CN111378735B

CN111378735B - Sma致病基因捕获试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111378735B
Application number: CN201811619480.4A
Authority: CN
Inventors: 伍建; 姬晓雯; 王海丽
Original assignee: Mygenostics Chongqing Gene Technology Co ltd
Current assignee: Mygenostics Chongqing Gene Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN111378735A

Abstract

本发明公开了SMA致病基因捕获试剂盒及其应用。本发明提供了一种SMA致病基因捕获的捕获探针，为如下1)或2)：1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成；2)由1)中每条探针的衍生物组成；所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。本发明提供SMA致病基因捕获试剂盒，能够提高对SMN1基因和SMN2基因拷贝数检测的特异性，通量高、准确度高、成本低，解决了现有方法测序深度不均一、错误率高等问题，从而实现对SMA致病基因患者和携带者的筛查。

Description

SMA致病基因捕获试剂盒及应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及SMA致病基因捕获试剂盒及其应用。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,发病率为1/5000-1/10000，高居致死性常染色体遗传病的第二位，携带者频率为1/35-1/80。SMA临床特征表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱等。SMA可分为4类，I型(严重型)、II型(中间型)、III型(轻型)和IV型(成人型)。目前遗传学已经确认，SMA主要与两个高度同源的基因密切相关，SMN1与SMN2，二者之间只有5个碱基的差别，全长约20kb，含9个外显子，转录产物约1.7kb，编码294个氨基酸。由于SMA区域含有一个复杂的反向重复序列，高度不稳定，导致该区域经常发生缺失和基因转换，研究表明，95-98％SMA患者SMN1的7号外显子发生了纯合缺失，3-5％SMA患者的一条染色体发生点突变，另一条染色体发生缺失或基因转换。

目前，临床上常用于SMA基因检测的方法主要有以下几类：(1)PCR-RFLP或一代测序，该方法操作简便，但只能检测纯合型缺失，不能区分携带者及正常人，也不能检测SMN2的拷贝数，在临床上仅可以诊断SMN1纯合缺失的患者，其他情况只能作为初筛。(2)荧光定量PCR，该方法多采用单内参标准化，定量检测结果判断存在一定的主观因素，可以区分患者，携带者、正常人，但是其它如SMN1点突变和2+0基因型携带者不能检测。(3)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)，该技术可以明确区分患者、携带者及正常人，同时检测患者的SMN2拷贝数。但是该技术操作时间较长，成本较高，操作过程中有多步开盖操作，增加污染风险。且不能检测点突变与特殊的SMN1 2+0携带者。(4)二代测序，该方法已有专利可以检测SMN1和SMN2的点突变。但该方法(扩增子测序)由于PCR的偏好性会使目标区域的测序深度不均一，且对于碱基多聚体(homopolyer)和插入缺失具有较高的测序错误率，因而不能有效地用来检测SMN1/2的拷贝数变异。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种SMA致病基因捕获的捕获探针。

本发明提供的捕获探针，为如下1)或2)：

1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成；

2)由1)中每条探针的衍生物组成；

所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。

上述捕获探针中，所述每条探针均标记生物素。

本发明另一个目的是提供一种SMA致病基因捕获的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的捕获探针所示的组分1)。

上述试剂盒还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：

2)富集缓冲液BL，包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；具体由30％-45％(体积百分比)人cot-1DNA(如30％-35％、35％-45％、30％、35％、40％或45％)、5％-25％(体积百分比)鲑鱼精DNA(如5％-15％、15％-25％、5％、10％、15％、20％或25％)、0.2-1nmol/μl引物1(如0.2-0.5nmol/μL、0.5-1nmol/μL、0.2nmol/μL、0.3nmol/μL、0.5nmol/μL、0.6nmol/μL或1nmol/μL)、0.2-1nmol/μl引物2(如0.2-0.5nmol/μL、0.5-1nmol/μL、0.2nmol/μL、0.3nmol/μL、0.5nmol/μL、0.6nmol/μL或1nmol/μL)和水组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列40；

