相关处理，处理的具体方式根据实际检测的对象也可称为检测目标而定，例如若对样品中的核酸进行检测，此时检测目标为核酸，则样品的处理方式为从样品中将核酸提取出来。而样品本身的类型同样根据检测目标的类型进行选择，例如检测目标为核酸时，样品包括但不限于血液、上皮组织等，通常情况下，相关样本中包括检测目标即可。检测这一步骤也是根据所选的检测目标而定的，检测目标不同时，检测的具体方式也有所区别。例如当检测目标为核酸时，可采用测序的方式来确定样品核酸的序列信息，而测序的具体方法并不构成对本申请的限制，本领域技术人员可基于本申请的提示选择合适的测序方式。在本申请的一种具体实施方式中，采用sanger测序的方式对样品中的核酸进行检测。将从样品中提取的核酸通过引物进行PCR扩增，对扩增后的片段进行sanger测序。结果判定，是指将检测的结果与一定的标准进行比对，得出结论。结果判定的方式同样与检测目标的选择相关。在本申请的一个具体实施方式中，采用将测序结果与标准序列进行比对，若待测样品的核酸序列中含有本申请公开的两种致病突变中的一种，即为阳性结果，否则为阴性。

为检测上述致病突变在待检测样品中的存在，本申请提供了一种用于检测上述致病突变的试剂盒，该试剂盒含有用于检测IL2RG基因和CYBB基因的上述致病突变中的至少一种的试剂，换而言之，可选择同时对这两种致病突变进行检测，也可选择仅对其中一种进行检测。进一步的，上述试剂包括但不限于核酸探针和引物。为更高效准确的检测上述致病突变，本申请提供了一种核酸检测试剂盒，该试剂盒中的试剂包括以下引物对中的至少一对：1)该引物对具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列，可用于检测IL2RG基因上的c.220T>A突变。2)该引物对具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，可用于检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变。同时，本申请还提供了另一种核酸检测试剂盒，该试剂盒中的试剂包括带有可识别标记的核酸探针，所述核酸探针的序列如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15所示的序列中的至少一种。其中，如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:12所示序列，用于检测IL2RG基因上的c.220T>A突变。如SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:15所示的序列，用于检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变。上述试剂盒中可仅包括上述核酸探针中的一种，也可包括多种进行联合检测。在本申请的一种具体实施方式中，核酸探针的可识别标记优选为生物素(biotin)，生物素可以和亲和素(avidin)、链霉亲和素(streptavidin)等结合。核酸片段和探针杂交后，探针上的生物素能和固定在基质上的亲和素或者链霉亲和素结合，再洗去不能和探针杂交的核酸片段后，目标核酸得到捕获纯化。本申请提供的引物对和核酸探针是由本申请人经过大量的实验后筛选得到的，其具有极高的特异性，且本身的结构稳定，具有极佳的检测效果和效率。

下面通过具体实施方式对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

实施例一：致病突变的获得

1、样品收集

申请人从深圳市儿童医院肾脏免疫科收集到30例病人样品，样品具体为病人的外周血。所有病人都有签署知情同意书，项目受到华大基因伦理委员会审核批准。

筛选标准：病人都有反复感染，炎症等症状，通过对CRP+血常规(五分类)，体液免疫功能检查，淋巴细胞免疫分析六项等检测结果综合分析后怀疑是免疫功能异常。

2、目标区域捕获与高通量测序

申请人针对原发性免疫缺陷病相关文献进行检索和查阅，收集与免疫功能相关的基因的信息，包括但不限于在研究中的报道已确证基因以及通过信号通路分析预测与免疫功能有关的基因。根据收集到的信息，申请人通过大量的分析和整理，针对这些基因进行探针设计，并定制了目标区域捕获芯片，结合Complete Genomics高通量测序技术对30例病例进行目标区域捕获测序。具体步骤如下：

1)样品处理

将上述收集到的30例病人外周血编号后，采用QIAamp DNAMini Kit试剂盒，按照制造商提供的说明书中外周血提取流程分别从中提取DNA。提取DNA的具体方法是每个病人取200μl外周血加入蛋白酶和裂解液后在56℃裂解细胞，裂解产物加入乙醇后转移到离心柱中再进行离心，在离心过程中DNA吸附到离心柱的硅基膜上，通过先后加入两次洗涤溶液离心洗涤，离心柱的硅基膜上的残留的杂质被洗去，最后加入洗脱缓冲液，通过离心把硅基膜上的DNA洗脱收集起来。

对提取后的DNA进行检测，检测方法和要求是采用Qubit BR Assay Kit对DNA进行浓度定量，根据定量结果取100ng DNA用1％琼脂糖凝胶，150V，40min电泳，根据电泳胶图判断DNA降解情况和蛋白质，RNA污染情况。DNA无降解或者轻微降解，浓度在30ng/μl以上，总量在1.5μg以上的DNA样品是合格的。

