CN109182563B - 检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及所用试剂盒 - Google Patents
检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及所用试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，包括对20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，还包括检测20种不同dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针。本发明还同时提供了利用上述试剂盒进行的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法。本发明在一次PCR扩增反应中同时检测多种耐药基因，并且多了一步与特异性探针杂交的步骤，大大提高检测的特异性；且方便快捷，检测成本也大大降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及其试剂盒。
背景技术
一、甲氧苄胺嘧啶类药物及其作用机制
甲氧苄胺嘧啶(Trimethoprin，TMP)是一类合成抗菌剂。第一种TMP化合物1962年在英国首次使用。由于TMP-SUL的组合在体外实验中显示出具有协同作用，自1968年以来，TMP常与磺胺(Sulfonamide，SUL)类药物联合使用。然而，临床经验表明，TMP-SUL组合在体内并没有明显的协同作用。自20世纪70年代开始单独使用TMP，首先用于预防尿路感染，然后被用于治疗急性尿路感染。
TMP能够与细菌内的二氢叶酸还原酶(DHFR；EC 1.5.1.3)结合，抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻。四氢叶酸对于叶酸合成是所必需的，而叶酸是形成核苷酸和氨基酸的重要前体。TMP通过抑制四氢叶酸形成达到抑菌目的。
TMP有广泛的抗菌谱，包括大肠杆菌(Escherichia coli)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)其他成员、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella sp.)等等。这些病原菌可引起尿道、呼吸道、肠道疾病及皮肤疾病。
二、dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因
由于临床适应症广泛，TMP类药物已广泛应用于世界各地。此外，由于这类合成化合物价格相对便宜，使得TMP在发展中国家和一些相对贫穷的国家中广泛使用。据报道，发展中国家革兰氏阴性病原体的TMP耐药率明显高于发达国家。随着使用的范围扩大，以及使用中的一些不规范用药行为的增加，对TMP类药物的耐药已引起了国际上的广泛重视。
细菌对TMP的抗性机制可分为染色体抗性和质粒携带的抗性。质粒介导的TMP抗性首先在1972年被发现，Pattishall等人发现介导TMP抗性的质粒携带的DHFR(相对于染色体编码的看家DHFR，称为辅助DHFR，由dfr基因编码)。转座子Tn7、整合子、插入因子(IS)以及广宿主范围的小质粒是携带和转移辅助DHFR的重要载体。
根据抗生素综合耐药数据库(The Comprehensive Antibiotic ResistanceDatabase，CARD)分析整理，目前在不同细菌中已经发现了30种不同的辅助dfr基因类型，其中包括20种dfrA类TMP耐药基因，广泛分布于革兰氏阴性菌中，在Acinetobacterbaumannii、Citrobacterfreundii、Enterobacter cloacae、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Morganella morganii、Proteus mirabilis、Pseudomonasaeruginosa、Salmonella enterica、Serratia marcescens、Vibrio cholerae、等病原菌中均有发现。dfrA类耐药基因是一类长度在459-570bps之间，序列同源性在30-90％之间的辅助DHFR编码基因，可以通过质粒或转座子在不同病原菌之间进行水平传播。
三、甲氧苄胺嘧啶类药物的耐药检测方法
目前细菌对甲氧苄胺嘧啶类药物耐药性的检测方法有两类，即表型检测和基因型检测。表型检测通过分离纯化样品中的病原菌后，在TMP药物存在的情况下再次培养病原菌，通过抑菌圈大小，或测定半致死药物浓度(MIC50)进行；而基因型检测则通过分子生物学方法，检测细菌是否携带与甲氧苄胺嘧啶类药物耐药性相关的基因。
表型耐药检测的结果与基因型检测结果通常相同，但有时亦有差异。而大量的临床实践表明，如果基因型检测到耐药基因，即使表型检测显示为敏感，仍有很大可能获得用药失败的结果。这种现象是由于表型检测得到的假阴性结果，而实际上细菌携带耐药基因，用药后在药物选择压力下很快成为优势菌株，使得用药失败。有鉴于此，国际上越来越多的细菌耐药性研究者和临床医生建议参考基因型检测结果，基因型检测到相关耐药基因，即使药敏试验实验结果为敏感，仍不建议使用相应抗生素，以尽可能延缓和减弱细菌对抗生素耐药的发生和发展。
表型检测步骤复杂，耗时长，整个过程至少需48-72小时，病原菌分离培养过程中，由于没有抗生素选择压力，可能使质粒等携带的TMP抗性基因发生丢失，导致后续的药物敏感性检测得出假阴性的结果。基因型检测的优点是可提供基因水平的耐药信息，可在样品收集后24小时内得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。
