CN105256051A - 一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组及试剂盒,可最多同时检测172个疾病相关的致病/易感基因,可以为患病个体分子遗传学诊断、先天性巨结肠高发区人群普查、筛查先天性巨结肠家属中的发病高危人群以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及分子遗传学领域,具体的说,涉及一种用于先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的个性化捕获、测序的探针组及试剂盒。
背景技术
先天性巨结肠(Hirschsprungdisease,HSCR)又称肠无神经节细胞症,是导致功能性肠梗阻的最常见的小儿消化道畸形,属典型肠神经系统先天发育异常性疾病。主要临床表现是胎粪排出延迟或无胎粪排出,继发腹胀及肠梗阻。我国属高发病率国家。目前我国统计活产儿发病率约为1/3,000,男性明显高于女性(约4:1),即每年有近5500名新生儿会出现该种出生缺陷,仅次于先天性肛门直肠畸形。研究表明70%的HSCR患儿为单纯型,另有12%合并常染色体疾病,18%合并其他器官、系统先天畸形,即常常以综合征的形式出现。目前推测先天性巨结肠是一种多因素参与的复杂疾病,其发生、发展与遗传因素及环境因素密切相关。患者亲属的患病风险显著高于一般正常人群(最多可高至正常人群的200倍),因此寻找、确定首诊患者的致病/易感基因对于家庭其他成员的再发风险评估乃至遗传咨询都至关重要。
新生儿HSCR患者因临床表现多样、发病轻重程度不一、伴发症状各异,非常容易漏诊造成严重后果;虽然近年来外科治疗手段的不断改进使得本病死亡率大大降低,但仍有很多患儿在治疗后出现一系列并发症,造成进一步处理困难甚至是难以矫治的遗留问题,严重影响患儿健康,给社会和家庭带来了沉重的经济负担。另一方面,约有30%的患儿由于伴发其他器官、系统异常,可表现为严重的出生缺陷,或随着患儿的生长发育逐渐表现出神经系统、内分泌、颅面部、心脏结构、泌尿生殖系统和色素组织等多种异常,显著影响患儿的生活质量乃至危及生命。鉴于此,寻求疾病的致病/易感基因并对患儿家庭进行细致、精确的遗传咨询,以及判断有无伴发其他畸形对指导疾病治疗和判断预后很有意义,同时对完善疾病病因学假说也有很大帮助。近年来通过连锁分析、全基因组关联分析研究(Genome-wideassociationstudies,GWAS)、基因敲除以及动物模型研究发现并确定了15个与HSCR相关的致病基因,可以解释部分表型与基因型之间的关联。尽管如此,在所有已知致病基因累积发现的突变仅能解释不足10%的患者的发病原因,高度提示其他致病/易感基因或危险因子的存在。目前对于已知HSCR致病基因的检测,只能在确定目标检测基因后采用逐一设计引物、PCR扩增、Sanger法测序、与reference序列比对的方法进行,费时费力且检测费用不菲;而对于在已知致病基因没有发现严重突变的患儿,其分子遗传学诊断往往难以确立,这些都对遗传咨询及许多相关问题的解决造成了巨大的障碍。
过去十五年人类在分析单独个体基因组的课题上投入了大量精力,也取得了显著的成果。最初分析一个单独个体的若干目标基因需要耗时几个月,费用高达上万美元。然而现在,这种检测已经变成了越来越简单的一个过程。基因组序列测定的费用越来越低,收集个体样本遗传信息的速度也越来越快。第二代高通量测序技术(next-generationsequencingtechnology)具有快速、准确、低成本的优点,可同时对多个基因的各种类型突变进行检测,已经被广泛应用于遗传缺陷的病因检测和分子遗传学诊断,然而到目前为止,一直尚未有专门针对巨结肠及相关疾病的致病/易感基因检测的高通量探针、芯片或试剂盒,使得本病相关领域的进展严重滞后,发病率高居不下,遗传咨询和必要的产前干预措施无法施行,不仅给患者和其家庭带来的巨大的痛苦和沉重的经济负担,也严重阻碍了我国整体人口素质的大幅度提高。
综上所述,开发一种高效、准确、快速、低价的HSCR试剂盒,用于先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的基因筛查和分子遗传学诊断,意义非常重大。
发明内容
本发明的目的在于,通过结合大量数据库检索、对患者基因测序结果进行筛选、小鼠疾病模型症状比对,筛选出172个先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因,根据这些致病/易感基因提供一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组及试剂盒,可最多同时检测172个疾病相关的致病/易感基因,可以为患病个体分子遗传学诊断、先天性巨结肠高发区人群普查、筛查先天性巨结肠家属中的发病高危人群以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。
一方面,本发明提供一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组,所述探针组包含能同时特异性捕获15个HSCR及相关综合征致病基因的探针,所述HSCR及相关综合征致病基因为RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2。
优选的,本发明提供一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组,所述探针组包含能同时特异性捕获下述34个基因的探针:
1、上述15个HSCR及相关综合征致病基因:RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2;
2、19个与人类肠神经系统发育高度相关的基因:NAV2、WWOX、KIAA0368、PLEKHA1、MAPK10、LARGE、SYN3、GRIN2B、LRRTM4、SOX2、NCRNA00158(LINC00158)、DLX2、GFRA1、ARAF、GRB10、HOXA2、PHACTR4、TLX2、ZIC2。
先天性巨结肠属于肠神经系统发育异常性疾病,上述19个与人类肠神经系统发育高度相关的基因,或者与细胞生长、迁移有关,或者参与神经元的突起投射,或者属于经典的转录因子可以调节发育通路上多个重要基因的表达,本发明探针组中纳入这些基因,对于先天性巨结肠这一疾病的检测具有很强的针对性和坚实的理论依据。
更优选的,本发明提供一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组,所述探针组包含能同时特异性捕获下述172个基因的探针:
1、上述15个HSCR及相关综合征致病基因:RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2;
2、上述19个与人类肠神经系统发育高度相关的基因:NAV2、WWOX、KIAA0368、PLEKHA1、MAPK10、LARGE、SYN3、GRIN2B、LRRTM4、SOX2、NCRNA00158(LINC00158)、DLX2、GFRA1、ARAF、GRB10、HOXA2、PHACTR4、TLX2、ZIC2;
3、120个对301位HSCR患者全外显子组测序检出突变累及频率≥5的基因:GPR98(ADGRV1)、UBR4、FAT1、SACS、DST、POLE、IFIH1、ODZ3、BIRC6、ZFHX3、AGL、COL11A1、MICAL2、ATM、TBC1D9B、LAMA1、APC、ANK3、SORL1、PTPN13、SPTAN1、TULP4、KANK1、NID2、TRRAP、DMD、DMXL2、MPDZ、AGRN、CFTR、MDN1、KALRN、HERC1、FLNB、ACSS2、BAZ2B、BCMO1、CHD1、COL14A1、DSP、EML4、FRMD4B、LRP6、MAGI3、PLEKHH1、RANBP17、TSR1、ARVCF、SULF1、NUP155、ADAMTS15、KIAA1109、TRAP1、FBN2、UTP20、VPS13C、MYOF、MACF1、AARS、AP3B2、APPL2、ASTN1、ATG2B、COL6A2、CPNE1、CREBBP、ENO3、EPB41L3、EPHA7、ERCC3、GSN、INADL、MMP1、MYH9、NEDD9、NUP188、PKD2、RERE、SH3PXD2A、SRRM1、TANC1、TPR、TRIO、VPS16、XYLT1、CAMTA1、COL6A3、FARP1、COLEC12、HECTD1、FRYL、CAPN2、DYNC1H1、PYGB、IQGAP2、LRIG1、KIAA1217、EHBP1、USP45、ERCC4、SVIL、PYGL、MYOM1、EXO1、PHKB、UGGT2、PAX3、HMCN1、DNAJC13、LRP1B、RNF123、GAPVD1、INVS、USP13、ABCA1、ADAMTS17、C6orf165、HHIPL2、MERTK、UBA6;
