CN111378736B - 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用。本发明提供了捕获探针，为如下1)或2)；1)由序列表中序列1至序列113所示的探针组成；2)由1)中每条探针的衍生物组成；所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。本发明所提供的耳聋相关基因捕获试剂盒，通过对遗传性耳聋患者的全外显子组或耳聋相关基因组(分别占全基因组的1％和0.01％)进行目标区域测序分析，捕获的是疾病的大部分致病突变信息。

Description

耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用。

背景技术

耳聋是最常见的遗传异质性疾病之一，大多数遗传性耳聋是单基因病，只有少数耳聋由多基因联合致病。在所有耳聋患者中，遗传性耳聋约占1/2，大约每500个新生儿就有1例耳聋患儿。根据患者是否伴有其他器官的病症分为综合征型耳聋和非综合征型耳聋，其中非综合征型耳聋根据遗传方式不同可分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁和线粒体母系遗传。主要相关基因包括GJB2、GJB6、GJB3、SLC26A4、12S rRNA、MYOTA、OTOF，其中中国最常见的致聋基因为GJB2、SLC26A4和12SrRNA。

GJB2基因其主要生物学功能为编码缝隙连接蛋白26(connexin26)，并与相邻的缝隙连接蛋白组成一个完整的通道，该通道对于细胞间物质的交换和信息的传递有着重要的作用。目前，非综合征型耳聋病人中已发现100多种GJB2突变类型，有4种常见的突变形式(235delC、299-300delAT、35delG和176del16)，约占总突变种类的88％，其中GJB2 235delC是亚洲人中最常见的突变。

GJB3定位于人类染色体lp33-p35，编码有270个氨基酸的连接蛋白31(connexin31)。GJB3突变既可导致DFNA又可导致DFNB。GJB3的错义突变E183K和无义突变R180X被认为与高频听力下降有关。主要突变类型包括R180X、E183K、423delATT、1141V。

SLC26A4基因位于人类染色体7q31，其mRNA全长4930bp，含21个8外显子，开放阅读框架2343bp，编码780个氨基酸Pendrin。Pendrin主要表达于内耳内淋巴管、内淋巴囊以及螺旋器外沟细胞，与内淋巴液代谢有关。SLC26A4基因突变可导致常染色体隐性耳聋DFNB4和Pendred综合征(大前庭导水管扩张综合征EVAS或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)。SLC26A4 ivs7-2A>G突变是中国人群EVAS的高发突变。

线粒体DNA 12SrRNA常见的突变类型有A1555G和C1494T两种，突变携带者对氨基糖甙类药物很敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至致聋。由这两种突变形成的U-A或G-C碱基配对使线粒体DNA更加容易与氨基糖甙类药物结合，抑制线粒体的氧化磷酸化过程造成耳毒性，使携带者听力下降或是原有听力下降程度更加严重。提示在应用耳毒性药物治疗儿童疾病前，要注意了解患儿耳聋的家族史，进行线粒体12SrRNA Al555G及Cl494T位点筛查，避免一针致聋，全家多人因药致聋的惨剧发生。

OTOF基因DNA全长序列101496bp,共有4种长短不同的转录变异体，其中最长的亚型包含48个外显子，编码氨基酸长度为1997aa的蛋白质otoferlin。otoferlin在耳蜗的表达情况和内毛细胞传入突触之间的显著关联意味着otoferlin是内毛细胞突触前结构的组成部分。有研究对76例门诊散发听神经病患者的OTOF基因9个热点外显子进行筛查分析，共发现8种OTOF基因多态位点。其中56842A/C、82885C/A、92905G/A为已知多态位点，突变率较高，与NCBI上公布的发生频率基本一致。

目前，市场上常用的筛选耳聋基因的方法有酶切法、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melt，HRM)、基因芯片和多色荧光PCR法检测等。虽然各有优点，但同时也有一定的缺点，或检测位点少或耗时费力或所需仪器昂贵或结果不稳定等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种耳聋相关基因捕获的捕获探针。

本发明提供的捕获探针，为如下1)或2)；

1)由序列表中序列1至序列113所示的探针组成；

2)由1)中每条探针的衍生物组成；

所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。

上述捕获探针中，所述每条探针均标记生物素。

本发明另一个目的是提供一种耳聋相关基因捕获的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的捕获探针所示的组分1)。

上述试剂盒还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：

3)富集缓冲液BL，其包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；具体由30％-45％(v/v)(如30％-35％、35％-45％、30％、35％、40％、45％)人cot-1DNA、5％-25％(v/v)(如5％-15％、15％-25％、5％、10％、15％、20％、25％)鲑鱼精DNA、0.2-1nmol/μl(如0.2nmol/μl、0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl、1nmol/μl)引物1、0.2-1nmol/μl(如0.2nmol/μl、0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl、1nmol/μl)引物2和水组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列116；

所述引物2的核苷酸序列为序列117；

4)富集缓冲液HY，包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；具体由1-1.5M(如1.0-1.25M、1M、1.25M、1.5M)NaCl、0.1-0.3M(如0.1-0.15M、0.15-0.3M、0.1M、0.125M、0.15M、0.3M)柠檬酸钠、0.08-0.12g/100mL(如0.08、0.1、0.12)BSA、5％-9％(v/v)(如5-7％、7-9％、5％、6％、7％、8％、9％)Tween20和水组成；

5)文库富集结合缓冲液，包括NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；具体由1M NaCl、1mMEDTA和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液组成；

6)洗涤缓冲液WB1，包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；其为质量体积比0.05-0.2％的SDS溶液A(如0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)；0.05-0.2％的SDS溶液A中的溶质为SDS，浓度为0.05-0.2％(如0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)，溶剂为柠檬酸三钠缓冲液SSC；

所述柠檬酸三钠缓冲液SSC由175g/L NaCl、88g/L柠檬酸三钠和水组成；缓冲液pH为7.4；

7)洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；其具体为质量体积比0.05-0.2％SDS溶液B；SDS溶液B中的溶质为SDS，浓度为0.05-0.2％(如0.05％,0.06％,0.1％,0.15％,0.2％)，溶剂为0.1×SSC；

所述0.1×SSC为将所述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释10倍，得到的溶剂；所述0.1×SSC的pH值为7.4；

8)洗涤缓冲液WB3,包括SDS和2倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；其具体为质量体积比0.05-2％(如0.05％,0.08，0.1％，0.15％，0.2％)SDS溶液C；SDS溶液C中的溶质为SDS，浓度为0.05-2％，溶剂为0.5×SSC；