现有的基因型检测方法包括PCR扩增和测序。其中PCR扩增是根据是否有符合预期大小的PCR扩增产物来判断待测样品中是否包含特定耐药基因，如果耐药基因有多种可能，那么每一种耐药基因都需要做一次PCR检测，最后综合所有PCR检测结果来判断耐药的基因型。测序则是在PCR扩增的基础上，对扩增产物纯化后再进行序列测定，通过与公共数据库中的序列进行Blast比对后，确定耐药基因类型。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、快速、成本低的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及其试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒：包括对20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，其序列如SEQ ID NO:1-40所示；还包括检测20种不同dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针，其序列如SEQ ID NO:41-60所示。20种dfrA类耐药基因与特异性扩增引物、特异性探针的对应关系如下表1所示：
表1.20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因与特异性扩增引物和探针的对应关系
作为本发明的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒的改进：特异性探针固定于载体上；所述载体为以下任一：硅片、用各种功能基团衍生的膜，用各种功能基团修饰的玻片载体(优选为醛基基团修饰的玻片)。
作为本发明的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒的进一步改进：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和杂交反应基础液(即PCR扩增、杂交反应所需要的反应液)。
本发明还同时提供了利用上述试剂盒进行的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法，包括以下步骤：
1)、利用试剂盒包含的扩增引物组合和PCR扩增反应液，对待测样品中进行不对称扩增，即，对待测样品中可能存在的包含在待测的20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因中的至少一种(任何一种和几种基因区段)进行不对称扩增，同时对PCR产物进行荧光标记；
2)、将步骤1)所得的扩增产物与试剂盒中的杂交反应基础液混合，再与特异性探针进行杂交；经扫描(扫描仪可根据固定特异性探针的载体及PCR产物标记的类型确定)获得每个特异性探针的信号值、背景值(均为灰度值)；计算每条特异性探针的信噪比：信噪比＝(信号值-背景值)/背景值；当信噪比≥3时，判定该探针所对应的基因检测结果为阳性，如所有特异性探针信噪比均小于3，则判定该待测样品中不包含待测的20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因。
作为本发明的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法的改进：待测的20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因具体如下表2所示。
表2.dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因
本发明的方法包括多重不对称PCR扩增方法，以及特异性杂交方法。
在本发明中：
多重PCR扩增是指PCR扩增体系中包括待检测的20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的扩增引物。体系中的所有引物在同一扩增条件下均可以与样品中的模板进行扩增反应。
不对称PCR扩增是指通过调整正向引物与反向引物的浓度比例以及Tm值差异，使正向引物的量低于反向引物，以及在扩增的第二阶段提高退火温度，使得正向引物在该退火温度下无法与模板复性，而反向引物由于Tm值高于上游引物，在该退火温度下仍可正常与模板复性并进一步延伸，最终实现PCR扩增产物中两条链的产量不同的不对称扩增效果，其中能够与甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因特异性探针杂交的单链数量高于该链的互补链。
所述的杂交反应包括以下步骤：
1)将PCR扩增产物与杂交液混合，高温变性并速冷以使双链PCR产物解链为单链；
2)上述变性后的杂交混合物与固定于载体上的探针在合适的温度下杂交一定时间；
3)在洗液中清洗，去除未与载体上的探针杂交的PCR产物、盐离子等杂交液成分。
所述的杂交液包含杂交所需的盐溶液、表面活性剂，以及用于控制杂交严谨度的甲酰胺。
本发明所述的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及其试剂盒，具有集成化程度高、灵敏度高、特异性好，检测结果稳定可靠，成本低的特点，可广泛用于dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的分布、流行病学监测，为合理用药，有效降低和延缓耐药的发生提供有效工具。
本发明所采用的基因型检测方法相较于PCR扩增方法，在一次PCR扩增反应中同时检测多种耐药基因，并且多了一步与特异性探针杂交的步骤，大大提高检测的特异性。与测序方法相比，更加方便快捷，检测成本也大大降低。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的探针特异性筛选点阵排布图；
图2为20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的探针特异性筛选的杂交反应结果图；
说明：此为21份样品的芯片结果图，NC代表阴性对照，其作用为监测实验中是否存在污染；
图3为检测临床样品中dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的探针点阵排布图；