发明人通过对301位先天性巨结肠患者进行全外显子组测序,覆盖、检测范围为人类基因组已知的全部3万余个基因的所有外显子,测序结果表明,先天性巨结肠患者的突变基因高度集中,基因组的其余基因(占绝大多数)虽然也有累及,但突变频率非常低,很多甚至只在单一患者有发现,其与疾病的相关性难以确定。因此在设计本发明探针组时,纳入在本病患者发生突变概率最高的上述120个基因,其突变累及频率均大于5,这样能够在最大限度地增加检出致病/易感基因的同时合理控制检测成本,目前商售人类全基因组外显子测序的价格在8千到1万人民币之间,而本发明的探针组的基因测序成本只有3千到4千人民币,可以大大降低患者的经济负担。
4、18个完全敲除或者条件性敲除后可以导致小鼠巨结肠表型的基因:CELSR3、FZD3、VANGL1、VANGL2、PRICKLE1、PRICKLE2、DVL1、DVL2、PTCH1、SHH、DLL3、GLI1、NOTCH1、NOTCH2、DLL1、HES1、HOXB5、TCOF1。
根据上述172个先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因,本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计和合成探针序列,对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序,以达到检测样本的目的。
优选的,本发明探针组中捕获、检测ZEB2基因的探针组包含57个寡核苷酸探针,所述57个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.1-57所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测SOX10基因的探针组包含20个寡核苷酸探针,所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.58-77所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测RET基因的探针组包含53个寡核苷酸探针,所述53个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.78-130所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测LRP1B基因的探针组包含221个寡核苷酸探针,所述221个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.131-351所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测HECTD1基因的探针组包含119个寡核苷酸探针,所述119个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.352-470所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测NUP155基因的探针组包含70个寡核苷酸探针,所述70个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.471-540所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测MDN1基因的探针组包含263个寡核苷酸探针,所述263寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.541-803所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测GAPVD1基因的探针组包含72个寡核苷酸探针,所述72寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.804-875所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测ASTN1基因的探针组包含62个寡核苷酸探针,所述62寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.876-937所示。
优选的,本发明探针组中捕获、检测GPR98(ADGRV1)基因的探针组包含295个寡核苷酸探针,所述295寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.938-1232所示。
更优选的,所述寡核苷酸探针标记生物素。
再另一方面,本发明提供一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的试剂盒,所述试剂盒包含上述本发明的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组。
优选的,本发明的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的试剂盒还进一步包含富集缓冲液,所述富集缓冲液的组分含有:
人cot-1DNA;
鲑鱼精DNA;
引物1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT;
引物2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC。
优选的,本发明的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的试剂盒还进一步包含杂交缓冲液,所述杂交缓冲液的组分含有:SSPE缓冲液、Denhardt溶液、EDTA和SDS。
更优选的,本发明的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的试剂盒包括:
(1)本发明所述的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组;
(2)上述富集缓冲液;
(3)上述杂交缓冲液;
(4)结合缓冲液(1MNaCl,10mMTris-HCl(pH7.5),1mMEDTA);
(5)漂洗液1(1倍浓度的SSC,0.1%SDS);
(6)漂洗液2(0.1倍浓度的SSC,0.1%SDS);
(7)0.1MNaOH溶液;
(8)1MTris-HCl缓冲液(pH7.5);
(9)PCR反应液(2uldNTPs(每种10mM),0.5ul引物1(AATGATACGGCGACCACCGA*G,50pmol),0.5ul引物2(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A,50pmol),20ul5倍浓度的Phusion缓冲液,1ulHotstartPhusion酶(购自NewEnglandBiolabs),5ulDMSO,51uldH2O;*表示中间有硫代修饰);
(10)TE缓冲液。
优选的,所述试剂盒包括10管溶液,具体为:
管1:上述本发明所述探针组,160ul,浓度150ng/ul,
管2:上述富集缓冲液,208ul,
管3:上述杂交缓冲液,800ul,
管4:上述结合缓冲液,3.2ml,
管5:上述漂洗液1,9ml,
管6:上述漂洗液2,45ml,
管7:上述0.1MNaOH溶液,1ml,
管8:上述1MTris-HCl缓冲液(pH7.5),1.2ml,
管9:上述PCR反应液,580ul,
管10:上述TE缓冲液,800ul。
优选的,所述试剂盒中的探针组为液相捕获探针。
本发明具有以下有益效果:
1、最多能一次检测172个致病/易感基因的各种突变类型,为全面筛查先天性巨结肠及相关综合征患者创造了条件,明确家庭内首诊患者的致病/易感基因突变可以为遗传咨询和产前干预提供参考,减少或避免严重畸形患儿的出生,填补本领域的空白。