所述0.5×SSC为将所述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释2倍，得到的溶剂；所述0.1×SSC的pH值为7.4；

9)文库富集洗脱液，其为0.1M NaOH水溶液；

10)中和缓冲液NE，其为pH值为7.5且浓度为1M Tris-HCl水溶液；

11)PCR反应液，包括引物3和引物4；

所述引物3的核苷酸序列为序列118，所述引物4的核苷酸序列为序列119，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰；

上述捕获探针或上述试剂盒在制备捕获待测样本中耳聋相关基因的产品中的应用也是本发明保护的范围。

或上述捕获探针或上述试剂盒在制备测序待测样本中耳聋相关基因产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述中，所述耳聋相关基因为GJB2、GJB3、SLC2624或线粒体耳聋突变基因。

上述的捕获探针或上述试剂盒在制备检测或预测待测者是否患有耳聋产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还有一个目的是提供一种捕获待测样本中耳聋相关基因的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：利用上述捕获探针对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；实现捕获待测样本中耳聋相关基因。

本发明还有一个目的是提供一种测序待测样本中耳聋相关基因或基因突变位点的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)利用上述的捕获探针对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；

2)用所述上述试剂盒中的PCR反应液进行扩增，得到测序文库；

3)对所述测序文库进行测序，得到待测样本中耳聋相关基因或基因突变位点的测序结果。

本发明所提供的耳聋相关基因捕获试剂盒，通过对遗传性耳聋患者的全外显子组或耳聋相关基因组(分别占全基因组的1％和0.01％)进行目标区域测序分析，捕获的是疾病的大部分致病突变信息，具有所需样本量少、费用低、通量高的优势，能够检测更多的样本，促进了遗传性耳聋新的致病变异的发现。

本发明选取的耳聋相关基因突变位点涵盖了中国人的常见热点突变，包括非综合征型的C1494T、A1555G与综合征型的A3243G、A8344G，还有其他常见突变点。该试剂盒的高通量性可较全面的筛查人群中的遗传和易感性线粒体耳聋基因，对于提高人口质量和造福社会有重大意义。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明涉及了可进行快速准确捕获耳聋相关基因序列的探针组，能够提高检测特异性，对捕获出目标区域的文库标本利用高通量测序技术使用HiSeq 2000测序，通量高、准确度高、成本低。

2、本发明灵敏度高，并由于该方法是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获，所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于传统的Sanger测序要高出许多。为全面准确进行耳聋相关基因检测提供了更好的平台。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、耳聋相关基因捕获试剂盒及其专用探针的制备

一、耳聋相关基因捕获探针的设计和制备

根据耳聋相关基因的全外显子序列，对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计。利用原位合成技术，大量合成设计的探针。

利用PCR的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，具体方法如下：

将上述合成的探针在总体积1.2ml的ddH₂O中，取其中5μl作DNA模板，利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA)，分三管进行PCR扩增，其中引物GACTACATGGGACAT为带有生物素标记的引物(序列114，序列115)。

上述PCR扩增体系：DNA模板，5μl；正向引物(25μM)，2μl；反向引物(25μM)，2μl；MgCl2(50mM)，4μl；10x Platinum Taq缓冲液(购自Life Technologies)，5μl；dNTPs(每种10mM)，4μl；Platinum Taq(5U/μl,购自Life Technologies)，1μl；H2O，27μl；总体积50μl。

PCR扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。

将PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(购自Qiagen，货号28006)纯化后，取5500ng，用MyOne亲和素磁珠(购自Invitrogen，货号65002将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来；然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的探针，作为捕获探针。

上述生物素标记的探针由核苷酸序列为1-113所示的探针组成，且每条探针的5'末端标记生物素基团。

二、耳聋相关基因捕获试剂盒的制备及使用方法

A、耳聋相关基因捕获试剂盒的制备

耳聋相关基因捕获检测试剂盒，是通过检测耳聋相关基因全基因组的突变来进行分子遗传学检测的试剂盒，该试剂盒包含的成分为：上述一获得生物素标记的探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、洗涤缓冲液WB3、文库富集洗脱液、中和缓冲液NE、PCR反应液。

1)生物素标记的探针组

生物素标记的探针由序列1-113所示的探针组成，且每个单链DNA分子的5’端均标记生物素。

2)富集缓冲液BL

富集缓冲液BL由35％(v/v)人cot-1DNA(Invitrogen货号：15279011)、15％(v/v)鲑鱼精DNA(Invitrogen货号：15634017)、0.5nmol/μl引物1、0.5nmol/μl引物2和水组成；

其中引物序列如下：

引物1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGATCT(序列116)

引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC(序列117)

3)富集缓冲液HY

富集缓冲液HY包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；具体由1.25MNaCl、0.125M柠檬酸钠、0.1g/100mL BSA、5％(v/v)Tween20和水组成；

4)文库富集结合缓冲液

文库富集结合缓冲液由1M NaCl、1mM EDTA和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液组成；

pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Tris的浓度为10M，HCl调节pH为7.5；

5)洗涤缓冲液WB1

洗涤缓冲液WB1为0.1％(质量体积比g：mL)的SDS溶液A；0.1％的SDS溶液A中的溶质为SDS，浓度为0.1％，溶剂为柠檬酸三钠缓冲液SSC；

上述柠檬酸三钠缓冲液SSC由175g/L NaCl、88g/L柠檬酸三钠和水组成；缓冲液pH为7.4；

6)洗涤缓冲液WB2

洗涤缓冲液WB2为0.1％(质量体积比g：mL)SDS溶液B；0.1％的SDS溶液B中的溶质为SDS，浓度为0.1％，溶剂为0.1×SSC；

0.1×SSC为将上述柠檬酸三钠缓冲液稀释10倍，得到的溶剂；缓冲液pH为7.4；

7)洗涤缓冲液WB3

洗涤缓冲液WB3为0.1％(质量体积比g：mL)SDS溶液C；0.1％的SDS溶液C中的溶质为SDS，溶剂为0.5×SSC；

0.5×SSC为将上述柠檬酸三钠缓冲液稀释2倍，得到的溶剂；缓冲液pH为7.4；

8)文库富集洗脱液

文库富集洗脱液为0.1M NaOH水溶液；

9)中和缓冲液NE

中和缓冲液NE为pH值为7.5且浓度为1M Tris-HCl水溶液；

pH值为7.5且浓度为1M Tris-HCl水溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Tris的浓度为1M，HCl调节pH为7.5；

10)PCR反应液

PCR反应液由0.05U/μl Phusion Hot Start II DNA Polymerase(Fermentas，货号EP090B011)、PCR mix buffer组成。其中PCR mix buffer是由0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、5％(v/v)DMSO、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、4mM MgCl2、500mMKCl、0.8％(v/v)Nonidet P40配制而成。上述引物3和引物4最后一位核苷酸均可带有硫代修饰，序列如下:

引物3：AATGATACGGCGACCACCGA*G(序列118)

引物4：CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(序列119)

*表示硫代修饰.

