CN105950723B - 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒 - Google Patents

用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105950723B
CN105950723B CN201610291803.6A CN201610291803A CN105950723B CN 105950723 B CN105950723 B CN 105950723B CN 201610291803 A CN201610291803 A CN 201610291803A CN 105950723 B CN105950723 B CN 105950723B
Authority
CN
China
Prior art keywords
artificial sequence
dna
group
methylation
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610291803.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105950723A (zh
Inventor
王红卫
段世伟
邓友平
朱勇
王琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dikeding Shanghai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Realgen Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Realgen Biotech Co ltd filed Critical Shanghai Realgen Biotech Co ltd
Priority to CN201610291803.6A priority Critical patent/CN105950723B/zh
Publication of CN105950723A publication Critical patent/CN105950723A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105950723B publication Critical patent/CN105950723B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及疾病相关DNA检测技术领域，更具体地，涉及结直肠癌受试者早期血浆DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因的特定区域甲基化实时定量检测试剂盒。所述定量检测试剂盒是通过PCR引物及Taqman探针来完成检测的。

Description

用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及疾病相关DNA检测技术领域，更具体地，涉及结直肠癌受试者早期血浆DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因的特定区域甲基化实时定量检测试剂盒。
背景技术
结直肠癌是世界上第三大恶性肿瘤，近年来中国结肠癌发病率由7％激增到13％。结直肠癌发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切，且发病年龄趋老年化。结直肠癌早期症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等。目前的血肿瘤标记物如癌胚抗原检测，有助于肿瘤的诊断。此外，结肠镜检查可以检查结肠和直肠肠腔，并在检查过程中进行活检和治疗。尽管活体组织检查对结直肠癌的早期癌变和息肉癌变的确诊有决定性意义，但其侵入性的操作限制了在人群中进行结直肠癌的早发普查。此外，脱落细胞学检查尽管准确性高，但其取材繁琐，且不易获得满意的标本，临床应用较少。
DNA甲基化是一种表观遗传学修饰，大量研究表明DNA甲基化的异常变化可引起基因组染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。因此，表观遗传学改变在肿瘤形成和发展过程中发挥着重要作用。近年来研究表明，DNA异常甲基化状态与结直肠癌的发生发展密切相关，同时也有多个基因的异常高甲基化在结直肠癌中频繁发生。因此，DNA异常甲基化有望作为结直肠癌早期诊断的生物标志物。循环DNA是指肿瘤细胞在增殖、转移和凋亡过程中不断释放进入血浆或血清中的游离DNA。研究人员在多种恶性肿瘤患者的血清或血浆中发现了甲基化的游离DNA。荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，能实时监控反应过程，并结合相应的软件进行产物分析的PCR技术。该方法较其他传统甲基化检测方法在时间上大幅缩减，同时，可以对极微量的DNA基因水平上的改变进行检测和定量，解决血浆中DNA含量少、丢失率高、DNA降解、带有致癌污染物等缺陷，使肿瘤抑制基因启动子的高甲基化在癌症患者的血浆中检测出来。因此，实时定量检测肿瘤患者中血浆游离DNA的表观遗传变化对肿瘤的早期诊断、疗效评估、发生机制等研究具有重要意义，更加适合医院或科研院所操作。
目前，对血浆游离DNA中基因的异常甲基化检测已成为肿瘤分子诊断学中无创诊断的一个新的研究热点。本项目开发计划采用分析早期结直肠癌患者血浆或血清中游离DNA的核糖体RNA假基因(rRNA pseudogene)、HECT结构域泛素蛋白链接酶1(HECT domaincontaining E3ubiquitin protein ligase1，HECTD1)和锌指蛋白843(zinc fingerprotein 843，ZNF843)基因启动子区的甲基化程度，结合现代的生物信息技术和统计学原理，提供操作简便、灵敏度高、周期短、检结果稳定可靠的甲基化定量检测方法，同时为患者的治疗随访和预后提供科学依据。
rRNA pseudogene是一类与编码基因高度相似但不能表达功能蛋白质的细胞内非编码基因。过去的研究认为假基因是没有功能的DNA片段，然而随着分子生物学技术的发展，人们从测序数据中发现在肿瘤转录组中有大量假基因表达，这些假基因的表达不仅具有癌症特异性，还具有组织特异性。因此，越来越多的证据表明，假基因在人类癌症等疾病方面扮演着重要的角色。而该基因的甲基化水平异常可能影响基因的转录表达，从而促进了肿瘤的发生发展。HECTD1基因表达在胚胎发育过程中起重要作用。且有研究表明，在人类神经管缺陷中，HECTD1基因是一个候选的易感基因。而其表观遗传学方面在国内外的研究中仍是空白。ZNF843是锌指蛋白家族的成员之一。目前被报道的部分锌指蛋白家族成员基因启动子区甲基化水平与肿瘤发生发展密切相关。如肝细胞癌中ZNF331基因启动子区高甲基化高达80％，提示该基因启动子甲基化可作为临床对肝癌早期诊断的候选指标。
目前，国内外还没有公开任何关于在结直肠癌中用实时荧光定量PCR检测rRNApseudogene、HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒；其通过实时荧光定量PCR检测受试者血浆或血清样本中游离DNA的rRNA_pseudogene，HECTD1和/或ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化，来辅助判断结直肠癌的易感性或发病。
在本发明的一个实施方案中，所述定量检测试剂盒是通过PCR引物及Taqman探针来完成检测的，其包含检测rRNA_pseudogene基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：
组1：上游引物：5’-GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3’