2)测序文库构建

将DNA检测合格后进行超声打断，把DNA片段打断到200-400bp片段。

对打断后的DNA片段进行末端修复，末端加’A’，连上接头后通过PCR对片段进行扩增。

扩增产物接下来用此前已设计后的目标区域探针进行杂交捕获。在杂交反应的过程中，目标区域片段与捕获探针稳定结合从而达到有效捕获。捕获的目标区域片段被Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠进行纯化，纯化后的片段用Ecop15酶进行酶切，并用磁珠回收酶切后的片段。

与接头A的连接相类似，在纯化回收后的片段5’和3’端分别加上接头B，用于单链环化。

最终生成的单链环就是在CG测序平台进行上机测序的文库。

3测序结果的处理和致病突变的确认

1)测序要求：对每个文库都进行高通量测序来确保每个样品满足测序深度要求。每个样品的平均测序深度最少为800X。

2)文库构建的最终产物DNA单链环经过滚环复制后获得的DNA纳米球(DNB:DNANanoball)，DNB将填充高密度的DNA纳米阵列，通过联合探针锚定测序方法来识别序列定位、结合多种探针进行未知序列分析。通过成像荧光在每个连接的步骤，可以确定每个DNB的核苷酸序列。

通过对上述构建后的文库进行测序(测序仪相关信息Blackbird测序仪或者BGISeq-500测序仪)，在进行base calling(碱基读取或识别)之后，得到了大量的reads序列。通过对上述30个病例的外周血DNA进行目标区域捕获测序，每个样品产生不少于900M数据，捕获率在60％以上。

2)使用Complete Genomics开发的比对工具进行初始比对。基于初始比对的结果，软件将识别出与参考基因组可能有差别的区域，并收集一部分可能在该区域的reads进行局部de novo组装。基于初始比对结果和局部组装结果，使用一个概率统计模型进行变异检测。具体的，我们迭代地调整基因组序列，以便对每个观察到的位点最大化其后验概率。对于每个候选序列，采用具有简单读取生成模型的贝叶斯统计量计算该概率，优化过程迭代地应用单碱基置换，插入和缺失，直到达到最佳二倍体序列。然后基于组装的二倍体序列和参考序列比较，得到候选的变异位点。

3)提取高可信度的变异结果进行注释。针对检测出的SNP位点，我们先采用千人III期数据库、国际HapMap数据库、dbsnp138数据库和外显子数据库对变异结果进行注释，然后采用一定的策略进行筛选。

首先筛选出变异频率小于或等于0.05的SNP位点，然后选择变异类型为错义、剪接、终止等类型的突变，然后假设变异是有害突变查看遗传模式是否匹配，最后根据软件Polyphen2和软件SIFT预测结果，选择预测为有害的SNP位点。

最终申请人在30个样品的9个样品中找到10个致病SNP，并通过sanger测序验证对这10个致病SNP进行了验证，sanger测序证实这10个变异的测序结果是准确的。

4)通过检索数据库以及文献，结合IUIS颁布PID分类标准里的各致病基因表型和临床症状对比，申请人发现上述10个致病SNP中的8个SNP是文献已经报道确认的已知基因已知致病突变，剩下2个男性患者的突变是已知基因的未报道突变，即IL2RG基因上c.220T>A突变，该突变造成IL2RG蛋白上p.Trp74Arg错义突变，该改变会对高度保守的半胱氨酸残基结构域/模体中的72号氨基酸造成影响，最终病患表现出SCID症状，患者最终在出生后三个月左右夭折。CYBB基因上c.141+3A>T突变，该突变是剪接位点突变造成CYBB第三个外显子丢失，进而造成CYBB蛋白截短，而蛋白截短会影响细胞色素B功能，最终使巨噬细胞NADPH氧化酶不能正常工作，患者表现出反复性全身化脓性感染。这两个基因都位于X染色体上，属于X连锁隐性遗传。

实施例二：一种包含引物对的用于检测PID致病突变的试剂盒

本例公开了一种用于检测PID致病突变的试剂盒，该试剂盒的试剂中包括以下两组引物对：

1)第一组引物对，可检测IL2RG基因上的c.220T>A突变：

上游引物(5’-3’)：AGACTTGCTACCCTCTCTCTTG(如SEQ ID NO:1所示)。

下游引物(5’-3’)：CCTCCTCCTTCTGACCATCATT(如SEQ ID NO:2所示)。

2)第二组引物对，检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变：

上游引物(5’-3’)：GTTTGGCTGGGGTTGAACG(如SEQ ID NO:3所示)。

下游引物(5’-3’)：TGGAGGGAGTGAGGCTAATG(如SEQ ID NO:4所示)。

该试剂盒的具体检测步骤包括：

1)样品处理，按照实施例一中的方法从样品中提取DNA。样品为检测对象的外周血。

2)检测。采用本例中提供的包含上述引物对的试剂对提取后的DNA进行PCR扩增，扩增相关步骤如下：20ng DNA加入到25μl反应体系中，反应体系由10xbuffer 2.5μl，2.5mMdNTP mixture 2μl，正向引物和反向引物各1μl，rTaq0.125μl，补水使总体积为25μl。PCR反应程序为：预变性阶段94℃，30秒；变性阶段94℃，30秒，退火阶段60℃，30秒，延伸阶段72℃，30秒；变性，退火，延伸三个阶段循环35次，即完成扩增。