所述引物2的核苷酸序列为序列41；

3)富集缓冲液HY，包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；具体其由1.0-1.5M(如1.0-1.25M、1.25-1.5M、1M、1.25M或1.5M)NaCl、0.1-0.3M柠檬酸钠(如0.1-0.15M、0.15-0.3M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M或0.3M)、0.08-0.12g/100mL(如0.08-0.10g/100mL、0.10-0.12g/100mL、0.08g/100mL、0.10g/100mL或0.12g/100mL)BSA、5％-10％(如5-7％、7-10％、5％、6％、7％、8％或9％)(体积比)Tween20和水组成；

4)文库富集结合缓冲液，包括NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；具体由1M NaCl、1mMEDTA和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液组成；

5)洗涤缓冲液WB1，包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；其为质量体积比0.05-0.2％的SDS溶液A(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)；SDS溶液A中的溶质为SDS，溶质为质量体积比0.05-0.2％(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)的SDS；溶剂为柠檬酸三钠缓冲液SSC；所述柠檬酸三钠缓冲液SSC由175g/LNaCl、88g/L柠檬酸三钠和水组成，所述缓冲液pH为7.4；

6)洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；其为质量体积比0.05-0.2％(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)SDS溶液B；SDS溶液B中的溶质为SDS(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)，溶质为质量体积比0.05-0.2％，溶剂为0.1×SSC；

所述0.1×SSC为将所述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释10倍，得到的溶剂；所述0.1×SSC的pH值为7.4；

7)文库富集洗脱液，其为0.1M NaOH水溶液；

8)中和缓冲液NE，其为pH值为7.5且浓度为1M Tris-HCl水溶液；

9)PCR反应液，包括引物3和引物4；

所述引物3的核苷酸序列为序列42，所述引物4的核苷酸序列为序列43，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰；

上述试剂盒还包括记载如下判断标准的可读载体：

根据测序结果与人类基因组版本Hg19中的SMN1基因和SMN2基因比对，计算待测样本中SMN1基因的f(Z)值和SMN2基因的f(Z)值，来判断待测样本中SMN1基因和SMN2基因的拷贝数，从而确定待测样本是否为脊髓性肌萎缩症患者或脊髓性肌萎缩症携带者，具体如下：

SMN1基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本在SMN1基因的测序深度D/比对碱基数A

其中，D值表示单个样本的SMN1基因的测序深度，A值表示单个样本SMN1基因的比对碱基数，B值为D与A的比值；

SMN2基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本在SMN2基因的测序深度D/比对碱基数A

其中，D值表示单个样本的SMN2基因的测序深度，A值表示单个样本SMN2基因的比对碱基数，B值为D与A的比值。

用SMN1基因的f(Z)值判断待测样本是否为脊髓性肌萎缩症患者或脊髓性肌萎缩症携带者：

若0.75<SMN1基因的f(Z)<1.25,则待测样本SMN1基因拷贝数正常，也就是待测样本SMN1基因copy数量为2，也就是待测样本不为或候选不为脊髓性肌萎缩症患者；

若0.25≤SMN1基因的f(Z)≤0.75,则待测样本SMN1基因的拷贝数异常，也就是待测样本SMN1基因copy数量为1，也就是待测样本为或候选为脊髓性肌萎缩症携带者；

若0<SMN1基因的f(Z)<0.25,则待测样本SMN1基因发生完全缺失，也就是待测样本SMN1基因copy数量为0，也就是待测样本为或候选为脊髓性肌萎缩症患者。

用SMN2基因的f(Z)值判断待测脊髓性肌萎缩症患者的病情程度：

0<SMN2基因的f(Z)<0.25的待测脊髓性肌萎缩症患者的患病程度大于0.25≤SMN2基因的f(Z)≤0.75的待测脊髓性肌萎缩症患者。

上述捕获探针或上述试剂盒在制备捕获待测样本中SMA致病基因的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述捕获探针或上述试剂盒在制备检测待测样本中SMA致病相关基因绝对拷贝数的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述捕获探针或上述试剂盒在检测待测样本中SMA致病相关基因绝对拷贝数中的应用也是本发明保护的范围。

上述中，所述SMA致病基因为SMN1基因和/或SMN2基因。

上述捕获探针或上述试剂盒在制备检测待测者是否为脊髓性肌萎缩症患者或携带者的产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还有一个目的是提供一种检测待测样本中SMN1基因或SMN2基因绝对拷贝数的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)利用上述捕获探针对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；