2、本发明所述的试剂盒是以本发明人基于国际范围内最大规模样本量的先天性巨结肠人群全外显子组水平基因筛查结果的前期研究为基础,结合大量数据库检索、文献阅读、小鼠疾病模型症状比对后确定的172个致病/易感基因,应用高通量捕获测序技术制备的检测试剂盒,针对每个致病/易感基因设计的捕获探针都是经过严格特异性筛选的,具有稳定、特异、高效的特点。本发明所述的试剂盒能够在受检者任何一个年龄段进行检测,同时能够进行大规模人群普查、筛选先天性巨结肠发病高危人群,实现先天性巨结肠发病风险预测、预警,提高早诊率;另一方面,除已知致病基因之外的其他致病/易感基因的纳入,为临床上约90%的患者的分子遗传学诊断提供了机会,新的致病/易感基因突变类型、突变频率和突变谱的检出,对完善疾病病因学假说会有很大帮助。
3、临床上约有30%的患儿除HSCR外还合并有复杂的其他器官、系统异常,但是在低年龄患儿尤其是新生儿,这些复杂症状往往不易被发现,容易造成误诊、漏诊从而延误个体化治疗,甚至可能危及患儿的生命。本发明提供的用于检测先天性巨结肠及相关综合征致病/易感基因的探针组和试剂盒可以为尽早确立诊断和对患儿采取正确合理的干预、治疗措施提供依据,符合精准医疗的发展趋势。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述。本领域技术人员应当意识到在不脱离本发明的范围和精神的情况下所作的改动,均属于本发明的范围。本发明所使用试剂和方法可参考专利WO2013/003585中公开的试剂和方法。如无特殊说明,本发明所使用的本领域常用试剂均可通过商购途径获得。
实施例1:本发明探针组的设计和制备
一、致病/易感基因的筛选
以国际范围内最大规模样本量的先天性巨结肠人群全外显子组水平基因筛查结果的前期研究为基础,结合大量数据库检索、对患者基因测序结果进行筛选、小鼠疾病模型症状比对工作,最终确定了172个致病/易感基因,主要包括四大类:(1)、15个HSCR及相关综合征致病基因:RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2;(2)、文献及RNASeq结果提示19个与人类肠神经系统发育高度相关的基因:NAV2、WWOX、KIAA0368、PLEKHA1、MAPK10、LARGE、SYN3、GRIN2B、LRRTM4、SOX2、NCRNA00158(LINC00158)、DLX2、GFRA1、ARAF、GRB10、HOXA2、PHACTR4、TLX2、ZIC2;(3)、120个对301位HSCR患者全外显子组测序检出突变累及频率≥5的基因:GPR98(ADGRV1)、UBR4、FAT1、SACS、DST、POLE、IFIH1、ODZ3、BIRC6、ZFHX3、AGL、COL11A1、MICAL2、ATM、TBC1D9B、LAMA1、APC、ANK3、SORL1、PTPN13、SPTAN1、TULP4、KANK1、NID2、TRRAP、DMD、DMXL2、MPDZ、AGRN、CFTR、MDN1、KALRN、HERC1、FLNB、ACSS2、BAZ2B、BCMO1、CHD1、COL14A1、DSP、EML4、FRMD4B、LRP6、MAGI3、PLEKHH1、RANBP17、TSR1、ARVCF、SULF1、NUP155、ADAMTS15、KIAA1109、TRAP1、FBN2、UTP20、VPS13C、MYOF、MACF1、AARS、AP3B2、APPL2、ASTN1、ATG2B、COL6A2、CPNE1、CREBBP、ENO3、EPB41L3、EPHA7、ERCC3、GSN、INADL、MMP1、MYH9、NEDD9、NUP188、PKD2、RERE、SH3PXD2A、SRRM1、TANC1、TPR、TRIO、VPS16、XYLT1、CAMTA1、COL6A3、FARP1、COLEC12、HECTD1、FRYL、CAPN2、DYNC1H1、PYGB、IQGAP2、LRIG1、KIAA1217、EHBP1、USP45、ERCC4、SVIL、PYGL、MYOM1、EXO1、PHKB、UGGT2、PAX3、HMCN1、DNAJC13、LRP1B、RNF123、GAPVD1、INVS、USP13、ABCA1、ADAMTS17、C6orf165、HHIPL2、MERTK、UBA6;(4)、18个完全敲除或者条件性敲除后可以导致小鼠巨结肠表型的基因:CELSR3、FZD3、VANGL1、VANGL2、PRICKLE1、PRICKLE2、DVL1、DVL2、PTCH1、SHH、DLL3、GLI1、NOTCH1、NOTCH2、DLL1、HES1、HOXB5、TCOF1。
二、探针的制备
根据上述致病/易感基因的基因组序列,本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列,本实施例中对合成的探针序列进行生物素标记,具体操作为(也可参考专利WO2013/003585中的方法):采用本领域公知方法合成探针序列,均匀混合在总体积1.2ml的dH2O中,取其中15ul利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA),分三管进行PCR扩增,其中引物GACTACATGGGACAT为带有生物素标记的引物。
PCR扩增体系:上述探针溶液,5ul;正向引物(25uM),2ul;反向引物(25uM),2ul;MgCl2(50mM),4ul;10xPlatinumTaq聚合酶缓冲液(购自LifeTechnologies),5ul;dNTPs(每种10mM),4ul;PlatinumTaq聚合酶(5U/ul,购自LifeTechnologies),1ul;H2O,27ul;总体积50ul。
扩增条件:98℃,30s;(98℃,30s,60℃,25s,72℃,45s)35个循环;72℃,5min。
将PCR产物用MinElutePCR纯化试剂盒(购自LifeTechnologies)纯化后,取500ng,用MyOne链酶亲和素磁珠(购自Invitrogen)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来;然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤,使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组。
实施例2:本发明试剂盒组成、制备及使用
本实施例所述的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的试剂盒,是通过检测上述172个致病/易感基因的突变来进行受检个体的分子遗传学诊断或发病风险预测的试剂盒。
所述试剂盒包含的成分为:实施例1所获得的探针组(160ul,150ng/ul)、富集缓冲液(208ul)、杂交缓冲液(800ul)、结合缓冲液(3.2ml)、漂洗液1(9ml)、漂洗液2(45ml)、NaOH溶液(0.1M,1ml)、Tris-HCl缓冲液(1M,pH7.5,1.2ml)、PCR反应液(580ul)、TE缓冲液(800ul)。其中各缓冲液组成如下:
(1)富集缓冲液(每20ul):
人cot-1DNA(购自Invitrogen),7ul;鲑鱼精DNA(购自Invitrogen),3ul;
特异性封闭引物,共10ul,每种引物浓度为1nmol/ul:
引物1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT;
引物2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC;
(2)杂交缓冲液:5倍浓度的SSPE,5倍浓度的Denhardt溶液,5mMEDTA,0.1%SDS;
(3)结合缓冲液:1MNaCl,10mMTris-HCl(pH7.5),1mMEDTA
(4)漂洗液1:1倍浓度的SSC溶液,0.1%SDS
(5)漂洗液2:0.1倍浓度的SSC溶液,0.1%SDS
(6)PCR反应液:2uldNTPs(每种10mM),0.5ul引物1(AATGATACGGCGACCACCGA*G,50pmol),0.5ul引物2(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A,50pmol),20ul5倍浓度的Phusion缓冲液,1ulHotstartPhusion酶(购自NewEnglandBiolabs),5ulDMSO,51uldH2O;*表示中间有硫代修饰;