上述试剂盒可以按照如下表1所列组分制备：

表1为试剂盒组成

B、耳聋相关基因捕获试剂盒检测方法的建立

1、样本文库制备：

提取待测者外周血或组织的基因组DNA作为样本；将基因组DNA片段化至100-300bp的片段后，采用康为试剂发明的NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina试剂盒(货号：CW2585M)进行建库，得到DNA基因文库；建库主要步骤包括：DNA提取和打断、末端补平、加接头、PCR富集和纯化。

2、样本富集杂交

(1)杂交液制备：250ng DNA基因组文库、10ul富集缓冲液BL、5μl生物素标记的探针组混匀震荡离心，再加入37μl预热的富集缓冲溶液HY(65℃预热，使用前充分震荡重悬沉淀)。总体系100μl，离心进行PCR，PCR程序为95℃10分钟，65℃杂交22小时以上。

注：缓冲液HY的体积根据所制备文库体积调整而调整，调整比例为HY缓冲液体积＝总体积/1.8。

(2)纯化：此步骤所用的缓冲液除了WB2外，均室温放置。

1)取1.5ml离心管，加入50ul MyOne磁珠(购自Invitrogen，货号：65002)，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架上静置1分钟后弃上清；

2)取下离心管，加入50ul 1X文库富集结合缓冲液，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将将离心管放置在磁力架上1分钟，保持离心管在磁力架上不动，弃上清液；重复该步骤3次；

3)用100ul 2X文库富集结合缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，将过夜杂交后的所有液体全部加入，震荡混匀，翻转仪上翻转30min；

4)从翻转仪上拿下收集管，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；

5)加入500ul WB1，震荡混匀，翻转仪上翻转15min；

6)从翻转仪上拿下收集管，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；

7)加入500ulWB3，震荡混匀，66℃、850rpm孵育10min，震荡离心，在磁力架上静置1min，弃去液体；

8)重复步骤(7)三次，10)放置室温2min，震荡离心，放置磁力架静置1min，弃去上清；

9)加入500ul WB2，震荡离心，吸弃上清。

10)加入17.5ul文库富集洗脱液，加完后立即盖盖，震荡混匀，翻转仪上翻转15min；

11)震荡离心后，放置磁力架上静置1min，将澄清液转至一个干净的0.2ml管中，加入12.5ul中和缓冲液NE，震荡离心，得到30ul模板DNA。

3、样本PCR扩增

(1)PCR反应体系

将上述探针捕获后得到的30μl模板DNA加入30μl PCR反应液，补水40μl至总体系为100μl。

(2)PCR循环条件

98℃预变性30秒；15个循环：98℃25秒,65℃30秒72℃30秒；72℃5分钟；4℃～1h；

(3)PCR产物纯化：由DNA纯化回收试剂盒(CMpure)(购自康为试剂，货号CW2508)纯化，最终产物由65℃预热的文库富集洗脱液17.5μl分两次洗脱，最终得到35ul捕获产物；

注：不同的纯化方法获得的产物浓度会有差别。根据不同的纯化方法，可是适当调整PCR的循环数。

(4)捕获产物经1％琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop测浓度并做定量PCR。

4、将以上得到的捕获产物通过Illumina HiSeq2000进行测序，得到测序数据并进行分析，确定是否捕获耳聋相关基因或者确定具体的基因突变位点。

上述进行分析确定是否捕获耳聋相关基因或者确定具体的基因突变位点分析如下：

1)SNP分析流程

Illumina HiSeq 2000获取原始短序列；去除测序数据中的接头和低质量数据等；把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应位置上，具体请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，具体请参考：

http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；过滤低质量值(质量值<＝20)和低覆盖度(深度<＝10)的SNP；利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；

2)InDel分析流程

把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上，具体请参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对lnDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；

实施例2、试剂盒的应用

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明

1、一例耳聋相关基因的试剂盒捕获检测

样本编号为2018-1874,女，1岁，提取该患者的全血DNA样本，用实施例1的试剂盒及实施例1方法检测。

结果如表2所示。

表2一例耳聋相关基因的试剂盒捕获检测

2、一例耳聋相关基因的一代sanger测序进行了验证

样本编号为2018-1874,女，1岁，提取该患者的全血DNA样本，利用了一代sanger测序进行了验证，结果如表3所示。

表3一例耳聋相关基因的一代sanger测序验证结果

比对上述结果，可以看出，本发明试剂盒所得结果与sanger测序结果一致，说明本发明可对实际样本进行准确快速的检测，具有实际可利用价值。

注：与sanger测序相比，本发明通量高，效率高，灵敏度高，先用探针杂交捕获到目的基因，再用PCR扩增的方法增加目的基因的量。

本发明提供的用于耳聋检测的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司

<120>耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用

<160> 119

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gactacatgg gacattaaat tattatagag attatatttt aatgttttaa atgtatttga 60

tacattacaa aattatttta gttacaagca tatcattaaa gctattcttt attattacaa 120

aatgctttta caatgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactacatgg gacatctatt cttgacaaca ggaaaatact taccctcact gaaatatgtg 60

gagtaccatt ttttggaaac catgtcaagc ataatggcaa tattcaggtt caatcttcct 120

atagatctgc tcaattacgt cgtaggttcc 150

<210> 3

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gactacatgg gacatattta tctaaacctt agcttctatt cttttcacat gttattagct 60

atattttcac ttaaaaaatt ggaggctgaa ggggtaagca aacaaacttt tgaagtagac 120

aaagctcatc tttaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gactacatgg gacatatctg tttttaacga cagaaacttc tccctcccct gccccatttt 60

gtcctcccca ttaaatggta ctgtgtcaat aaaattccca agcgacctct ttaaatcagc 120

gttctttccg atgcttacgt cgtaggttcc 150

<210> 5

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactacatgg gacatggcta ccacagtcat ggaaaaggga gatgtgttgg acaggcctgt 60

cattacaggt agtagttggt ggtacatcca gtctgtattt cttacacaaa attacatcta 120

aatatttgac atgagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 6

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gactacatgg gacatgccat ttgctatcat aagccatcac taggaacttc tagtctgtct 60