2)用所述上述试剂盒中的PCR反应液进行扩增，得到测序文库；

3)对所述测序文库进行测序，计算待测样本中SMN1基因的f(Z)值或SMN2基因的f(Z)值，来判断待测样本中SMN1基因或SMN2基因的拷贝数；

f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本测序深度D/比对碱基数A

其中，D值表示单个样本SMN1基因或SMN2基因的测序深度，A值表示单个样本SMN1基因或SMN2基因的比对碱基数，B值为D与A的比值；

若0.75≤SMN1基因或SMN2基因的f(Z)≤1.25,则待测样本SMN1基因或SMN2基因copy数量为2；

若0.25<SMN1基因或SMN2基因的f(Z)<0.75,则待测样本SMN1基因或SMN2的拷贝数异常，也就是待测样本SMN1基因或SMN2基因copy数量为1；

若0<SMN1基因或SMN2基因的f(Z)<0.25,则待测样本SMN1基因或SMN2基因copy数量为0。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供SMA致病基因捕获试剂盒，能够提高对SMN1基因和SMN2基因拷贝数检测的特异性，通量高、准确度高、成本低。捕获探针可对目标区域进行捕获，直观、快速、准确、简便地对SMN1基因和SMN2基因的拷贝数进行检测，能够快速、方便的应用于大规模人群的SMA致病基因检测，重复性好，结果准确，解决了现有方法测序深度不均一、错误率高等问题，从而实现对SMA致病基因患者和携带者的筛查。

2、本发明灵敏度高，由于该方法是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，特异捕获探针保证了对目标片段的完全捕获，且与MLPA金标准检测结果一致。该试剂盒对SMA致病基因的检测提供了一种很好的方法。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、SMA致病基因捕获试剂盒及其专用探针的制备

一、SMA致病基因捕获探针的设计和制备

所用SMN1基因序列为参考人类基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chr5:70220768-70248839。所用SMN2基因序列参考人类基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chr5:69345350-69373422。根据基因序列设计不同数目寡核苷酸探针形成探针组：探针组碱基序列如序列表中序列1-39所示，每条序列的第1-15位和第94-108位均相同，可以用来扩增探针，利用原位合成技术，大量合成设计的探针(MyGenostics.US)，并利用PCR的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，每条探针的5’端均由生物素标记，具体方法如下：

将上述合成的探针等摩尔比混合在总体积1.2ml的ddH₂O中，取其中5μl作为DNA模板，利用通用PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA)，分三管进行PCR扩增，其中引物GACTACATGGGACAT为带有生物素标记的引物。

上述PCR扩增体系：DNA模板，5μl；正向引物(25μM)，2μl；反向引物(25μM)，2μl；MgCl₂(50mM)，4μl；10x Platinum Taq缓冲液(购自Life Technologies)，5μl；dNTPs(每种10mM)，4μl；Platinum Taq(5U/μl,购自Life Technologies)，1μl；H₂O，27μl；总体积50μl。

PCR扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。

将PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(购自QIAGEN,货号：28004)纯化后，取500ng，用MyOne亲和素磁珠(购自Invitrogen，货号：65012)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来；然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的探针组，作为捕获探针。

上述生物素标记的探针组由核苷酸序列为1-39所示的探针组成，且每条探针的5'末端标记生物素基团，该探针组中每条探针等摩尔比混合。

二、SMA致病基因捕获试剂盒的制备及使用方法

A、SMA致病基因捕获试剂盒的制备

SMA致病基因捕获试剂盒，是通过检测SMN1基因和SMN2基因第7外显子和第8外显子拷贝数来进行分子遗传学检测的试剂盒，该试剂盒包含的成分为：上述一获得生物素标记的探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、洗涤缓冲液WB3、文库富集洗脱液、中和缓冲液NE和PCR反应液；具体组分如下：

1)生物素标记的探针组

生物素标记的探针组由序列1-39所示的探针组成，且每个单链DNA分子的5’端均标记生物素。

2)富集缓冲液BL

富集缓冲液BL由35％(体积百分比)人cot-1DNA(Invitrogen货号：15279011)、15％(体积百分比)鲑鱼精DNA(Invitrogen货号：15634017)、0.5nmol/μl引物1、0.5nmol/μl引物2和水组成；

其中引物序列如下：

引物1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGATCT(序列40)

引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC(序列41)