一些常用的溶液配方或来源为:
20倍浓度的SSPE缓冲液,购自AMRESCO公司;50倍浓度的Denhardt溶液,购自USB公司;EDTA溶液:0.5M,pH8.0,购自Mediatech公司;5倍浓度的Phusion缓冲液,购自NewEnglandBiolab公司;
SSC溶液:NaCl175g,柠檬酸三钠88g,调pH至7.4,dH2O定容至1升;
TE缓冲液:10mMTris-HCl,1mMEDTA,调pH至8.0,水定容至500ml。
所述试剂盒的使用方法为:
1、DNA提取及全基因组文库制备
使用QiagenDNAminikit(250)(购自Qiagen)试剂盒或类似产品提取外周血中的DNA。用分光光度计定量,琼脂糖凝胶电泳检测样本质量,完整的基因组DNA电泳条带通常应不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到75ng/μl,总量3-5μgDNA随机打断、扩增,从而建立全基因组文库。
2、目标致病/易感基因片段的特异性捕获及测序
1)制备以下混合体系:取1ug步骤1的构建好的全基因组文库,13ul富集缓冲液,5ul实施例1的本发明探针组;置于PCR仪上:95℃,7min,之后65℃,2min;
2)取65℃预热的杂交缓冲液23ul加入到上述步骤1)得到的混合液中,然后于PCR仪上65℃杂交22小时,得到富集体系混合物。
3)将MyOneC1链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮,短暂离心,使磁珠离心至管底部,取50ulMyOneC1链霉亲和素磁珠到新的1.5ml的离心管。
4)将装有50ulMyOneC1链霉亲和素磁珠的1.5ml离心管漩涡震荡至少5s,使磁珠充分悬浮,短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管),小心吸弃上清。
5)取下离心管,加入50ul的1倍浓度的结合缓冲液,旋窝震荡至少5s,短暂离心后放入磁力架上静止一分钟,小心吸弃上清,重复三次。
6)取下离心管,加入100ul的2倍浓度的结合缓冲液,旋窝震荡至少5s,短暂离心后放入磁力架上静止一分钟。
7)将步骤2)得到的富集体系混合物加入到骤6)的离心管中,旋窝震荡至少5s(不用离心),置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)。
8)然后,利用漂洗液1室温清洗步骤7)的磁珠一次,15分钟,然后再用漂洗液2清洗3次,65℃,每次15分钟。
9)将步骤8)的磁珠用0.1MNaOH室温下洗脱10分钟,然后将洗脱液漩涡震荡至少5s,短暂离心后放入磁力架上静止一分钟,然后将上清液转移到含有70ulTris-HCl缓冲液(1M,pH7.5)的干净离心管中。
10)采用QiagenMinEluteColumn(购自Qiagen)对步骤9)得到的DNA溶液进行纯化,其纯化步骤参照QiagenMinEluteKit的实验操作手册。
11)纯化的DNA通过PCR最终扩增15个循环:
PCR反应液:2uldNTPs(每种10mM),0.5ul引物1(AATGATACGGCGACCACCGA*G,50pmol),0.5ul引物2(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A,50pmol),20ul5倍浓度的Phusion缓冲液(购自NewEnglandBiolabs),1ulHotstartPhusion酶(购自NewEnglandBiolabs),5ulDMSO,51uldH2O;*表示中间有硫代修饰。PCR程序:98℃,30s(1cycle);98℃,25s,65℃,30s,72℃,30s(15cycles);72℃,5min(1cycle)。
12)利用AgencourtAMPureXP核酸纯化试剂盒(购自BeckmanCoulter),根据使用手册纯化步骤11)的PCR产物。
13)将步骤12)得到的DNA产物在IlluminaNexseq500测序仪上进行测序。
3、生物信息学分析流程及结果输出:
(1)SNP分析流程
①获取原始短序列;
②去除测序数据中的接头和低质量数据等;
③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上,所用到参数:soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400,其中序列错配数为3,具体参数含义参考:http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html;
④统计测序结果信息,短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;
⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型,所用到参数:soapsnp-i-d-o-r0.00005-e0.0001-M-t-u-L-s-2–T,具体参数含义参考:http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html;
⑥过滤低质量值(质量值>=20)和低覆盖度(深度>=10)的SNP;
⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等;
⑧根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs,在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时,过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs;
(2)InDel分析流程
①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-WheelerAligner(BWA)比对到人MHC3.6M基因组上,所用到参数:bwaaln-L-l31-i10-k2-t7-e40,具体参数含义参考:http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml;
②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息;
③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。
输出测序数据基本统计报告及数据分析结果至Excel表。
实施例3:本发明试剂盒的使用效果验证
利用本发明所述试剂盒检测72例样本,结果证实目的致病/易感基因的捕获率满意,97.7%以上的原始短序列都能被比对回目标区域的参考序列,目标区域的平均有效测序数据量达到272.4Mb,目标区域的平均测序深度为263X(见表1),远远高于一般的遗传疾病诊断要求(一般为20X)。
表1目的致病/易感基因测序数据质量
实施例4:本发明探针组及试剂盒的临床诊断实例
表2利用本发明试剂盒对15例先天性巨结肠及相关综合征患者做出的分子遗传学诊断
1、一例Mowat-Wilson综合征患者分子遗传学诊断
患儿(编号:HSCR0038),女,生后1天即出现腹胀伴间断呕吐,未排胎便。腹部立位平片显示肠腔内可见大量积气影,肠管扩张,多发气液平面,考虑为先天性巨结肠导致的新生儿肠梗阻。查体及一般实验室检查未见明显异常。于生后23天进行经肛门直肠、乙状结肠、远端横结肠切除术。因超声心动图检查发现严重的房间隔缺损、室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、动脉导管未闭并出现心功能下降,遂于生后3个月进行先天性心脏病矫治手术。但该患儿最终仍因严重心功能衰竭、重症肺炎于生后4个月10天去世。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了ZEB2基因的一个无义突变:p.R278X。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。已知此基因的新生无义突变可导致Mowat-Wilson综合征,我们在追查病历后发现本患儿的容貌特征、先天性巨结肠以及先天性心脏病等临床表现符合该综合征诊断。目前患儿的母亲已经再次怀孕,鉴于首诊患儿的分子遗传学诊断已经明确,后续可以针对胎儿的相应基因进行目的性明确的检测以避免罹患相同综合征的患者出生。