下游引物：5’-AAAACCTAAAAACCTCAAATTATTT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3’；
组2：上游引物：5’-GGAAGGGG(C/T)GGGAAAATTAT-3’
下游引物：5’-AATCCCTAAACCCTTCCCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-TCTACGCTCCCCATAAAATCCGA-BHQ1-3’；
组3：上游引物：5’-(C/T)GGGAG(C/T)(C/T)G(C/T)AGGGAAGGGG-3’
下游引物：5’-ACCCGACAC(A/G)ACCTAAAACT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CCTCCGACCCGATCTTTCTACC-BHQ1-3’；
在本发明的另一个实施方案中，所述定量检测试剂盒还包含检测HECTD1基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：
组4：上游引物：5’-AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3’
下游引物：5’-AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CAACGTAAATCGTTATTTTAAAACGTA-BHQ1-3’；
组5：上游引物：5’-AGAATTAAATTTTTATAGTGTTTTTTT-3’
下游引物：5’-CAACAACCTAATCAACTTATATACTCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-AAACACTCTTACGTCCAAACGTACT-BHQ1-3’；
组6：上游引物：5’-AAAAAAGGAAAGGTTAAAAGTAAATG-3’
下游引物：5’-CCAACTACCCTATCTTATAAAACTAAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CATTCGTTCGAATCCGTAACCT-BHQ1-3’；
组7：上游引物：5’-TATAAGATAGGGTAGTTGGTTAAAAAA-3’
下游引物：5’-(A/G)TAAAACCCAAAACTATCCTCC-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ATCAAAACGCTTACGAAACGCTT-BHQ1-3’；
组8：上游引物：5’-GAAGGTTTGGTAG(C/T)GAATTTT-3’
下游引物：5’-(A/G)CTAACCCCTTTATTCCCC-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CGATTACCCGCGCCAAAA-BHQ1-3’；
组9：上游引物：5’-TAGGTTGGAGTGAGGTGGTATTA-3’
下游引物：5’-ACAACATAAACCTAATCTCTACAAAAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CCAAATACGATAACGCACACCT-BHQ1-3’；
组10：上游引物：5’-TTTTTTGTAGAGATTAGGTTTATGTTG-3’
下游引物：5’-TCCCAACACTTTATAATTTTACTCTCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-AACCCGAAATTCGAAACCAA-BHQ1-3’；
组11：上游引物：5’-GGTTGTTTGAGGGATTATGTTTT-3’
下游引物：5’-ATTCTTTTCAAACTTTATTTCACAC-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-AACCCGAAAACGTCCTACTATACTC-BHQ1-3’；
组12：上游引物：5’-TTGAATG(C/T)GTGTGAAATAAAGTT-3’
下游引物：5’-CAAATAAAACACTAAAACTCCAAAAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CCAACGCCGTACCCGATC-BHQ1-3’
在本发明的又一个实施方案中，所述定量检测试剂盒还包含检测ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：
组13：上游引物：5’-AGGGATAAAGGGTTGAGATTGT-3’
下游引物：5’-TAAAAACCACTACTTTAACCCCTAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCCGAAACACTAAACCGAACA-BHQ1-3’；
组14：上游引物：5’-GTGTAGATAGGATTTTATTGTTGTTT-3’
下游引物：5’-AACGCTACGACTCACGTCTATAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCAAAACGAAAAAATCGCTTAA-BHQ1-3’；
组15：上游引物：5’-GTGTAGATAGGATTTTATTGTTGTTTA-3’
下游引物：5’-ACCTTAAACACCTCAATACATAACC-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCGAACGCTACGACTCACG-BHQ1-3’；
组16：上游引物：5’-TTTGAATTGTTGGATTTAATGTTAT-3’
下游引物：5’-CACACAAACATAAACACCCATCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CACACGCCCCGTTTACTTTC-BHQ1-3’；
组17：上游引物：5’-GGG(C/T)GTGTGAAAAGATGGG-3’
下游引物：5’-CC(A/G)ACAATACTAACTACAACACACC-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CCTCCCCCGTCCCGAAAT-BHQ1-3’；
组18：上游引物：5’-(C/T)GGGT(C/T)GGGTGTGTTGTAG-3’
下游引物：5’-AAAAC(A/G)AACCAACACCTCCA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CGCCTTTACGACCGACCGT-BHQ1-3’；
组19：上游引物：5’-(C/T)GTGTGGGGTTTA(C/T)GGAA(C/T)-3’
下游引物：5’-ACACAAC(A/G)AAACTCC(A/G)TCTCA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CTAAACACGCGCCTCCGC-BHQ1-3’；
组20：上游引物：5’-TATTTATTTTTGAGA(C/T)GGAGTT-3’
下游引物：5’-ACTC(A/G)AAAAACTAAAACAAAAAAATC-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-AATAAACCGAAATCTCGCCACT-BHQ1-3’；
组21：上游引物：5’-AGTGGCGAGATTT(C/T)GGTTTAT-3’
下游引物：5’-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCGAACGTAATAACGAACGC-BHQ1-3’；