3)富集缓冲液HY

富集缓冲液HY由1.25M NaCl、0.125M柠檬酸钠、0.10g/100mL BSA、8％(体积比)Tween20和水组成；

4)文库富集结合缓冲液

文库富集结合缓冲液由1M NaCl、1mM EDTA和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液组成；

10mM Tris-HCl(pH 7.5)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Tris的浓度为10mM，HCl调节pH值为7.5；

5)洗涤缓冲液WB1

洗涤缓冲液WB1为质量体积比0.1％(g:ml)的SDS溶液A；0.1％的SDS溶液A中的溶质为SDS，浓度为0.1％，溶剂为柠檬酸三钠缓冲液；

上述柠檬酸三钠缓冲液SSC由175g/LNaCl、88g/L柠檬酸三钠和水组成；缓冲液pH为7.4；

6)洗涤缓冲液WB2

洗涤缓冲液WB2为0.1％SDS溶液B；0.1％的SDS溶液B中的溶质为SDS，浓度为0.1％，溶剂为0.1×SSC；

0.1×SSC为将上述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释10倍，得到的溶剂；缓冲液pH为7.4；

7)文库富集洗脱液

文库富集洗脱液为0.1M NaOH水溶液；

8)中和缓冲液NE

中和缓冲液NE为pH值为7.5且浓度为1M Tris-HCl水溶液；

1mM Tris-HCl(pH 7.5)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Tris的浓度为1mM，HCl调节pH值为7.5；

9)PCR反应液

PCR反应液由0.05U/μl Phusion Hot Start II DNA Polymerase(Fermentas，货号EP090B011)、PCR mix buffer组成。其中PCR mix buffer是由0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、5％(体积比)DMSO、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、4mM MgCl₂，500mM KCl、0.8％(v/v)Nonidet P40和水配制而成。上述引物3和引物4最后一位核苷酸均可带有硫代修饰，序列如下:

引物3：AATGATACGGCGACCACCGA*G(序列42)

引物4：CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(序列43)

*表示硫代修饰

上述试剂盒可以按照如下表1所列组分制备：

表1为试剂盒组成

B、SMA致病基因捕获试剂盒检测方法的建立

1、样本文库制备

提取待测者血清基因组DNA；采用康为试剂发明的NGS Fast DNA Library PrepSet for Illumina试剂盒(货号：CW2585M)对所有样本基因组DNA进行建库，得到DNA基因文库；建库主要步骤包括：DNA提取和打断、末端补平、加接头、PCR富集和纯化。

2、样本富集杂交

(1)杂交液制备：富集缓冲溶液HY提前预热5-10分钟(65℃、850rpm)；48ul上述1得到的DNA基因文库(总量为250ng左右)、10ul富集缓冲液BL、5μl生物素标记的探针组混合后震荡离心，再加入37ul预热后的富集缓冲溶液HY，吹打混匀。混合液95℃预热10min后60-70℃杂交16小时以上，得到杂交产物。

(2)纯化：此步骤所用的缓冲液除了WB2外，均室温放置，具体如下：

1)取1.5ml离心管，加入50ul MyOne磁珠(购自Invitrogen，货号：65012)，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架上静置1分钟后弃上清；

2)取下离心管，加入50ul文库富集结合缓冲液剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架上1分钟后弃上清液；重复该步骤3次；

3)用100ul文库富集结合缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，将上述(1)得到杂交产物全部加入，震荡混匀，翻转仪上翻转30min；

4)从翻转仪上拿下收集管，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；

5)加入500ul洗涤缓冲液WB1，震荡混匀，翻转仪上翻转15min；

6)从翻转仪上拿下收集管，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；

7)加入500ul洗涤缓冲液WB1，震荡混匀，66℃、850rpm孵育10min，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；

8)重复步骤7)三次；

9)放置室温2min，震荡离心，放置磁力架静置1min，弃去上清；

10)加入500ul WB2，震荡离心，吸弃上清；

11)加入17.5ul文库富集洗脱液，加完后立即盖盖，震荡混匀，翻转仪上翻转15min；

12)震荡离心，放置磁力架上静置1min，将澄清液转至一个干净的0.2ml管中，加入12.5ul中和缓冲液NE，震荡离心，得到30ul探针捕获后DNA。

3、样本PCR富集

(1)PCR反应体系

将上述探针捕获后DNA加入上述试剂盒中的PCR反应液中。

(2)PCR循环条件

98℃预变性2分钟；98℃30秒,58℃30秒72℃30秒(12个循环)；72℃5分钟；4℃保存；

(3)PCR产物纯化：由NucleoSpin纯化试剂盒(购自Gene，货号：740609.50)进行纯化，最后用35ul TE进行洗脱，获得捕获文库；

(4)2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用Qubit测定捕获文库浓度，对捕获文库进行定量。