2、一例Waardenburg综合征IV型患者分子遗传学诊断
患儿(编号:HSCRMG1),女,4个月,生后2个月即因确诊先天性巨结肠行横结肠造瘘术。新生儿听力筛查未通过,双耳听力诱发电位检查异常,双侧眼睛虹膜蓝染,临床拟诊为Waardenburg综合征IV型。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了SOX10基因的无义突变:p.E280X。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。Waardenburg综合征(WS)是一种以先天性感音神经性耳聋及皮肤、虹膜、毛发的色素分布异常为主要特征的遗传综合征。WS具有遗传异质性,现已发现多种能够引起WS的突变基因。既往多采用针对多个已知致病基因逐一扩增、测序的方法来寻找患者的致病突变,费时费力且检查费用高昂,本发明试剂盒的应用有效地提高了WS以及类似疾病的遗传学诊断效率,可以在显著节约经济成本的同时为患儿的尽早、合理干预、治疗提供依据。
3、六例单纯型先天性巨结肠患者分子遗传学诊断
①患者(编号:HSCR0116),男,11个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了RET基因的无义突变:p.E252X。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。
②患者(编号:HSCR0129),女,10个月,临床诊断为长段型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了RET基因的无义突变:p.Y263X。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。
③患者(编号:HSCR0074),男,6个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了RET基因的无义突变:p.R770X。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。
④患者(编号:HSCR0117),男,5个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),有一弟弟,父母及弟弟均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DA样本后发现了RET基因的无义突变:p.Q860X。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变,其未患病的弟弟也没有携带该突变。
⑤患者(编号:HSCR0132),男,4个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了RET基因的错义突变:p.R77C。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。
⑥患者(编号:HSCR0127),女,3个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),有一姐姐,父母及姐姐均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了RET基因的非移码插入突变:p.R67insL。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变,其未患病的姐姐也没有携带该突变。
4、七例单纯型先天性巨结肠患者的可疑致病突变
①患者(编号:HSCR0003),男,4个月,临床诊断为长段型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了LRP1B基因的剪切位点杂合突变:c.8850+3A>G。高度怀疑为本病致病突变。
②患者(编号:HSCR0006),男,10个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了HECTD1基因的两个剪切位点杂合突变:c.604-3T>C以及c.2874-4G>A。高度怀疑为本病致病突变。
③患者(编号:HSCR0014),女,5岁3个月,临床诊断为短段型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了NUP155基因的剪切位点杂合突变:c.392+4T>C。高度怀疑为本病致病突变。
④患者(编号:HSCR0028),男,10个月,临床诊断为长段型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了MDN1基因的剪切位点杂合突变:c.4448+4C>T。高度怀疑为本病致病突变。
⑤患者(编号:HSCR0031),男,1岁6个月,临床诊断为长段型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了GAPVD1基因的剪切位点杂合突变:c.186-3T>A。高度怀疑为本病致病突变。
⑥患者(编号:HSCR0042),男,3个月,临床诊断为全结肠型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了ASTN1基因的剪切位点杂合突变:c.3227-3C>A。高度怀疑为本病致病突变。
⑦患者(编号:HSCR0019),男,9个月,临床诊断为短段型先天性巨结肠(单纯型),家庭内无其他兄弟姐妹,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了GPR98(ADGRV1)基因的剪切位点杂合突变:c.2241-4C>T。高度怀疑为本病致病突变。
以上7例患者,利用常规的15个HSCR及相关综合征致病基因检测并未发现明确可疑的突变(即可能严重影响基因编码蛋白功能的突变),而利用本发明试剂盒,则分别检测出其他致病/易感基因的剪切位点突变,该类突变与无义突变、移码突变一样,都属于公认的、可以严重影响蛋白功能进而参与疾病发生的严重突变,因而很可能为上述患者的致病突变。这些除已知致病基因之外的其他致病/易感基因的纳入,将可能为临床上约90%的患者的分子遗传学诊断提供机会,新的致病/易感基因突变类型、突变频率和突变谱的检出,对完善疾病病因学假说会有很大帮助。
综上所述,本发明提供的用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点,可以同时最多检测、明确172个致病/易感基因的各种类型突变,因此本发明的探针组和试剂盒可应用于患病个体的分子遗传学诊断,同时还可用于先天性巨结肠高发区人群普查、筛查先天性巨结肠患者家属中的发病高危人群以及为相应的遗传咨询或产前干预提供参考。对于合并多器官、多系统异常但是由于年龄小而常常表现为症状极其复杂的患儿,本发明的使用可以为尽早确立诊断和对患儿采取正确、合理的干预、治疗措施提供依据,符合精准医疗的发展趋势。
Claims (9)
1.一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组,所述探针组包含能同时特异性捕获下述15个基因的探针:RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2。
2.一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组,所述探针组包含能同时特异性捕获下述34个基因的探针:RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2、NAV2、WWOX、KIAA0368、PLEKHA1、MAPK10、LARGE、SYN3、GRIN2B、LRRTM4、SOX2、NCRNA00158(LINC00158)、DLX2、GFRA1、ARAF、GRB10、HOXA2、PHACTR4、TLX2、ZIC2。