cactcgattg aggctacaat gttgttaggt gctatgacca caatgaatac aacagacagc 120

ctctcagctg tgctgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 7

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gactacatgg gacatcaaag tattcataac caaaagacca tatttcaaat taaatcatag 60

tagcgaatga cataccattt acatattaca atctgagcct ctgaaacagg gggaacatat 120

aatggtatcc agaactacgt cgtaggttcc 150

<210> 8

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactacatgg gacatgtttg ttcacacccc ccaggatcgt ctgcagcgtg ccccaatcca 60

tcttctactc tgggcggttt gctctggaaa agacgaatgc acacaacaca ggaatcacta 120

gctaggacag aacagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 9

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gactacatgg gacattggac acgaagatca gctgcagggc ccatagccgg atgtgggaga 60

tggggaagta gtgatcgtag cacacgttct tgcagcctgg ctgcagggtg ttgcagacaa 120

agtcggcctg ctcattacgt cgtaggttcc 150

<210> 10

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gactacatgg gacatacttc ctcttcttct catgtctccg gtaggccacg tgcatggcca 60

ctaggagcgc tggcgtggac acgaagatca gctgcagggc ccatagccgg atgtgggaga 120

tggggaagta gtgattacgt cgtaggttcc 150

<210> 11

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gactacatgg gacatgaaag taccttacac caataacccc taacagcctg gggtctcagt 60

ggaactaact taagtgaaag aaaattaaga caggcataga attaggcctt tgttttgagg 120

ctttagggga gcagatacgt cgtaggttcc 150

<210> 12

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gactacatgg gacatgctcc attgtggcat ctggagtttc acctgaggcc tacaggggtt 60

tcaaatggtt gcatttaagg tcagaatctt tgtgttggga aatgctagcg actgagcctt 120

gacagctgag cacggtacgt cgtaggttcc 150

<210> 13

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gactacatgg gacatgttgc ctcatccctc tcatgctgtc tatttcttaa tctaacaact 60

gggcaatgcg ttaaactggc ttttttgact tcccagaaca atatctaatt agcaaataac 120

acaattcagt gacattacgt cgtaggttcc 150

<210> 14

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gactacatgg gacattcagc aggatgcaaa ttccagacac tgcaatcatg aacactgtga 60

agacagtctt ctccgtgggc cgggacacaa agcagtccac agtgttggga caaggccagg 120

cgttgcactt caccatacgt cgtaggttcc 150

<210> 15

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gactacatgg gacatgccgc tgcatggaga agccgtcgta catgacatag aagacgtaca 60

tgaaggcggc ttcgaagatg acccggaaga agatgctgct tgtgtaggtc caccacaggg 120

agccttcgat gcggatacgt cgtaggttcc 150

<210> 16

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gactacatgg gacatccttc tgggttttga tctcctcgat gtccttaaat tcactcttta 60

tctccccctt gatgaacttc ctcttcttct catgtctccg gtaggccacg tgcatggcca 120

ctaggagcgc tggcgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 17

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gactacatgg gacattggac acgaagatca gctgcagggc ccatagccgg atgtgggaga 60

tggggaagta gtgatcgtag cacacgttct tgcagcctgg ctgcagggtg ttgcagacaa 120

agtcggcctg ctcattacgt cgtaggttcc 150

<210> 18

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gactacatgg gacatctccc cacacctcct ttgcagccac aacgaggatc ataatgcgaa 60

aaatgaagag gacggtgagc cagatctttc caatgctggt ggagtgtttg ttcacacccc 120

ccaggatcgt ctgcatacgt cgtaggttcc 150

<210> 19

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gactacatgg gacatggatc ataatgcgaa aaatgaagag gacggtgagc cagatctttc 60

caatgctggt ggagtgtttg ttcacacccc ccaggatcgt ctgcagcgtg ccccaatcca 120

tcttctactc tgggctacgt cgtaggttcc 150

<210> 20

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gactacatgg gacatggttt gctctggaaa agacgaatgc acacaacaca ggaatcacta 60

gctaggacag aacagggaga cttctctgag tctgggtaag caagcatgct taaatctctt 120

cctgagcaaa caccatacgt cgtaggttcc 150

<210> 21

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gactacatgg gacatactct tacacaacct caccaaaaca ggtgaagaca gaaccaactt 60

agtttgtcat aggattaaat gtatagttcc caaaccctct tgaacgtgtt tttaggtgtt 120

ctctgataaa aagtatacgt cgtaggttcc 150

<210> 22

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gactacatgg gacatgcttg ttcacctgag taattcaccc aatctttaaa cacatcataa 60

aaatttgctg tgctggggag tgtcataaag tcctcgttag ctgaaaggca ctcaggggtt 120

ctgaccgtac ccctgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 23

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gactacatgg gacatcatcc tctgcagagc ttccttgggt cttcctgact ctgcagaagt 60

tactcagcgt tcaacagctg catccatttg cagtctcaag ttttggctgt accactgggg 120

ccgatactag cttggtacgt cgtaggttcc 150

<210> 24

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gactacatgg gacatgccaa ccttgctcaa aggctgagag gccaagtaca ggagaaccgt 60

gaggataaga tgtctagtct ctctgctgag ccactttcct taatgtcttg aatgaatttt 120

cacagacgtg gcatgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 25

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gactacatgg gacattagca gtgaaactgt tgttaccagt ggttaagttt acatttgagg 60

caccccgagt taaaatttta caaaggacct tgcttcctcc tacgtgaaag gaagaggtta 120

ggaatgccct cttcatacgt cgtaggttcc 150

<210> 26

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gactacatgg gacattggag aaaagccact gtgagcacag actttcgtgt aggctttgtg 60

gatggcttgg tggcctcact gtcaggctgg cactgatggc tcagttagca tatctgtttt 120

gataagtgct gcaactacgt cgtaggttcc 150

<210> 27

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gactacatgg gacatcgtgt aggctttgtg gatggcttgg tggcctcact gtcaggctgg 60

cactgatggc tcagttagca tatctgtttt gataagtgct gcaacagtgc attataattg 120

tgggctgtgg ttttatacgt cgtaggttcc 150

<210> 28

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gactacatgg gacatatttc aaagtgtttc ttaaaagaca cattatttta aaatgacaga 60

aaattcaact ccctcggtta ctggcccagc taagcgacgt cactgcattg cagttcagcg 120

ctgaagcttg ggagatacgt cgtaggttcc 150

<210> 29

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gactacatgg gacatgtccc acactcctta ctgcaagcgg atgtggagag gccagtggat 60