4、将以上得到的捕获文库通过Illumina HiSeq2000进行测序，得到测序数据并进行分析。

该分析流程修改为包括以下几个步骤：

去除测序数据中的接头和低质量数据；

将过滤后的数据用BWA比对到人类基因组上；

统计目标区域覆盖大小，分别对SMN1和SMN2区域进行深度统计，通过计算测试样本与阴性样本深度的绝对拷贝数，得到样本SMN1与SMN2的拷贝值，进而判断样本SMN1与SMN2的具体拷贝值。

SMN1基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本在SMN1基因的测序深度D/比对碱基数A

SMN2基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本在SMN2基因的测序深度D/比对碱基数A

实施例2、SMA致病基因捕获试剂盒的应用

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

阴性对照：选择5例经MLPA检测为阴性的血清DNA样本作为正常对照(依次编号为1-5)。

待测样本：选择SMA基因存在缺失或突变的5例患者血清DNA样本(编号为11-15)和5例携带者血清DNA样本(编号为6-10)作为待测样本(提供样本者知情同意)；

一、本发明SMA致病基因捕获试剂盒检测

将上述待测样本和阴性对照均用实施例1的二的试剂盒和方法进行检测。

SMN1基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本在SMN1基因的测序深度D/比对碱基数A

SMN2基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本在SMN2基因的测序深度D/比对碱基数A

检测结果如表2和表3所示。

二、MLPA方法检测

将同样的待测样本和阴性对照用MLPA方法检测，采用试剂盒产品公司：MRC-Holland，产品名称

probemix P060 SMA，货号：P060-025R。

检测结果如表2和表3。

比对2种方法检测结果，可以看出，利用本发明的SMA致病基因捕获试剂盒进行检测的结果与MLPA验证结果的比较，发现结果一致，无差异。说明利用本发明的SMA致病基因捕获试剂盒检测SMN1基因和SMN2基因拷贝数的效果可靠。本研究方法比传统的检测方法具有更大的优越性，成本低、效率高、结果准确。

表2.测序数据

表3.SMA致病基因拷贝数检测

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司

<120>SMA致病基因捕获试剂盒及其应用

<160>43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gactacatgg gacatggccc cacgctgcgc acccgcgggt ttgctatggc gatgagcagc 60

ggcggcagtg gtggcggcgt cccggagcag gagtacgtcg taggttcc 108

<210> 2

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactacatgg gacatggtgg cggcgtcccg gagcaggagg attccgtgct gttccggcgc 60

ggcacaggcc aggtgaggtc gcagccagtg cagtacgtcg taggttcc 108

<210> 3

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gactacatgg gacatgaaca tgagttgttt ttatttctta ccctttccag agcgatgatt 60

ctgacatttg ggatgataca gcactgataa aagtacgtcg taggttcc 108

<210> 4

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gactacatgg gacatgggat gatacagcac tgataaaagc atatgataaa gctgtggctt 60

catttaaggt atgaaatgct tgcttagtcg ttttacgtcg taggttcc 108

<210> 5

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactacatgg gacattattt tcgtagcatg ctctaaagaa tggtgacatt tgtgaaactt 60

cgggtaaacc aaaaaccaca cctaaaagaa aactacgtcg taggttcc 108

<210> 6

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gactacatgg gacatcaaaa accacaccta aaagaaaacc tgctaagaag aataaaagcc 60

aaaagaagaa tactgcagct tccttacaac aggtacgtcg taggttcc 108

<210> 7

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gactacatgg gacatgtgga aagttgggga caaatgttct gccatttggt cagaagacgg 60

ttgcatttac ccagctacca ttgcttcaat tgatacgtcg taggttcc 108

<210> 8

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactacatgg gacatcccag ctaccattgc ttcaattgat tttaagagag aaacctgtgt 60

tgtggtttac actggatatg gaaatagaga ggatacgtcg taggttcc 108

<210> 9

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gactacatgg gacattggaa atagagagga gcaaaatctg tccgatctac tttccccaat 60