在本发明中，上述核苷酸序列分别针对不同目的基因进行检测。在优选的实施方案中，所述定量检测试剂盒包含用于检测rRNA_pseudogene，HECTD1和/或ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列中各一组核苷酸序列。例如，包括但不限于，所述试剂盒中包含的核苷酸序列由组1、组4和组13组成；或者所述试剂盒中包含的核苷酸序列由组2、组6和组20组成。
在本发明进一步地实施方案中，所述试剂盒包含用于检测ACTB基因甲基化程度的核苷酸序列，具体如下：
组22：上游引物：5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’
下游引物：5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1-3’。
在本发明的实施方案中，所述定量检测试剂盒还包含如下组分：2×GoldstarTaqMan Mixture、阳性对照和阴性对照。进一步地，所述阳性对照可以为Qiagen EpiTectmethylated DNA；所述阴性对照为Qiagen EpiTect unmethylated DNA。
本领域公知，ACTB基因作为参照基因广泛应用于DNA甲基化检测中。
在本发明中，所述试剂盒的检测方法如下：20μl的荧光定量PCR反应体系的组成为：2×Goldstar TaqMan Mixture 10.0ul；上、下游引物各1.0μl(5μM)；探针1.0μl(2μM)；H2O 5.0μl，DNA样本模板2.0μl。荧光定量PCR反应条件如下：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃复性45s，共45个循环，期间连续采集荧光信号；(3)40℃维持。每例标本设三个复孔，Qiagen EpiTect methylated DNA和Qiagen EpiTect unmethylated DNA作为阳性、阴性对照，水为空白对照。
在本发明中，所述DNA样本可以来源于任何生物样品；更优选地，所述待测DNA选自细胞、组织(包括石蜡包埋组织)、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液，粪便、及其他分泌物。
在本发明中，核苷酸序列中“C/T”是指该位置碱基选自C或T中一种碱基，“A/G”是指该位置碱基选自A或G中的一种碱基。
本发明的目的之二是提供上述试剂盒在制备用于结直肠癌早期诊断试剂中的应用。
本发明通过荧光定量PCR技术检测人体血浆或血清中是否存在大肠癌早期目标基因启动子区甲基化修饰变化，设计巧妙，解决血浆中DNA含量少、丢失率高、带有致癌污染物等缺陷，相对传统结直肠癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短等显著优点，检测结果稳定可靠。该目标基因是由rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843所组成。
附图说明
图1是MethyLight荧光定量rRNA pseudogene基因的PCR扩增曲线(组1-组3)；
图2是MethyLight荧光定量HECTD1基因的PCR扩增曲线(组4-组12)；
图3是MethyLight荧光定量ZNF843基因的PCR扩增曲线(组13-组21)；
图4是MethyLight荧光定量ACTB基因的PCR扩增曲线(组22)。
具体实施方式
下面将结合附图进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
需要指出的是，下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南(Sambrook J，et al.2008.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rd Ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1、研究对象和样本的收集
本研究收集了来自宁波市医院的100例结直肠癌患者和100例健康人，所有患者均经病理确诊。用含EDTA-K2的5ml带盖无菌塑料抗凝管抽取人外周静脉血2ml，室温状态下放置48小时内以3000rpm离心10min，收集血浆；再次以12000rpm离心10min，获得无血细胞成分的血浆，以1.5ml的离心管以每管200μl分装，-80℃保存，用于日后血浆标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。
2、血浆全基因组DNA的提取
取血浆200μl，使用Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取游离DNA，提取过程严格按说明书进行。再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，ThermoFisher Scientific)检测所得DNA的纯度和浓度备用。
3、甲基化修饰
采用EZ DNA Methylation GoldTM Kit甲基化转化试剂盒(Zymo research，美国)，严格按照试剂盒说明步骤进行操作。经此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)。
4、MethyLight实时荧光定量PCR
20μl的荧光定量PCR反应体系的组成为：2×Goldstar TaqMan Mixture 10.0μl；上、下游引物各1.0μl(5μM)；探针1.0μl(2μM)；H2O 5.0μl，样本模板2.0μl。荧光定量PCR反应条件如下：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃复性45s，共45个循环，期间连续采集荧光信号；(3)40℃维持。每例标本设三个复孔，Qiagen EpiTect methylated DNA和Qiagen EpiTect unmethylated DNA作为阳性、阴性对照，水为空白对照。
本实施例中，采用的引物及Taqman探针序列如下：
rRNA_pseudogene基因甲基化检测：
上游引物：5’-GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3’
下游引物：5’-AAAACCTAAAAACCTCAAATTATTT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3’；
HECTD1基因甲基化检测：
上游引物：5’-AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3’
下游引物：5’-AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CAACGTAAATCGTTATTTTAAAACGTA-BHQ1-3’；
ZNF843基因甲基化检测：
上游引物：5’-AGGGATAAAGGGTTGAGATTGT-3’
下游引物：5’-TAAAAACCACTACTTTAACCCCTAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCCGAAACACTAAACCGAACA-BHQ1-3’
参照基因ACTB：
上游引物：5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’
下游引物：5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1-3’。
5、数据计算
Roche LightCycler 480荧光定量PCR仪的计算过程是首先通过ACTB参照基因来对目的基因进行相对定量，然后再用阳性对照DNA的相对定量对实验样品值进一步作归一化处理，通过以下换算得到甲基化百分比参数(PMR)：
PMR＝(GENEsample/REFsample)/(GENEpositive/REFpositive)×100％