纯化PCR的扩增产物，并对其进行测序(测序仪器为ABI-3730XL)

3)结果判定。测序得到的序列与IL2RG基因或IL2RG基因突变体、CYBB基因或CYBB基因突变体比对，检测其是否存在IL2RG基因上c.220T>A突变和/或CYBB基因上c.141+3A>T突变，从而有效的检测出该样品是否存在与PID相关的上述两种致病突变的一种或两种。

实施例三：一种包含核酸探针的用于检测PID致病突变的试剂盒

本例公开了一种用于检测PID致病突变的试剂盒，该试剂盒的试剂中包括以下若干条核酸探针：

1)可检测IL2RG基因上的c.220T>A突变的8条核酸探针，其带有可识别的标记生物素，8条核酸探针的序列分别如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:12所示：

(1)核酸探针1(5’-3’)：

ATCCCCTCCCCCTCGTCCCTTCTCATACCAATAATGCAGAGTGAGGTTGGTAGGCTGGGGCTCAGAGCTGCTGTTCCAAGTGCAATTCAT(如SEQ IDNO:5所示)。

(2)核酸探针2(5’-3’)：

TCGTCCCTTCTCATACCAATAATGCAGAGTGAGGTTGGTAGGCTGGGGCTCAGAGCTGCTGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATT(如SEQ IDNO:6所示)。

(3)核酸探针3(5’-3’)：

TCATACCAATAATGCAGAGTGAGGTTGGTAGGCTGGGGCTCAGAGCTGCTGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATTGAACACAAAA(如SEQ IDNO:7所示)。

(4)核酸探针4(5’-3’)：

CCAATAATGCAGAGTGAGGTTGGTAGGCTGGGGCTCAGAGCTGCTGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATTGAACACAAAACACTG(如SEQ IDNO:8所示)。

(5)核酸探针5(5’-3’)：

GAGTGAGGTTGGTAGGCTGGGGCTCAGAGCTGCTGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATTGAACACAAAACACTGAACCTCTGGGA(如SEQ IDNO:9所示)。

(6)核酸探针6(5’-3’)：

CTGCTGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATTGAACACAAAACACTGAACCTCTGGGAGGGGCAGAGTGGAAACACTGAGGGAGTCA(如SEQ IDNO:10所示)。

(7)核酸探针7(5’-3’)：

GCTGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATTGAACACAAAACACTGAACCTCTGGGAGGGGCAGAGTGGAAACACTGAGGGAGTCAGT(如SEQ IDNO:11所示)。

(8)核酸探针8(5’-3’)：

TGTTCCAAGTGCAATTCATGTACTCGACATTGAACACAAAACACTGAACCTCTGGGAGGGGCAGAGTGGAAACACTGAGGGAGTCAGTGG(如SEQ IDNO:12所示)。

2)可检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变的3条核酸探针，其带有可检测的标记生物素，3条核酸探针的序列分别如SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:15所示：

(1)核酸探针9(5’-3’)：

TTGTCTGGTATTACCGGGTTTATGATATTCCACCTAAGTTCTTTTACACAAGAAAACTTCTTGGGGTAAGTATAAATTCCATCCCATGCA(如SEQ ID NO:13所示)。

(2)核酸探针10(5’-3’)：

TACCGGGTTTATGATATTCCACCTAAGTTCTTTTACACAAGAAAACTTCTTGGGGTAAGTATAAATTCCATCCCATGCAATATTGGCTGG(如SEQ IDNO:14所示)。

(3)核酸探针11(5’-3’)：

GGTTTATGATATTCCACCTAAGTTCTTTTACACAAGAAAACTTCTTGGGGTAAGTATAAATTCCATCCCATGCAATATTGGCTGGTTCAC(如SEQ IDNO:15所示)。

该试剂盒的具体检测步骤包括：

1)样品处理，按照实施例一中的方法从样品中提取DNA并进行检测。样品为检测对象的外周血。将DNA检测合格后进行超声打断，把DNA片段打断到200-400bp片段。对打断后的DNA片段进行末端修复，末端加’A’，连上接头后通过PCR对片段进行扩增。