图4为检测临床样品中dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的杂交反应结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、利用本发明检测dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因
本实施例检测了本发明所涉及的20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因。
1.寡核苷酸引物和探针的制备
本发明根据CARD数据库提供的参考序列，结合Genbank数据库中检索到的序列，针对所涉及的每一种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因设计了若干对特异性扩增引物，再通过实验从中筛选出最佳的引物组合(如序列表所示序列1-序列40)；根据所涉及的每一种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的序列特异性，针对每一种耐药基因设计了若干条不同的特异性探针，再通过实验从中筛选出灵敏度和特异性均满足要求的特异性探针(如序列表所示序列41-序列60)。
所述的反向引物5’-末端均加上一段(15-30个寡核苷酸，优选为20-25个)与待检测基因完全没有同源性的无关序列，并标记荧光分子。使得反向引物在不对称PCR第二阶段扩增的较高退火温度下仍可以继续扩增，并使得扩增出的单链末端携带荧光分子，该单链产物与特异性探针杂交后，使得特异性探针所在位置显示出荧光。该无关序列例如为cgggttattctattccacctcttag，标记荧光分子例如为TAMRA。以SEQ ID NO:2所述的反向引物为例，该反向引物具体为5’-TAMRA-cgggttattctattccacctcttagCACCTTCCGGCTCGATGTCTAT。
为尽可能减少空间位阻对杂交的影响，特异性探针5’-末端连接上15-35个(优选为20-25个)poly(T)；并在末端进行化学修饰，使特异性探针可以通过化合键固定在基质上。以SEQ ID NO:41所述的探针为例，具体为5’-NH2-poly(T)25-ACAAAAGCCTGATCGATCAAGT。
本实施实例所用的检测dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因特异性引物和探针，均由上海英骏生物技术有限公司合成。
2.dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因检测芯片的制备
采用GeneMachine点样仪，将所述寡核苷酸探针分别溶解在50％(V/V)DMSO水溶液中(寡核苷酸探针的浓度为10μM)。按图1所示的探针点阵排布方式将溶解后的探针点制在醛基修饰的基片(
光学级醛基基片，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：420022)上，干燥并固定后，贴上12样品围栏(SmartGridTM，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：430033)备用。
备注：图1中，除了本发明的20个探针外，HybPCP3序列为：5’-NH2-poly(T)25-gcaaccaccaccggagg，为杂交阳性对照探针，其作用为与杂交反应液中的杂交阳性对照反应，监测杂交反应正常与否。HEX为位置标记点，DMSO为空白点。
3.待检样品制备
发明人所在实验室多年来从临床分离TMP耐药菌株和其他研究者赠送的质粒中分别获得本发明所涉及的所有20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因克隆，对所有的克隆进行Sanger测序，确定克隆的dfrA耐药基因序列与CARD数据库中提供的dfrA耐药基因参考序列一致。待检样品编号及对应的dfrA基因类型见表3。
表3.待检样品编号及对应的dfrA基因类型
4.PCR扩增dfrA基因片段
本实施例以克隆质粒DNA为模板，采用不对称PCR扩增。
用dfrA基因引物组合分别对20种克隆质粒进行不对称扩增，同时利用引物上标记的荧光分子TAMRA对PCR产物进行荧光标记。
不对称PCR扩增的反应体系如下(采用天根公司产品2×Taq PCR MasterMix，产品号：KT201)，根据样品数量进行体系放大：
备注说明：克隆质粒DNA是指表2中的一种。
正向引物混合物是指20种正向引物相同浓度的混合物；反向引物混合物是指20种反向引物相同浓度的混合物。
PCR反应在DNA Engine Tetrad 2(BIO-RAD)热循环仪上进行，采用以下热循环程序：
5.芯片杂交及信号检测
取扩增后的PCR产物，与适当浓度的盐溶液、表面活性剂、甲酰胺以及杂交阳性对照探针的靶标混合，配制成与芯片上固定的探针进行反应的杂交反应液。单份杂交反应液的配制如下(根据样品数量进行体系放大)：
备注说明：杂交阳性对照序列为：TAMRA-cctccggtggtggttgc
PCR产物与杂交反应基础液形成杂交反应液。
将制备好的甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因检测芯片(上述步骤2制备所得)和盖片(SmartCoverTM，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：430044)放置于杂交盒内。将配制好的杂交反应液95℃加热5分钟，立即置于冰上5分钟。取20μl杂交反应液，加样后封闭好杂交盒，置于32℃杂交2小时。杂交结束后，取出芯片，置于洗液(2×SSC和0.2％SDS)中，室温摇洗5分钟；之后将芯片用去离子水漂洗5分钟后，离心甩干。
芯片上的荧光信号采用GenePix 4200AL激光共聚焦扫描仪及其配套软件GenePixPro.6.0(Axon Inc.)扫描采集。扫描参数如下：激发光波长532nm；Laser Power：33％；PMT：400。
6.结果分析