ctgtgaagta gctaataata tagaacaaaa tgctacgtcg taggttcc 108

<210> 10

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gactacatgg gacattgaga actccaggtc tcctggaaat aaatcagata acatcaagcc 60

caaatctgct ccatggaact cttttctccc tcctacgtcg taggttcc 108

<210> 11

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gactacatgg gacatcatca agcccaaatc tgctccatgg aactcttttc tccctccacc 60

accccccatg ccagggccaa gactgggacc aggtacgtcg taggttcc 108

<210> 12

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gactacatgg gacatttcct ttgaaatatt ccttatagcc aggtctaaaa ttcaatggcc 60

cacttactat catgctggct gcctccattt ccttacgtcg taggttcc 108

<210> 13

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gactacatgg gacattatag ccaggtctaa aattcaatgg cccacttact atcatgctgg 60

ctgcctccat ttccttctgg accaccagta agttacgtcg taggttcc 108

<210> 14

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gactacatgg gacatgtcta aaattcaatg gcccacttac tatcatgctg gctgcctcca 60

tttccttctg gaccaccagt aagtaaaaaa gagtacgtcg taggttcc 108

<210> 15

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gactacatgg gacatgatga tgctgatgct ttgggaagta tgttaatttc atggtacatg 60

agtggctatc atactggcta ttatatggta agttacgtcg taggttcc 108

<210> 16

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gactacatgg gacattatct atatagctat tttttttaac ttcctttatt ttccttacag 60

ggttttagac aaaatcaaaa agaaggaagg tgctacgtcg taggttcc 108

<210> 17

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gactacatgg gacatcaaaa tcaaaaagaa ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga 60

gtaagtctgc cagcattatg aaagtgaatc ttatacgtcg taggttcc 108

<210> 18

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gactacatgg gacatggccc cacgctgcgc acccgcgggt ttgctatggc gatgagcagc 60

ggcggcagtg gtggcggcgt cccggagcag gagtacgtcg taggttcc 108

<210> 19

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gactacatgg gacatgaaca tgagttgttt ttatttctta ccctttccag agcgatgatt 60

ctgacatttg ggatgataca gcactgataa aagtacgtcg taggttcc 108

<210> 20

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gactacatgg gacatgggat gatacagcac tgataaaagc atatgataaa gctgtggctt 60

catttaaggt atgaaatgct tgcttagtcg ttttacgtcg taggttcc 108

<210> 21

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gactacatgg gacatcaaaa accacaccta aaagaaaacc tgctaagaag aataaaagcc 60

aaaagaagaa tactgcagct tccttacaac aggtacgtcg taggttcc 108

<210> 22

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gactacatgg gacatgtgga aagttgggga caaatgttct gccatttggt cagaagacgg 60

ttgcatttac ccagctacca ttgcttcaat tgatacgtcg taggttcc 108

<210> 23

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gactacatgg gacatttgca tttacccagc taccattgct tcaattgatt ttaagagaga 60

aacctgtgtt gtggtttaca ctggatatgg aaatacgtcg taggttcc 108

<210> 24

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gactacatgg gacattggaa atagagagga gcaaaatctg tccgatctac tttccccaat 60

ctgtgaagta gctaataata tagaacaaaa tgctacgtcg taggttcc 108

<210> 25

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gactacatgg gacattgaga actccaggtc tcctggaaat aaatcagata acatcaagcc 60

caaatctgct ccatggaact cttttctccc tcctacgtcg taggttcc 108

<210> 26

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gactacatgg gacatgtcta aaattcaatg gcccacttac tatcatgctg gctgcctcca 60

tttccttctg gaccaccagt aagtaaaaaa gagtacgtcg taggttcc 108

<210> 27

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gactacatgg gacatttttt ctgtctccag ataattcccc caccacctcc catatgtcca 60

gattctcttg atgatgctga tgctttggga agttacgtcg taggttcc 108

<210> 28

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gactacatgg gacatgatga tgctgatgct ttgggaagta tgttaatttc atggtacatg 60

agtggctatc atactggcta ttatatggta agttacgtcg taggttcc 108

<210> 29

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gactacatgg gacattgtct atatagctat tttttttaac ttcctttatt ttccttacag 60