其中，GENE为目的基因，REF为参照基因，sample为实验样本，positive为甲基化阳性对照DNA。PMR值越高，代表甲基化水平越高；PMR值越低，代表甲基化水平越低。
6、结果
本次实验采用SPSS 18.0对数据进行整理分析，MethyLight结果运用两独立样本t检验进行统计学处理。我们发现用MethyLight法发现：在结直肠癌患者血浆DNA中rRNA_pseudogene和HECTD1基因启动子区的甲基化率低于健康人，且差异有统计学意义(P值均小于0.05，见表1)，ZNF843基因启动子区的甲基化率均高于健康人，且差异有统计学意义(P值均小于0.05，见表1)。
MethyLight法检测rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843启动子区甲基化，用于诊断结直肠癌的敏感性分别为98.3％，96.7％，90％，特异性分别为96.7％，95.0％，91.7％。三者联合检测直结肠癌的灵敏度为100％，特异性为100％，诊断准确率为1。
本发明试剂盒可用于实时定量检测直结肠癌患者血清DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度，具有以下显著特点：(1)操作简便，周期短。该试剂盒可同时测定60个样本，大大缩短检测时间，适合医院或研究所大规模推广应用。(2)稳定性。该试剂盒在-20℃温度下可保存12个月，其灵敏度和特异度都没有下降。
表1MethyLight方法中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化水平在病例组与对照组间的比较
Figure BDA0000981345820000101
注：N表示样本个数，P值小于0.05，具有统计学意义。
实施例2rRNA_pseudogene基因启动子区甲基化修饰变化灵敏度检测
取实施例1中的结肠癌患者血浆样本(PMR＝8.3％)；按照实施例1的方法进行血浆全基因组DNA提取以及甲基化修饰获得待测DNA样本(DNA浓度50ng/μl)；然后对待测DNA样本用PBS缓冲液稀释；稀释比例分别为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800，然后按照实施例1的检测方法分别采用组1至组3列出的引物及探针序列对稀释的待测DNA样本进行检测，直至荧光检测中在45个循环内没有出现PCR扩增曲线，以可以出现扩增曲线及可以计算CT值的样本作为最低检测限。
结果表明，组1至组3列出的引物及探针序列在待测DNA样本稀释800倍的情况下仍然可以检测rRNA_pseudogene基因甲基化程度。在本测试中，组3的上游引物为5’-CGGGAGTCGCAGGGAAGGGG-3’。
还需要指出的是，针对组3列出的引物及探针序列，本发明也进行了相关测试，并取得了类似结果，其中，组3的上游引物序列如下：
5’-TGGGAGCCGTAGGGAAGGGG-3’
5’-CGGGAGCCGCAGGGAAGGGG-3’
5’-TGGGAGTTGCAGGGAAGGGG-3’
5’-CGGGAGCTGCAGGGAAGGGG-3’
实施例3HECTD1基因启动子区甲基化修饰变化灵敏度检测
取实施例1中的结肠癌患者血浆样本(PMR＝12.6％)；按照实施例1的方法进行血浆全基因组DNA提取以及甲基化修饰获得待测DNA样本(DNA浓度50ng/μl)；然后对待测DNA样本用PBS缓冲液稀释；稀释比例分别为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800，然后按照实施例1的检测方法分别采用组4至组12列出的引物及探针序列对稀释的待测DNA样本进行检测，直至荧光检测中在45个循环内没有出现PCR扩增曲线，以可以出现扩增曲线及可以计算CT值的样本作为最低检测限。
结果表明，组4至组12列出的引物及探针序列在待测DNA样本稀释600倍的情况下仍然可以检测HECTD1基因甲基化程度。
本测试中，组7的下游引物为5’-ATAAAACCCAAAACTATCCTCC-3’；
组8的下游引物为5’-ACTAACCCCTTTATTCCCC-3’；
组12的上游引物为5’-TTGAATGCGTGTGAAATAAAGTT-3’
另外，在组7、8和12的其他测试中，也取得类似的技术效果，具体来说，
组7的下游引物为5’-GTAAAACCCAAAACTATCCTCC-3’；
组8的下游引物为5’-GCTAACCCCTTTATTCCCC-3’；
组12的上游引物为5’-TTGAATGTGTGTGAAATAAAGTT-3’；
这些序列也取得极佳的测试效果。
实施例4ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化灵敏度检测
取实施例1中的结肠癌患者血浆样本(PMR＝10.2％)；按照实施例1的方法进行血浆全基因组DNA提取以及甲基化修饰获得待测DNA样本(DNA浓度50ng/μl)；然后对待测DNA样本用PBS缓冲液稀释；稀释比例分别为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800，然后按照实施例1的检测方法分别采用组13至组21列出的引物及探针序列对稀释的待测DNA样本进行检测，直至荧光检测中在45个循环内没有出现PCR扩增曲线，以可以出现扩增曲线及可以计算CT值的样本作为最低检测限。
结果表明，组13至组21列出的引物及探针序列在待测DNA样本稀释600倍的情况下仍然可以检测ZNF843基因甲基化程度。
在本测试中，组17的上下游引物序列为：上游引物：5’-GGGCGTGTGAAAAGATGGG-3’；下游引物：5’-CCAACAATACTAACTACAACACACC-3’；
组18的上下游引物序列为：上游引物：5’-CGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3’；下游引物：5’-AAAACAAACCAACACCTCCA-3’；
组19的上下游引物序列为：上游引物：5’-CGTGTGGGGTTTACGGAAC-3’；下游引物：5’-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3’
组20的上下游引物序列为：上游引物：5’-TATTTATTTTTGAGACGGAGTT-3’；下游引物：5’-ACTCAAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3’；
组21的上下游引物序列为：上游引物：5’-AGTGGCGAGATTTCGGTTTAT-3’；下游引物：5’-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3’。
另外，在组7、8和12的其他测试中，也取得类似的技术效果，具体来说，
组17的上下游引物序列为：上游引物：5’-GGGTGTGTGAAAAGATGGG-3’；下游引物：5’-CCAACAATACTAACTACAACACACC-3’；
组17的上下游引物序列为：上游引物：5’-GGGTGTGTGAAAAGATGGG-3’；下游引物：5’-CCGACAATACTAACTACAACACACC-3’；
组17的上下游引物序列为：上游引物：5’-GGGCGTGTGAAAAGATGGG-3’；下游引物：5’-CCGACAATACTAACTACAACACACC-3’；
组18的上下游引物序列为：上游引物：5’-CGGGTTGGGTGTGTTGTAG-3’；下游引物：5’-AAAACAAACCAACACCTCCA-3’；
组18的上下游引物序列为：上游引物：5’-TGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3’；下游引物：5’-AAAACAAACCAACACCTCCA-3’；
组18的上下游引物序列为：上游引物：5’-CGGGTCGGGTTTGTTGTAG-3’；下游引物：5’-AAAACGAACCAACACCTCCA-3’；