用GenePix Pro 6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号，计算每一个探针信号点的信噪比(Signal Noise Ratio，SNR＝(信号值-背景值)/背景值)，从而确定样品中甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因类型，提示耐药性。20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的芯片杂交反应结果如图2所示。
结果显示，针对每一种dfrA类耐药基因设计的1-3条不同的特异性探针中，探针dfrA1-1(序列41)与且仅与含有dfrA1基因的样品TR-1产生阳性信号；探针dfrA3-1(序列42)与且仅与含有dfrA3基因的样品TR-2产生阳性信号；探针dfrA5-1(序列43)与且仅与含有dfrA5基因的样品TR-3、TR-15产生阳性信号；探针dfrA7-1(序列44)与且仅与含有dfrA7基因的样品TR-4产生阳性信号；探针dfrA8-1(序列45)与且仅与含有dfrA8基因的样品TR-5产生阳性信号；探针dfrA10-1(序列46)与且仅与含有dfrA10基因的样品TR-6产生阳性信号；探针dfrA12-1(序列47)与且仅与含有dfrA12基因的样品TR-7产生阳性信号；探针dfrA13-1(序列48)与且仅与含有dfrA13基因的样品TR-8产生阳性信号；探针dfrA14-1(序列49)与且仅与含有dfrA14基因的样品TR-9产生阳性信号；探针dfrA15-1(序列50)与且仅与含有dfrA15基因的样品TR-10产生阳性信号；探针dfrA16-1(序列51)与且仅与含有dfrA16基因的样品TR-11产生阳性信号；探针dfrA17-1(序列52)与且仅与含有dfrA17基因的样品TR-12产生阳性信号；探针dfrA19-1(序列53)与且仅与含有dfrA19基因的样品TR-13产生阳性信号；探针dfrA20-1(序列54)与且仅与含有dfrA20基因的样品TR-14产生阳性信号；探针dfrA21-1(序列55)与且仅与含有dfrA21基因的样品TR-15产生阳性信号；探针dfrA22-1(序列56)与且仅与含有dfrA22基因的样品TR-16产生阳性信号；探针dfrA23-1(序列57)与且仅与含有dfrA23基因的样品TR-17产生阳性信号；探针dfrA24-1(序列58)与且仅与含有dfrA24基因的样品TR-18产生阳性信号；探针dfrA25-1(序列59)与且仅与含有dfrA25基因的样品TR-19产生阳性信号；探针dfrA26-1(序列60)与且仅与含有dfrA26基因的样品TR-20产生阳性信号。
所有样品的芯片检测结果与表2所列完全一致，且特异性探针(序列41-60)与非靶基因PCR扩增产物之间均没有非特异性杂交，显示出极高的探针特异性。本方法所得的结果与测序结果完全一致。说明本发明提供的方法可以特异性的检测出上述20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因。
实施例2：利用本发明检测临床样品中dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因
本实施例说明本发明提供的方法和试剂盒可用于临床分离细菌菌株中20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的检测。
1.寡核苷酸引物和探针的制备
本实施例使用的寡核苷酸引物同实施例1；使用的特异性探针是在实施例1的基础上优选出的特异性探针(序列41-60)，方法及步骤同实施例1。
2.dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因检测芯片的制备
本实施例使用的探针点阵排布方式按图3所示，其他方法及步骤同实施例1。
3.待检样品制备
本实施例对临床分离并收集的表型检测为甲氧苄胺嘧啶类药物耐药菌株进行检测。经测序，菌株CS-159包含dfrA10基因，菌株CS-233包含dfrA16基因，菌株CS-442包含dfrA7基因，菌株CS-739包含dfrA17基因，菌株CS-1032包含dfrA12基因，菌株CS-1120包含dfrA1基因，菌株CS-1447包含dfrA13基因，菌株CS-1699包含dfrA8基因，菌株CS-1731包含dfrA14基因，菌株CS-2107包含dfrA22基因，菌株CS-2588包含dfrA24基因，菌株CS-15不包含任何待检测的dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因。
对上述临床分离菌株，采用Qiagene公司DNeasy Blood&Tissue Kit(产品号：69506)提取细菌全基因组核酸。
4.PCR扩增dfrA基因片段
方法及步骤同实施例1。
5.芯片杂交及信号检测
方法及步骤同实施例1。
6.结果分析
用GenePix Pro 6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号值和背景值，计算每一个探针信号点的信噪比(Signal Noise Ratio，SNR＝(信号值-背景值)/背景值)，从而确定样品中待检测的甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的存在情况，提示对甲氧苄胺嘧啶类药物耐药性。待检样品的芯片杂交反应结果如图4所示。上述待检样品的检测结果如表4。
表4.临床分离菌株芯片检测结果
比较芯片检测结果和测序结果，可以发现两种方法的检测结果完全一致。说明本发明提供的方法适用于临床分离菌株的检测。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及所用试剂盒