3.一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组,所述探针组包含能同时特异性捕获下述172个基因的探针:RET、EDNRB、SEMA3D、SEMA3C、NRG1、PHOX2B、SOX10、ECE1、EDN3、GDNF、KIAA1279、L1CAM、NRTN、TCF4、ZEB2、NAV2、WWOX、KIAA0368、PLEKHA1、MAPK10、LARGE、SYN3、GRIN2B、LRRTM4、SOX2、NCRNA00158(LINC00158)、DLX2、GFRA1、ARAF、GRB10、HOXA2、PHACTR4、TLX2、ZIC2、GPR98(ADGRV1)、UBR4、FAT1、SACS、DST、POLE、IFIH1、ODZ3、BIRC6、ZFHX3、AGL、COL11A1、MICAL2、ATM、TBC1D9B、LAMA1、APC、ANK3、SORL1、PTPN13、SPTAN1、TULP4、KANK1、NID2、TRRAP、DMD、DMXL2、MPDZ、AGRN、CFTR、MDN1、KALRN、HERC1、FLNB、ACSS2、BAZ2B、BCMO1、CHD1、COL14A1、DSP、EML4、FRMD4B、LRP6、MAGI3、PLEKHH1、RANBP17、TSR1、ARVCF、SULF1、NUP155、ADAMTS15、KIAA1109、TRAP1、FBN2、UTP20、VPS13C、MYOF、MACF1、AARS、AP3B2、APPL2、ASTN1、ATG2B、COL6A2、CPNE1、CREBBP、ENO3、EPB41L3、EPHA7、ERCC3、GSN、INADL、MMP1、MYH9、NEDD9、NUP188、PKD2、RERE、SH3PXD2A、SRRM1、TANC1、TPR、TRIO、VPS16、XYLT1、CAMTA1、COL6A3、FARP1、COLEC12、HECTD1、FRYL、CAPN2、DYNC1H1、PYGB、IQGAP2、LRIG1、KIAA1217、EHBP1、USP45、ERCC4、SVIL、PYGL、MYOM1、EXO1、PHKB、UGGT2、PAX3、HMCN1、DNAJC13、LRP1B、RNF123、GAPVD1、INVS、USP13、ABCA1、ADAMTS17、C6orf165、HHIPL2、MERTK、UBA6、CELSR3、FZD3、VANGL1、VANGL2、PRICKLE1、PRICKLE2、DVL1、DVL2、PTCH1、SHH、DLL3、GLI1、NOTCH1、NOTCH2、DLL1、HES1、HOXB5、TCOF1。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的探针组,其中捕获、检测所述ZEB2、SOX10、RET基因的探针组的序列选自:
捕获、检测ZEB2基因的探针组包含57个寡核苷酸探针,所述57个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.1-57所示;
捕获、检测SOX10基因的探针组包含20个寡核苷酸探针,所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.58-77所示;
捕获、检测RET基因的探针组包含53个寡核苷酸探针,所述53个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.78-130所示。
5.根据权利要求3所述的探针组,其中捕获、检测所述ZEB2、SOX10、RET、LRP1B、HECTD1、NUP155、MDN1、GAPVD1、ASTN1、GPR98(ADGRV1)基因的探针组的序列选自:
捕获、检测ZEB2基因的探针组包含57个寡核苷酸探针,所述57个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.1-57所示;
捕获、检测SOX10基因的探针组包含20个寡核苷酸探针,所述20个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.58-77所示;
捕获、检测RET基因的探针组包含53个寡核苷酸探针,所述53个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.78-130所示;
捕获、检测所述捕获、检测LRP1B基因的探针组包含221个寡核苷酸探针,所述221个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.131-351所示;
捕获、检测HECTD1基因的探针组包含119个寡核苷酸探针,所述119个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.352-470所示;
捕获、检测NUP155基因的探针组包含70个寡核苷酸探针,所述70个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.471-540所示;
捕获、检测MDN1基因的探针组包含263个寡核苷酸探针,所述263寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.541-803所示;
捕获、检测GAPVD1基因的探针组包含72个寡核苷酸探针,所述72寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.804-875所示;
捕获、检测ASTN1基因的探针组包含62个寡核苷酸探针,所述62寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.876-937所示;
捕获、检测GPR98(ADGRV1)基因的探针组包含295个寡核苷酸探针,所述295寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.938-1232所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的探针组,其中所述寡核苷酸探针标记生物素。
7.一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的试剂盒,其中所述试剂盒包含权利要求1-6中任一项所述的探针组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中试剂盒中的探针组为液相捕获探针。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含:
(1)权利要求1-5中任一项所述的探针组;
(2)富集缓冲液,所述富集缓冲液含有:引物、人cot-1DNA、鲑鱼精DNA;
(3)杂交缓冲液,所述杂交缓冲液含有:SSPE缓冲液、Denhardt溶液、EDTA和SDS;
(4)结合缓冲液,所述结合缓冲液含有:NaCl,Tris-HCl,EDTA;
(5)漂洗液1,所述漂洗液1含有:SSC和SDS;
(6)漂洗液2,所述漂洗液2含有:SSC和SDS;
(7)NaOH溶液;
(8)Tris-HCl缓冲液,pH7.5;
(9)PCR反应液,所述PCR反应液含有:dNTPs,引物,Phusion缓冲液,HotstartPhusion酶,DMSO,dH2O;
(10)TE缓冲液。
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Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105950723A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-09-21 | 王红卫 | 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒 |
CN106795496A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-31 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种获得t细胞的方法及应用 |
CN107119072A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-01 | 安徽医科大学 | 一种过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用 |