组18的上下游引物序列为：上游引物：5’-TGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3’；下游引物：5’-AAAACGAACCAACACCTCCA-3’；
组19的上下游引物序列为：上游引物：5’-CGTGTGGGGTTTACGGAAC-3’；下游引物：5’-ACACAACGAAACTCCGTCTCA-3’；
组19的上下游引物序列为：上游引物：5’-TGTGTGGGGTTTATGGAAC-3’；下游引物：5’-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3’；
组19的上下游引物序列为：上游引物：5’-CGTGTGGGGTTTATGGAAC-3’；下游引物：5’-ACACAACGAAACTCCATCTCA-3’；
组19的上下游引物序列为：上游引物：5’-TGTGTGGGGTTTACGGAAC-3’；下游引物：5’-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3’；
组20的上下游引物序列为：上游引物：5’-TATTTATTTTTGAGACGGAGTT-3’；下游引物：5’-ACTCGAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3’；
组20的上下游引物序列为：上游引物：5’-TATTTATTTTTGAGATGGAGTT-3’；下游引物：5’-ACTCGAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3’；
组20的上下游引物序列为：上游引物：5’-TATTTATTTTTGAGATGGAGTT-3’；下游引物：5’-ACTCAAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3’；
组21的上下游引物序列为：上游引物：5’-AGTGGCGAGATTTTGGTTTAT-3’；下游引物：5’-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3’。
这些序列在测试中也取得极佳的测试效果，待测DNA样本稀释600倍的情况下仍然可以检测ZNF843基因甲基化程度。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
序列表
<110> 上海汇真生物科技有限公司
<120> 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒
<141> 2019-10-14
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtttgggat tttagatttt ttt 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaacctaaa aacctcaaat tattt 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttcgattc gatttttttg tttttg 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n是T或C
<400> 4
ggaaggggng ggaaaattat 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatccctaaa cccttccct 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctacgctcc ccataaaatc cga 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是T或C
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n是T或C
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n是T或C
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n是T或C
<400> 7
ngggagnngn agggaagggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n是A或G
<400> 8
acccgacacn acctaaaact 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctccgaccc gatctttcta cc 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaggaatat gatgaaggaa tgtat 25
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaaaaaaca tacaactaat aaccct 26
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caacgtaaat cgttatttta aaacgta 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agaattaaat ttttatagtg ttttttt 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caacaaccta atcaacttat atactct 27
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaacactctt acgtccaaac gtact 25
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaaaaggaa aggttaaaag taaatg 26
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccaactaccc tatcttataa aactaaa 27
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cattcgttcg aatccgtaac ct 22
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tataagatag ggtagttggt taaaaaa 27
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是A或G
<400> 20
ntaaaaccca aaactatcct cc 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcaaaacgc ttacgaaacg ctt 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n是C或T
<400> 22
gaaggtttgg tagngaattt t 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是A或G
<400> 23
nctaacccct ttattcccc 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgattacccg cgccaaaa 18
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taggttggag tgaggtggta tta 23
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acaacataaa cctaatctct acaaaaa 27