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaatggctg ttggttggac g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccttccgg ctcgatgtct at 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgcagcttt ggctcataac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttcttatc gtcagcagga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggagtgatt ggttgcggtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatctcccc gccaccagac 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagaaaatgg cgtaatcg 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaacgtgaa cagtagacaa a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccactaaa aggcgatctg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgttcttatc gtcagcagga 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actatcacag agcacgaagt g 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caccccaacc agcgaagc 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgcatttat ctcgttgctg c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgtcaccct cgaaggtttg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgaacccgg aatcggtccg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agacggagtg cgtgtacgtg 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggcgtgattg gttgcggtc 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagcgtagag gccatgggt 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttccatggag tgccaaaggg 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccttttgcca gatttggtaa ctat 24
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggctgcca agtcgaagaa 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcgtccaact aaaagccatt g 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tggcgtaatc ggtagtggtc 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgacttcaac gtgaacagta gac 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgagtcaccc acaacttgag c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caggaacgac agtagcgcct 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgttgcaatt gggaaacacc g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggccagttgg tagatttgag c 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
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<212> DNA
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<400> 30
tacgacgcgc atagacggag 20
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<211> 19
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgccaaagtc gccgtcattg 20
Claims (3)
1.检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：
包括对20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，其序列如SEQ ID NO:1～40所示；
还包括检测20种不同dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针，其序列如SEQ ID NO:41～60所示。
2.根据权利要求1所述的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：特异性探针固定于载体上；所述载体为以下任一：
硅片、用各种功能基团衍生的膜，用各种功能基团修饰的玻片载体。
3.根据权利要求1或2所述的检测20种dfrA类甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和杂交反应基础液。
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