aatctcctgt gagcccatgg ccttcttttc atcccaggat gtgaattgtc ttcactgatt 120

catagttaca ccctgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 30

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gactacatgg gacatcctgc cacaaccaac gctctcctaa acaagattcc accctctcca 60

caatccggat gaatcatctc ttttccaccc ttcagagctg gtagtgaatc ctccttcttc 120

tttttcttaa aagcatacgt cgtaggttcc 150

<210> 31

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gactacatgg gacattcctc ctctcctcat tttaggcaag ttgcatcccg ttttctgatg 60

gactccagaa gcaggctcgt agtgaatgtc tttcatgacc cacagtcgct gccacggggc 120

accaaggtca ggcagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 32

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gactacatgg gacataaacc atccagtgcc accttggtca gaggctaaca ggagagaggt 60

ggccacgaaa gttacatcag attgacatag gcctgtgaaa catttagctt cactgagctt 120

gggaaagaca acatctacgt cgtaggttcc 150

<210> 33

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gactacatgg gacatattgg aaaaaacaat attttagccc aggttcagca ctgacccatt 60

gataatccag actgggaggc ccttaggtga gctggttgtc ctgctacagc acccacagct 120

caggccagtc ccgtctacgt cgtaggttcc 150

<210> 34

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gactacatgg gacatccaac agcagaacca ccgaggacag caacattccg attttaacaa 60

aagcatctta tggaattaga cattcttcat tggccctcac tgagtggaaa acaggatact 120

ccccgaagta aactctacgt cgtaggttcc 150

<210> 35

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gactacatgg gacattctcc tggtttacaa caatacacct ggccaagaat atggggctgc 60

aggaggaggg gtttatcctt tgccctcttc cacctgccaa acccaggtca tacacccttc 120

tacagacctg tccagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 36

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gactacatgg gacatttacc atcagctgag aaaaatacag ttccgagaaa ccctatattg 60

ttattttata aagcttgagt tgaagctacc tgttttaaag atcctttttc aggaagagga 120

gtaaattaag atttatacgt cgtaggttcc 150

<210> 37

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gactacatgg gacatctccc caatgggcta gggggtcatg ggttaagagg ggctcagaag 60

caggacgaag ttgttttcaa tattcaagtc agaggaggag ctgccctcct ggcctcccga 120

ccctgggcgg ttacatacgt cgtaggttcc 150

<210> 38

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gactacatgg gacattgcag cttcctaccg ggcccacgcc atcctgcacc gcctggaggg 60

ctgccagagg ccagcggagg agttggttca gttccttagg gaagacacta ggtgaatcac 120

caggatccag aaaagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 39

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gactacatgg gacatgcaaa agggactctt caccccttaa atttctccac ccttaggtga 60

tgggtggtcg accttgcctg gctgtcccca gagggttcct ccacccttct caccagtgtc 120

tgaaattgtg accgatacgt cgtaggttcc 150

<210> 40

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gactacatgg gacatctgtg cacagcagtt tcgaaaggga ctctaaggtc acatggggac 60

acggccgtac cacgcttctc aaggcagtcc caggtgcatg gccacggaac ccagctctca 120

gcagctgtta gttagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 41

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gactacatgg gacatgtgag cgctgttcgg gctgccttcc tcctccagtg gggcaggatc 60

gaggcactga tggaaccgtc ctgaggacgc gggtctcagc cgcacaccac ctcttcgcga 120

acaagggtcc taaaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 42

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gactacatgg gacatatttt ccttctaggc ggggagcaca gcccggaaac agaccctcgt 60

gaagtgttta ggaaaaaggg aagccactga aatcttggcc ccggggtagg ccgggatcgg 120

ctggctccgc gttagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 43

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gactacatgg gacatttcta ggcaaactcc gcccaaatct ctgcccgggg atttttctgc 60

agaagccgct ccaagaggta aaggtcagtt cctgcagcga aggcttcctg cttcaccggc 120

gaaacggagc tttgctacgt cgtaggttcc 150

<210> 44

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gactacatgg gacatttcga agctaagctt tcggtgaatt taaaacgttt ggtggcagtg 60

ggtcaagtag ccaggcggct gcgctagagt accccgaagg gacatcggcg acaccacaaa 120

cctcgcgctg gcggctacgt cgtaggttcc 150

<210> 45

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gactacatgg gacattcgcc cgcgcctttt tcccctcccg cgcgcgcccg gccccactcg 60

caccccgggc ggtgccatcg cgtccacttc cccggccgcc ccattccagc tccggagctc 120

ggccgcagaa acgcctacgt cgtaggttcc 150

<210> 46

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gactacatgg gacatcgctc cagaaggcgg cccccgcccc ccggcccaag gacgtgtgtt 60

ggtccagccc cccggttccc cgagacccac gcggccgggc aaccgctctg ggtctcgcgg 120

tccctccccg cgccatacgt cgtaggttcc 150

<210> 47

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gactacatgg gacatggttc ctggccgggc agtccggggc cggcgggctc acctgcgtcg 60

ggaggaagcg cggcggggcc ggggcggggg tctcggcgtt ggggtctctg cgctggggct 120

cctgcgctcc taggctacgt cgtaggttcc 150

<210> 48

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gactacatgg gacatgggtc ctgggccggg cgccgccgag gggctccgag tcggggagag 60

gagcgcgcgg gcgctgcggg gccgcaacac ctgtctcccg ccgtggcgcc ttttaaccgc 120

accccacacc ccgcctacgt cgtaggttcc 150

<210> 49

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gactacatgg gacattcttc cctcggagac tgggaaagtt acggaggggg cggcgccgcg 60

ggcggagcgc gcccggcctc tgggtcctca gagcttcccg ggtccgcgaa cccccgaccg 120

cccccgtacg tcgtaggttc c 141

<210> 50

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gactacatgg gacatcctct aattctctca ggtaggcacg gcccccacca ggcgccatgg 60

actggaagac actccaggcc ctactgagcg gtgtgaacaa gtactccaca gcgttcgggc 120

gcatctggct gtccgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 51

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gactacatgg gacatagccc ggctgcacca acgtctgcta cgacaactac ttccccatct 60

ccaacatccg cctctgggcc ctgcagctca tcttcgtcac atgcccctcg ctgctggtca 120

tcctgcacgt ggccttacgt cgtaggttcc 150

<210> 52

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gactacatgg gacattgtgg tggacctacc tgttcagcct catcttcaag ctcatcattg 60