ggtttcagac aaaatcaaaa agaaggaagg tgctacgtcg taggttcc 108

<210> 30

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gactacatgg gacatcaaaa tcaaaaagaa ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga 60

gtaagtctgc cagcattatg aaagtgaatc ttatacgtcg taggttcc 108

<210> 31

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gactacatgg gacatttaac tgcagcctaa taattgtttt ctttgggata acttttaaag 60

tacattaaaa gactatcaac ttaatttctg atctacgtcg taggttcc 108

<210> 32

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gactacatgg gacatataaa ataagtaaaa tgtcttgtga aacaaaatgc tttttaacat 60

ccatataaag ctatctatat atagctatct atgtacgtcg taggttcc 108

<210> 33

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gactacatgg gacatttttt tttaacttcc tttattttcc ttacagggtt tcagacaaaa 60

tcaaaaagaa ggaaggtgct cacattcctt aaatacgtcg taggttcc 108

<210> 34

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gactacatgg gacatacttt tgtaaaactt tatggtttgt ggaaaacaaa tgtttttgaa 60

catttaaaaa gttcagatgt taaaaagttg aaatacgtcg taggttcc 108

<210> 35

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gactacatgg gacatacaat caatattaaa gaattttgat gccaaaacta ttagataaaa 60

ggttaatcta catccctact agaattctca tactacgtcg taggttcc 108

<210> 36

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gactacatgg gacatactgg ttggttatgt ggaagaaaca tactttcaca ataaagagct 60

ttaggatatg atgccatttt atatcactag tagtacgtcg taggttcc 108

<210> 37

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gactacatgg gacattagta ggcagaccag cagacttttt tttattgtga tatgggataa 60

cctaggcata ctgcactgta cactctgaca tattacgtcg taggttcc 108

<210> 38

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gactacatgg gacatacata tgaagtgctc tagtcaagtt taactggtgt ccacagagga 60

catggtttaa ctggaattcg tcaagcctct ggttacgtcg taggttcc 108

<210> 39

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gactacatgg gacatcacag aggacatggt ttaactggaa ttcgtcaagc ctctggttct 60

aatttctcat ttgcaggaaa tgctggcata gagtacgtcg taggttcc 108

<210> 40

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgatct 50

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc 50

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aatgatacgg cgaccaccga g 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

caagcagaag acggcatacg a 21

Claims

1.一种SMA致病基因捕获的捕获探针，为如下1)：

1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成。

2.根据权利要求1所述的捕获探针，其特征在于：所述每条探针均标记生物素。

3.一种SMA致病基因捕获的试剂盒，包括权利要求1或2所述的捕获探针所示的组分1)。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：

2)富集缓冲液，其包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；

所述引物1的核苷酸序列为序列40；

所述引物2的核苷酸序列为序列41；

3)富集缓冲液，包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；

4)文库富集结合缓冲液，包括NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；

5)洗涤缓冲液WB1，包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；

6)洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；

7)文库富集洗脱液，其为NaOH水溶液；

8)中和缓冲液NE，其为Tris-HCl缓冲液；

9)PCR反应液，包括引物3和引物4；

所述引物3的核苷酸序列为序列42，所述引物4的核苷酸序列为序列43，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰。

5.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备捕获待测样本中SMA致病基因的产品中的应用；所述SMA致病基因为SMN1基因和/或SMN2基因。

6.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备检测待测样本中SMA致病基因绝对拷贝数的产品中的应用；所述SMA致病基因为SMN1基因和/或SMN2基因。

7.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在检测待测样本中SMA致病基因绝对拷贝数中非疾病诊断的应用；所述SMA致病基因为SMN1基因和/或SMN2基因。

8.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备检测待测者是否为脊髓性肌萎缩症患者或携带者的产品中的应用。

9.一种检测待测样本中SMN1基因或SMN2基因绝对拷贝数非疾病诊断的方法，包括如下步骤：

1)利用权利要求1或2所述的捕获探针对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；

2)用权利要求4所述的试剂盒中的PCR反应液进行扩增，得到测序文库；

f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数

B＝样本测序深度D/比对碱基数A

若0.25<SMN1基因或SMN2基因的f(Z)<0.75,则待测样本SMN1基因或SMN2基因的拷贝数异常，也就是待测样本SMN1基因或SMN2基因copy数量为1；