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccaaatacga taacgcacac ct 22
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttttttgtag agattaggtt tatgttg 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcccaacact ttataatttt actctct 27
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacccgaaat tcgaaaccaa 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggttgtttga gggattatgt ttt 23
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
attcttttca aactttattt cacac 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aacccgaaaa cgtcctacta tactc 25
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n是C或T
<400> 34
ttgaatgngt gtgaaataaa gtt 23
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
caaataaaac actaaaactc caaaaa 26
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccaacgccgt acccgatc 18
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agggataaag ggttgagatt gt 22
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
taaaaaccac tactttaacc cctaa 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acccgaaaca ctaaaccgaa ca 22
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtgtagatag gattttattg ttgttt 26
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aacgctacga ctcacgtcta taa 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
accaaaacga aaaaatcgct taa 23
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtgtagatag gattttattg ttgttta 27
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
accttaaaca cctcaataca taacc 25
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
accgaacgct acgactcacg 20
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tttgaattgt tggatttaat gttat 25
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cacacaaaca taaacaccca tct 23
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cacacgcccc gtttactttc 20
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n是C或T
<400> 49
gggngtgtga aaagatggg 19
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n是A或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 50
ccnacaatac taactacaac acacc 25
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cctcccccgt cccgaaat 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n是C或T
<400> 52
ngggtngggt gtgttgtag 19
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n是A或G
<400> 53
aaaacnaacc aacacctcca 20
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cgcctttacg accgaccgt 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n是C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n是C或T
<400> 55
ngtgtggggt ttanggaan 19
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n是A或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n是A或G
<400> 56
acacaacnaa actccntctc a 21
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctaaacacgc gcctccgc 18
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n是C或T
<400> 58
tatttatttt tgaganggag tt 22
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n是A或G
<400> 59
actcnaaaaa ctaaaacaaa aaaatc 26
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
aataaaccga aatctcgcca ct 22
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n是C或T
<400> 61
agtggcgaga tttnggttta t 21
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aaatcccttc tctactaaaa atacaaa 27
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
accgaacgta ataacgaacg c 21
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tggtgatgga ggaggtttag taagt 25
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aaccaataaa acctactcct cccttaa 27
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims (3)