agttcctctt cctctacctg ctgcacactc tctggcatgg cttcaatatg ccgcgcctgg 120

tgcagtgtgc caacgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 53

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

gactacatgg gacattcacc tacttcatgg tgggcgcctc cgccgtctgc atcgtactca 60

ccatctgtga gctctgctac ctcatctgcc acagggtcct gcgaggcctg cacaaggaca 120

agcctcgagg gggtttacgt cgtaggttcc 150

<210> 54

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gactacatgg gacattctgc atcgtactca ccatctgtga gctctgctac ctcatctgcc 60

acagggtcct gcgaggcctg cacaaggaca agcctcgagg gggttgcagc ccctcgtcct 120

ccgccagccg agctttacgt cgtaggttcc 150

<210> 55

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gactacatgg gacatgctac ctcatctgcc acagggtcct gcgaggcctg cacaaggaca 60

agcctcgagg gggttgcagc ccctcgtcct ccgccagccg agcttccacc tgccgctgcc 120

accacaagct ggtggtacgt cgtaggttcc 150

<210> 56

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gactacatgg gacatgcagc ccctcgtcct ccgccagccg agcttccacc tgccgctgcc 60

accacaagct ggtggaggct ggggaggtgg atccagaccc aggcaataac aagctgcagg 120

cttcagcacc caacctacgt cgtaggttcc 150

<210> 57

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gactacatgg gacataggct ggggaggtgg atccagaccc aggcaataac aagctgcagg 60

cttcagcacc caacctgacc cccatctgac cacagggcag gggtggggca acatgcgggc 120

tgccaatggg acatgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 58

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gactacatgg gacattaaac tgagagtaga gtgcttagtt gaacagggcc ctgaagcgcg 60

tacacaccgc ccgtcaccct cctcaagtat acttcaaagg acatttaact aaaaccccta 120

cgcatttata tagagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 59

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gactacatgg gacatccctc ctcaagtata cttcaaagga catttaacta aaacccctac 60

gcatttatat agaggagaca agtcgtaaca tggtaagtgt actggaaagt gcacttggac 120

gaaccagagt gtagctacgt cgtaggttcc 150

<210> 60

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gactacatgg gacatcaagc tgcaggcttc agcacccaac ctgaccccca tctgaccaca 60

gggcaggggt ggggcaacat gcgggctgcc aatgggacat gcagggcggt gtggcaggtg 120

gagaggtcct atacgtcgta ggttcc 146

<210> 61

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

gactacatgg gacattggag tggctcccca aataccgagt caaggaatgg ctgcttagtg 60

acgtcatttc gggagttagt actgggctag tggccacgct gcaaggtaag atgttggcag 120

attgagagtt ctggttacgt cgtaggttcc 150

<210> 62

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

gactacatgg gacattcagc cttcccggtt cgggaaaggg gaagaatgca ggaggggtag 60

gatttctttc ctgataggat cggttgggaa agaccgcagc ctgtgtgtgt ctttcccttc 120

gaccaaggtg tctgttacgt cgtaggttcc 150

<210> 63

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

gactacatgg gacatccgta aataaaacgt cccactgcct tctgagagcg ctataaaggc 60

agcggaaggg tagtccgcgg ggcattccgg gcggggcgcg agcagagaca ggtgagttcg 120

ccctgaagat gcccatacgt cgtaggttcc 150

<210> 64

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gactacatgg gacatcactg cagctagaga tacagctaga gtcctgattg ccagtgccct 60

gactctgctg gttggaatta tacaggtaat gaacttacaa gtaaaatata gatggatgta 120

atttttattt gaaattacgt cgtaggttcc 150

<210> 65

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

gactacatgg gacatgcccg gcccgggctc cactcccggg gaggcctcga gggttgcgga 60

tgggactctt aagtggtcac ggatcaggtg ggcagggggc agtacagctt tctttctgag 120

acgccgagag cgaactacgt cgtaggttcc 150

<210> 66

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gactacatgg gacatgcgtc ccgggtcagg tgcggggagg gagggaatct cagtgtcccc 60

ttccagcctt gcaagcgcct ttggcccctg ccccagcccc tcggtttggg ggagatttca 120

gaacgcggac agcgctacgt cgtaggttcc 150

<210> 67

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gactacatgg gacatgcgga ccagactcgc ggtgcagggg ggcctggctg cagctaacag 60

gtgatcccgt tctttctgtt cctcgctctt cccctccgat cgtcctcgct taccgcgtgt 120

cctccctcct cgctgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 68

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gactacatgg gacataggat cgttgtcatc cagtctcttc cttaggaatt cattgccttt 60

gggatcagca acatcttctc aggattcttc tcttgttttg tggccaccac tgctctttcc 120

cgcacggccg tccagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 69

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gactacatgg gacatgctgc agctaacagg tgatcccgtt ctttctgttc ctcgctcttc 60

ccctccgatc gtcctcgctt accgcgtgtc ctccctcctc gctgtcctct ggctcgcagg 120

tcatggcagc gccagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 70

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

gactacatgg gacatattga agaacctcaa ggagtgaaga ttcttagatt ttccagtcct 60

attttctatg gcaatgtcga tggttttaaa aaatgtatca agtccacagt aagtatttta 120

tccctagaaa tttgttacgt cgtaggttcc 150

<210> 71

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gactacatgg gacatcgcgc gggcctgcgt agagagaagc ggagcggggc gtccacgcct 60

tggggaggga agggcgtccc cagcgggcga gagtggggtg cgggcggcgg agcccctggg 120

cgccagctgc ttctctacgt cgtaggttcc 150

<210> 72

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gactacatgg gacataggag tccttgaaac actcaagcta agtaggcggg ctaccattca 60

gttagagacc aggatgcaag ctagaaccca ggggagcgcg gggtgtgcca agtacttcat 120

cagcaggctg tgggatacgt cgtaggttcc 150

<210> 73

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gactacatgg gacatcaatc catagccttg tgcttgactg tggagctata tctttcctgg 60

acgttgttgg agtgagatca ctgcgggtgg taaggttctg gttttctgaa ttatacattt 120

ggagctttgg caatatacgt cgtaggttcc 150

<210> 74

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gactacatgg gacattcact gcgggtggta aggttctggt tttctgaatt atacatttgg 60

agctttggca atagtaaaat gatgtgggtt gtccagtatt gcaacagggc aaatacatgg 120

gctttgtaat ttttctacgt cgtaggttcc 150

<210> 75

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gactacatgg gacatattag aaaggacaca ttctttttga cggtccatga tgctatactc 60