2)检测。

(1)采用本例中提供的包含上述核酸探针的试剂对提取后的DNA进行杂交捕获。经过杂交反应，捕获的目标区域片段通过探针上的生物素标记和Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠上的链霉亲和素结合进行富集纯化，纯化后的片段用Ecop15酶进行酶切，并用磁珠回收酶切后的片段。与接头A的连接相类似，在纯化回收后的片段5’和3’端分别加上接头B，用于单链环化。

(2)最终得到的单链环在CG测序平台进行上机测序。

3)结果判定。测序得到的序列与IL2RG基因或IL2RG基因突变体、CYBB基因或CYBB基因突变体比对，检测其是否存在IL2RG基因上c.220T>A突变和/或CYBB基因上c.141+3A>T突变，从而有效的检测出该样品是否存在与PID相关的上述两种致病突变的一种或两种。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

核 苷 酸 序 列 表

<110> 深圳华大基因研究院

<120> 原发性免疫缺陷病的致病突变及其应用

<130> 17I24354

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agacttgcta ccctctctct tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctcctcctt ctgaccatca tt 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttggctgg ggttgaacg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggagggagt gaggctaatg 20

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcccctccc cctcgtccct tctcatacca ataatgcaga gtgaggttgg taggctgggg 60

ctcagagctg ctgttccaag tgcaattcat 90

<210> 6

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgtcccttc tcataccaat aatgcagagt gaggttggta ggctggggct cagagctgct 60

gttccaagtg caattcatgt actcgacatt 90

<210> 7

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcataccaat aatgcagagt gaggttggta ggctggggct cagagctgct gttccaagtg 60

caattcatgt actcgacatt gaacacaaaa 90

<210> 8

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccaataatgc agagtgaggt tggtaggctg gggctcagag ctgctgttcc aagtgcaatt 60

catgtactcg acattgaaca caaaacactg 90

<210> 9

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagtgaggtt ggtaggctgg ggctcagagc tgctgttcca agtgcaattc atgtactcga 60

cattgaacac aaaacactga acctctggga 90

<210> 10

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctgctgttcc aagtgcaatt catgtactcg acattgaaca caaaacactg aacctctggg 60

aggggcagag tggaaacact gagggagtca 90

<210> 11

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctgttccaa gtgcaattca tgtactcgac attgaacaca aaacactgaa cctctgggag 60

gggcagagtg gaaacactga gggagtcagt 90

<210> 12

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgttccaagt gcaattcatg tactcgacat tgaacacaaa acactgaacc tctgggaggg 60

gcagagtgga aacactgagg gagtcagtgg 90

<210> 13

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgtctggta ttaccgggtt tatgatattc cacctaagtt cttttacaca agaaaacttc 60

ttggggtaag tataaattcc atcccatgca 90

<210> 14

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taccgggttt atgatattcc acctaagttc ttttacacaa gaaaacttct tggggtaagt 60

ataaattcca tcccatgcaa tattggctgg 90

<210> 15

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggtttatgat attccaccta agttctttta cacaagaaaa cttcttgggg taagtataaa 60

ttccatccca tgcaatattg gctggttcac 90

Claims (9)

1.一种核酸，其特征在于，所述核酸与原发性免疫缺陷病相关，

所述核酸与野生型IL2RG基因相比，其存在 c.220T>A突变；或

所述核酸与野生型CYBB基因相比，其存在c.141+3A>T突变。

2.一种多肽，其特征在于，所述多肽与原发性免疫缺陷病相关：

所述多肽与野生型IL2RG蛋白相比，其存在p.Trp74Arg突变；或

所述多肽与野生型CYBB蛋白相比，其缺失野生型CYBB蛋白的第48至84位的氨基酸序列。

3.一种检测原发性免疫缺陷病致病突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于检测如下IL2RG基因和CYBB基因突变中的至少一种的试剂，

相比野生型IL2RG基因，所述突变具有c.220T>A突变；

相比野生型CYBB基因，所述突变具有c.141+3A>T突变。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括核酸探针和引物中的至少一种。

5.如权利要求4中所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括以下引物对中的至少一组：

引物对分别具有如SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2所示的序列，用于检测IL2RG基因上的c.220T>A突变；

引物对分别具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，用于检测CYBB基因上的c.141+3A>T突变。

6.如权利要求4中所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括带有可识别标记的核酸探针，所述核酸探针的序列选自如SEQ ID NO:5- SEQ ID NO:15所示序列中的至少一种。

7.一种载体，其特征在于，所述载体具有如权利要求1所述的核酸。

8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含如权利要求7所述的载体。

9.如权利要求1所述的核酸、如权利要求2所述的多肽、如权利要求7所述的载体以及如权利要求8所述的重组细胞中的至少一种在制备原发性免疫缺陷病相关领域的检测试剂的应用。