1.一种用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒；其通过实时荧光定量PCR检测受试者血浆或血清样本中游离DNA的rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化，来辅助判断结直肠癌的易感性或发病；
所述定量检测试剂盒是通过PCR引物及Taqman探针来完成检测的，其包含检测rRNA_pseudogene基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列为：
组1：上游引物：5’-GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3’
下游引物：5’-AAAACCTAAAAACCTCAAATTATTT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3’；
所述定量检测试剂盒还包含检测HECTD1基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列为：
组4：上游引物：5’-AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3’
下游引物：5’-AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-CAACGTAAATCGTTATTTTAAAACGTA-BHQ1-3’；
所述定量检测试剂盒还包含检测ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列为：
组13：上游引物：5’-AGGGATAAAGGGTTGAGATTGT-3’
下游引物：5’-TAAAAACCACTACTTTAACCCCTAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCCGAAACACTAAACCGAACA-BHQ1-3’；
所述试剂盒包含用于检测ACTB基因甲基化程度的核苷酸序列，具体如下：
组22：上游引物：5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’
下游引物：5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’
荧光定量探针：5’-6-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的无创甲基化定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测试剂盒还包含如下组分：2×Goldstar TaqMan Mixture、阳性对照和阴性对照。
3.权利要求1或2所述试剂盒在制备用于结直肠癌早期诊断试剂中的应用。
CN201610291803.6A 2016-05-04 2016-05-04 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒 Active CN105950723B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610291803.6A CN105950723B (zh) 2016-05-04 2016-05-04 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610291803.6A CN105950723B (zh) 2016-05-04 2016-05-04 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105950723A CN105950723A (zh) 2016-09-21
CN105950723B true CN105950723B (zh) 2020-04-21