tatctacaga accaagtgaa atctcaagag ggtcaaggtt ccattttaga aacggtaaat 120

attcaacctt tctactacgt cgtaggttcc 150

<210> 76

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

gactacatgg gacatatgat gctatactct atctacagaa ccaagtgaaa tctcaagagg 60

gtcaaggttc cattttagaa acggtaaata ttcaaccttt ctacagatgt atcttttcta 120

aactatcatg atttctacgt cgtaggttcc 150

<210> 77

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

gactacatgg gacatttggc aaaagcatgg taagcacttc agggttatta ttttccagga 60

aatacttatc ctttttccaa atagttataa acatcagcag aatccagttc ataactttgt 120

gatttgcaaa ttggttacgt cgtaggttcc 150

<210> 78

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gactacatgg gacatattat tttccaggaa atacttatcc tttttccaaa tagttataaa 60

catcagcaga atccagttca taactttgtg atttgcaaat tggttgtgac tgagattgga 120

ttgaaaaccc agttttacgt cgtaggttcc 150

<210> 79

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

gactacatgg gacatcaaat agttataaac atcagcagaa tccagttcat aactttgtga 60

tttgcaaatt ggttgtgact gagattggat tgaaaaccca gttttcttgc tttttgacag 120

ttgttcaaga aagagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 80

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

gactacatgg gacatagatg ttggcagatt gagagttctg gtctccagca ggagtttaac 60

acttctcccc agctaccata ggtctgtgac agatggttgc ttacccttca aggcctgtat 120

ctttcctgta gagcctacgt cgtaggttcc 150

<210> 81

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

gactacatgg gacatatagg tggttatttg ttcttttata aactgagttc ataccataat 60

attcccataa gcatcttaga aatctgttgt atagttggtg cctagcagca tggcattctc 120

ctctgtcccc tatcctacgt cgtaggttcc 150

<210> 82

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

gactacatgg gacatagttc cccttttcca ggcatattaa gaactgcaga gcccagtttg 60

gggaaatgga agtttgagaa ggacttgaaa aatgtccata tgaaatagac aagttgtgct 120

ttcatcccct gctcctacgt cgtaggttcc 150

<210> 83

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

gactacatgg gacattatgc tggctaccta agtatttaac caaggaaaag aatgtcatta 60

tcctcttcta accctcatgt aaactagaat gttgatttct ctatagccag gcattaatgg 120

gtctgggggc tgctgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 84

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gactacatgg gacatcatac tgtaactttg gtttgtgaat gtaatcactt tgcatgtgct 60