CN107523610A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-12-29 | 龙凌云 | 一种人细胞色素p450cyp2c19和svil基因多态性位点检测试剂盒及用途 |
CN109652532A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-19 | 中国人民解放军总医院 | 一种检测心血管系统用药的标志物 |
CN109762882A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-05-17 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于检测原发性免疫缺陷病致病基因的探针组及试剂盒 |
CN109971854A (zh) * | 2019-03-31 | 2019-07-05 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 用于开发宫颈疾病的诊疗产品的靶分子 |
CN110872619A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 深圳市科迈今美生物医疗有限公司 | 一种用于产前风险评估先天性半侧颜面短小综合征的基因组件、试剂盒及应用 |
CN111378736A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用 |
CN111394446A (zh) * | 2019-01-02 | 2020-07-10 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于检测苯丙酮尿症相关致病基因的试剂盒及其专用捕获探针组 |
CN111440856A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-24 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于检测甲基丙二酸血症相关致病基因的探针组及试剂盒 |
TWI716883B (zh) * | 2018-05-22 | 2021-01-21 | 大陸商廣州市康立明生物科技有限責任公司 | 腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用 |
CN112708673A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-04-27 | 广州市妇女儿童医疗中心 | Prdm9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用 |
CN112852957A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-05-28 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用 |
CN113075400A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-06 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 抗双链dna抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用 |
CN113186289A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-30 | 清华大学深圳国际研究生院 | lncRNA在肾癌尿液筛查和肾癌治疗中的应用 |
CN113416780A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-09-21 | 丽水市中心医院 | 一种诊治缺血性脑卒中的分子标志物 |
CN113943795A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-01-18 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组及其试剂盒 |
WO2024092942A1 (zh) * | 2022-11-03 | 2024-05-10 | 广州市金域转化医学研究院有限公司 | 用于非tsc1/tsc2突变结节性硬化症的生物标志物及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013003585A2 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | The Johns Hopkins University | Enrichment of nucleic acids by complimentary capture |
CN102876791A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-16 | 湖北维达健基因技术有限公司 | 一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒 |
CN104789688A (zh) * | 2015-05-12 | 2015-07-22 | 首都儿科研究所 | 与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用 |
-
2015
- 2015-11-11 CN CN201510767304.5A patent/CN105256051B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013003585A2 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | The Johns Hopkins University | Enrichment of nucleic acids by complimentary capture |
CN102876791A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-16 | 湖北维达健基因技术有限公司 | 一种用于肛肠疾病患病风险评估基因芯片、制备方法及其试剂盒 |
CN104789688A (zh) * | 2015-05-12 | 2015-07-22 | 首都儿科研究所 | 与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MARIA M. ALVES等: "Contribution of rare and common variants determine complex diseases-Hirschsprung disease as a model", 《DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 * |
QIAN JIANG等: "Copy number variants in candidate genes are genetic modifiers of hirschsprung disease", 《PLOS ONE》 * |
姜茜等: "先天性巨结肠患者SEMA3C/SEMA3D基因错义突变对Semaphorin 3蛋白表达的影响", 《医学研究杂志》 * |
Cited By (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105950723B (zh) * | 2016-05-04 | 2020-04-21 | 上海汇真生物科技有限公司 | 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒 |
CN105950723A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-09-21 | 王红卫 | 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒 |
CN107523610A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-12-29 | 龙凌云 | 一种人细胞色素p450cyp2c19和svil基因多态性位点检测试剂盒及用途 |
CN106795496A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-05-31 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种获得t细胞的方法及应用 |
CN107119072B (zh) * | 2017-05-08 | 2020-10-27 | 安徽医科大学 | 一种过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用 |
CN107119072A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-01 | 安徽医科大学 | 一种过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用 |
TWI716883B (zh) * | 2018-05-22 | 2021-01-21 | 大陸商廣州市康立明生物科技有限責任公司 | 腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用 |
CN110872619A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 深圳市科迈今美生物医疗有限公司 | 一种用于产前风险评估先天性半侧颜面短小综合征的基因组件、试剂盒及应用 |
CN109762882A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-05-17 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于检测原发性免疫缺陷病致病基因的探针组及试剂盒 |
CN109762882B (zh) * | 2018-12-24 | 2022-10-04 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于检测原发性免疫缺陷病致病基因的探针组及试剂盒 |
CN111440856A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-24 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于检测甲基丙二酸血症相关致病基因的探针组及试剂盒 |
CN111378736A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用 |
CN111378736B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-04-25 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | 耳聋相关基因捕获试剂盒及其应用 |
CN111440856B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-10-21 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于检测甲基丙二酸血症相关致病基因的探针组及试剂盒 |
CN111394446A (zh) * | 2019-01-02 | 2020-07-10 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于检测苯丙酮尿症相关致病基因的试剂盒及其专用捕获探针组 |
CN111394446B (zh) * | 2019-01-02 | 2022-11-01 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 一种用于检测苯丙酮尿症相关致病基因的试剂盒及其专用捕获探针组 |
CN109652532A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-19 | 中国人民解放军总医院 | 一种检测心血管系统用药的标志物 |
CN109971854B (zh) * | 2019-03-31 | 2021-11-26 | 青岛泱深生物医药有限公司 | 用于开发宫颈疾病的诊疗产品的靶分子 |
CN109971854A (zh) * | 2019-03-31 | 2019-07-05 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 用于开发宫颈疾病的诊疗产品的靶分子 |
CN112708673A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-04-27 | 广州市妇女儿童医疗中心 | Prdm9转座子融合作为先天性巨结肠疾病标志物的应用 |
CN112852957B (zh) * | 2021-03-26 | 2021-11-12 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用 |
CN112852957A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-05-28 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 先天性巨结肠早期诊断标志物及其应用 |
CN113075400B (zh) * | 2021-03-29 | 2022-07-22 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 抗双链dna抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用 |
CN113075400A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-06 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 抗双链dna抗体作为先天性巨结肠诊断标志物的应用 |
CN113186289A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-07-30 | 清华大学深圳国际研究生院 | lncRNA在肾癌尿液筛查和肾癌治疗中的应用 |
CN113186289B (zh) * | 2021-05-12 | 2023-02-24 | 清华大学深圳国际研究生院 | lncRNA在肾癌尿液筛查和肾癌治疗中的应用 |
CN113416780A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-09-21 | 丽水市中心医院 | 一种诊治缺血性脑卒中的分子标志物 |
CN113943795A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-01-18 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组及其试剂盒 |
CN113943795B (zh) * | 2021-11-12 | 2024-01-30 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种用于检测噪音相关性耳聋基因的探针组及其试剂盒 |
WO2024092942A1 (zh) * | 2022-11-03 | 2024-05-10 | 广州市金域转化医学研究院有限公司 | 用于非tsc1/tsc2突变结节性硬化症的生物标志物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105256051B (zh) | 2018-04-17 |
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