Family

ID=56913986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610291803.6A Active CN105950723B (zh) 2016-05-04 2016-05-04 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105950723B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108118091B (zh) * 2017-11-22 2020-12-15 宁波大学 可用于检测与结直肠癌相关的prmt6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
CN108796080B (zh) * 2018-06-06 2022-06-07 苏州唯善生物科技有限公司 用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561258A (zh) * 2014-10-08 2015-04-29 王红卫 一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用
CN105256051A (zh) * 2015-11-11 2016-01-20 首都儿科研究所 一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561258A (zh) * 2014-10-08 2015-04-29 王红卫 一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用
CN105256051A (zh) * 2015-11-11 2016-01-20 首都儿科研究所 一种用于检测先天性巨结肠及相关综合征的致病/易感基因的探针组及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN105950723A (zh) 2016-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108977543B (zh) 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
WO2021128519A1 (zh) Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
CN108866192B (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep1
CN109207592B (zh) 用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用
CN110387421A (zh) 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
WO2023071890A1 (zh) 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒
CN109112216A (zh) 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法
CN108866194B (zh) 一组用于膀胱癌检测的基因及其应用
CN110904231A (zh) 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途
CN109161593B (zh) 环状RNA和microRNA在结直肠癌筛查诊断的应用
CN107630093B (zh) 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途
CN117363733B (zh) Per1和lox双基因甲基化联合诊断的检测引物探针组在制备膀胱癌诊断试剂中的应用
CN105950723B (zh) 用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒
KR102637032B1 (ko) 특정 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 방광암 진단용 조성물 및 이의 용도
CN110724743B (zh) 人血液中结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物及其应用
CN114592066B (zh) 一种新型多靶点肝癌早期检测的组合标志物及其应用
US7217515B2 (en) HURP gene as a molecular marker for bladder cancer
CN111440863A (zh) Kazn基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用
JP2023516525A (ja) Ｄｎａメチル化バイオマーカーの組み合わせ、検出方法および試薬キット
CN111088358B (zh) 结直肠癌分子标志物组合、其用途及引物组和检测试剂盒
CN113278697B (zh) 一种基于外周血内基因甲基化的肺癌诊断试剂盒
CN114959030B (zh) 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN110982901B (zh) 用于侵袭性甲状腺乳头状癌诊断的循环环状rna标志物及应用
WO2024002165A1 (zh) 用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途
WO2024027041A1 (zh) 乳腺癌早期筛查的多重基因甲基化检测荧光定量pcr试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170302

Address after: Shanghai city Pudong District 201207 Zuchongzhi Free Trade Zone Road No. 865 building 4

Applicant after: SHANGHAI REALGEN BIOTECH CO.,LTD.

Address before: Suiyang District Xiang Jun Xi Lu Shangqiu Medical College Hospital of Shangqiu city of Henan Province, 476100 families of 1 unit 201 room

Applicant before: Wang Hongwei

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221227

Address after: November 2013, 1st Floor, Building 13, No. 1881, Zhengbo Road, Lingang New Area, Free Trade Pilot Zone, Pudong New Area, Shanghai

Patentee after: Dikeding (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 201207 Building 4, No. 865, Zuchongzhi Road, Pudong Free Trade Pilot Zone, Shanghai

Patentee before: SHANGHAI REALGEN BIOTECH CO.,LTD.

TR01 Transfer of patent right