ttcagggatg gcatatgccc tactagctgc agttcctgtc ggatatggtc tctactctgc 120

ttttttccct atccttacgt cgtaggttcc 150

<210> 85

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

gactacatgg gacattaaat cactaatatt agaagactgg caaaatctta ccaaaacaat 60

ttagaagcta agcttggctt tctttcttgg tatggcttat aataagtttt cctgctattc 120

ctaaaatttg aattctacgt cgtaggttcc 150

<210> 86

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

gactacatgg gacatatctt acagattgac atttgatatg aaaaaatgtt ttgtcttaca 60

aaaagagaaa gaaacttcat actccctttg ctgttttttt aatcctaact tcgaccctgt 120

gatattgatc aaggttacgt cgtaggttcc 150

<210> 87

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

gactacatgg gacatatgga actgtattaa atactactat gatagacact gcagctagag 60

atacagctag agtcctgatt gccagtgccc tgactctgct ggttggaatt atacaggtaa 120

tgaacttaca agtaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 88

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

gactacatgg gacatatttt tttctaccag tatttttgtg ctataggcag gctactagtg 60

ttttcattgg tattaagctt gatgtaatat ttccagagag taggtttcta tctcaggcaa 120

acatttaatt tttcttacgt cgtaggttcc 150

<210> 89

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

gactacatgg gacatgcagg ctactagtgt tttcattggt attaagcttg atgtaatatt 60

tccagagagt aggtttctat ctcaggcaaa catttaattt ttctttcctt ttccttatcg 120

tagttgatat ttggttacgt cgtaggttcc 150

<210> 90

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

gactacatgg gacataggca gaataacata gtgaataaga tcatgaaggc agaataacat 60

agtgaataag atcatgaagg cagaataaca tagtgaataa gatcatgaag gcagaataac 120

atagtgaata agatctacgt cgtaggttcc 150

<210> 91

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

gactacatgg gacatattga gtttattatt attattatca cagatgaata gacctcatga 60

agctcgccgt tcatttcctc gggacccagc ctattaggaa acattagcaa aagtttttga 120

ttcagcatta tatggtacgt cgtaggttcc 150

<210> 92

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

gactacatgg gacatggtta aatgagccgc ttagtctctg aacagagaat tttgcttatg 60

acattaccat tgcaattata catgaaagaa tccttcaata aatgcagagt agtagaggat 120

tctcccagaa aagactacgt cgtaggttcc 150

<210> 93

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

gactacatgg gacatgtttt atttcagacg ataattgcta ctgccatttc atatggagcc 60

aacctggaaa aaaattacaa tgctggcatt gttaaatcca tcccaagggg gtgagtgtgg 120

tgttcctctt agtactacgt cgtaggttcc 150

<210> 94

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

gactacatgg gacatattca gttccaatag taaactgatc aattttctca tacacattat 60

tgggcataat tttttcttac ggtttcataa acacaggtaa tcctgggcaa gaacaaagaa 120

attatctaaa tgaaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 95

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

gactacatgg gacatctcat acacattatt gggcataatt ttttcttacg gtttcataaa 60

cacaggtaat cctgggcaag aacaaagaaa ttatctaaat gaaattgtcc taaaattttc 120

caaacacagc aggaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 96

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

gactacatgg gacatattat ataatataat cttatcttat tatataatat aatcttatct 60

tattatataa tataatctta tcttattata taatataatc ttataatata atcttaactt 120

attatataat ataattacgt cgtaggttcc 150

<210> 97

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

gactacatgg gacatataaa ctataagatg ctccattatt ttatcttcct ataaaatatg 60

tctataaaaa agctcattta aagaaaagtt accttcactg tgagattgtc tcaaagaaat 120

gtctcaaaga taccttacgt cgtaggttcc 150

<210> 98

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

gactacatgg gacatagcag caggaagtat ataaaattat tttcttttta tagacgctgg 60

ttgagatttt tcaaaatatt ggtgatacca atcttgctga tttcactgct ggattgctca 120

ccattgtcgt ctgtatacgt cgtaggttcc 150

<210> 99

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

gactacatgg gacattcagc attatttggt tgacaaacaa ggaattatta aaaccaatgg 60

agtttttaac atcttttgtt ttatttcaga cgataattgc tactgccatt tcatatggag 120

ccaacctgga aaaaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 100

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

gactacatgg gacatagagt aaaagatcaa ggtccttcat tcatctctgt caccttccag 60

ttttgtgacc tgaggagatt ctcctatata agacaaggat aatgaaaaca gccgaagcct 120

caactcaagc ttatttacgt cgtaggttcc 150

<210> 101

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

gactacatgg gacatcaaca aaggccttgg ttatctgatc tcacttggta gcacagaagc 60

aattctgatg atattaacaa acctgaaaaa gaaagggagt ggagagattg gaaaaaagca 120

agcagagttt taaagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 102

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

gactacatgg gacattcttt tcagataagt gtgtgttcac atgctcactc ccttgggctc 60

ttcatagtgt tgtcttatga tcaggcctga catgcttggc tggggccaaa caggcccact 120

gagcaaaaaa tttggtacgt cgtaggttcc 150

<210> 103

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

gactacatgg gacatggaca cagtcgaaga gaccacacca agcagatggg cacaagagac 60

agactcagga attttgcttc tgtctcttat gccttgaggt ccttatcttc ccaacacaga 120

aagaactatt atttatacgt cgtaggttcc 150

<210> 104

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

gactacatgg gacatcccat atctcttctc caatcagcag ggcctatatt aagaagcctc 60

ctgtactctc ttctttccac aaatgcttat ttagcacctc cacgctatca agtgctgtgc 120

tattgagcgc tggattacgt cgtaggttcc 150

<210> 105

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

gactacatgg gacatgaatt gatgtgaatg tgtattttgc atcacttcaa ggtaaataca 60

tatatctaca tatctacctg taagactttc ccgtaagccc tttctcctat ctgggactgt 120

ggtcacatta tgtcttacgt cgtaggttcc 150

<210> 106

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

gactacatgg gacattttat tttactatgt gcctgtgcct tgcatgaccc caggatgggc 60

acagctgctt ggcccctgag ccaccgaagg ctgctctact ccttcgttct ggctactaaa 120

agctgcaaag ctctgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 107

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

gactacatgg gacattttct tttcctagga actaacaaaa cattgtgtct ttcttttgaa 60

gattatgtga tagaaaagct ggagcaatgc gggttctttg acgacaacat tagaaaggac 120

acattctttt tgacgtacgt cgtaggttcc 150

<210> 108

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

gactacatgg gacattatat atttggagtt gctttgaaaa tgtccttttc catgcaaaac 60

acaaagccaa aattgtcgtt ggtttcctct gtgtagaaga ttaaattaca tgccacctct 120

aaacagtaga gcttttacgt cgtaggttcc 150

<210> 109

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

gactacatgg gacatgtatg atcattttct tctgaagaaa atatttgaat tacattttga 60

ataattagag taatacaaat agtgaatata tctgattaag aactgtcagg gaacataatt 120

cccccaaatg cagaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 110

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

gactacatgg gacatatttc tattgtgatg atatacacct aagatgagta gcagtaagca 60

atcaatacta taaaaacata tttataaaaa agataatgca gacttaagga gaattcagtt 120

gtatcaacac tttgttacgt cgtaggttcc 150

<210> 111

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

gactacatgg gacatagtag cagtaagcaa tcaatactat aaaaacatat ttataaaaaa 60

gataatgcag acttaaggag aattcagttg tatcaacact ttgttttccc cttgcttcca 120

caggctatgc gtacatacgt cgtaggttcc 150

<210> 112

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

gactacatgg gacattactt tggataataa attggagttt taaaaatgca aatttgctta 60

gtatctaata atgaagtgtt attacatata gccggaattg aggatctctt tgatcctgga 120

aatggtttac ctaaatacgt cgtaggttcc 150

<210> 113

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

gactacatgg gacattacgt tttacaacaa ggctagagtt tgtaaattct gggttcattt 60

gtgatgacat aagtcagcaa actgcgggaa tactgtctct tctatgtatt ttgtgaatag 120

taagcataat tttagtacgt cgtaggttcc 150

<210> 114

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

gactacatgg gacat 15

<210> 115

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

ggaacctacg acgta 15

<210> 116

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct 50

<210> 117

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc 50

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

aatgatacgg cgaccaccga g 21

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

caagcagaag acggcatacg a 21

Claims (9)

1.一种耳聋相关基因捕获的捕获探针，为由序列表中序列1至序列113所示的探针组成。

2.根据权利要求1所述的捕获探针，其特征在于：所述每条探针均标记生物素。

3.一种耳聋相关基因捕获的试剂盒，包括权利要求1或2所述的捕获探针所示的组分1）。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：

2）富集缓冲液BL，其包括人cot-1 DNA、鲑鱼精 DNA、引物 1和引物 2；

所述引物1的核苷酸序列为序列116；

所述引物2的核苷酸序列为序列117；

3）富集缓冲液HY，包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；

4）文库富集结合缓冲液，包括 NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；

5）洗涤缓冲液WB1，包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；

6）洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；

7）洗涤缓冲液WB3，包括SDS和2倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；

8）文库富集洗脱液，其为NaOH水溶液；

9）中和缓冲液NE，其为Tris-HCl缓冲液；

10）PCR反应液，包括引物3和引物4；

所述引物3的核苷酸序列为序列118，所述引物4的核苷酸序列为序列119，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰。

5.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备捕获待测样本中耳聋相关基因的产品中的应用；所述耳聋相关基因为GJB2、GJB3或SLC26A4。

6.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备测序待测样本中耳聋相关基因产品中的应用；所述耳聋相关基因为GJB2、GJB3或SLC26A4。

7.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备检测或预测待测者是否患有耳聋产品中的应用。

8.一种捕获待测样本中耳聋相关基因的方法，包括如下步骤：

利用权利要求1或2所述的捕获探针对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；实现捕获待测样本中耳聋相关基因；

所述耳聋相关基因为GJB2、GJB3或SLC26A4；

所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。

9.一种测序待测样本中耳聋相关基因或基因突变位点的方法，包括如下步骤：

1）利用权利要求1或2所述的捕获探针对待测样本的基因组DNA进行捕获，得到捕获片段；

2）用所述权利要求4所述的试剂盒中的PCR反应液进行扩增，得到测序文库；

3）对所述测序文库进行测序，得到待测样本中耳聋相关基因或基因突变位点的测序结果；

所述耳聋相关基因为GJB2、GJB3或SLC26A4；

所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。