CN104561258A

CN104561258A - 一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN104561258A
Application number: CN201410524177.1A
Authority: CN
Inventors: 王红卫; 王琳; 刘元华
Original assignee: 王红卫; 王琳; 刘元华
Current assignee: Shanghai Hui Sheng Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-10-08
Also published as: CN104561258B

Abstract

一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含三对分别检测rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子及基因内体区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的三对分别检测rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；其通过检测与直结肠癌相关的rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区及基因内体甲基化程度辅助诊断直结肠癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于直结肠癌的早期发现和及时治疗。

Description

一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及直结肠癌早期诊断技术领域，特别涉及一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用，尤其指一种能用于检测与直结肠癌相关的rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术

由于生活习惯的改变，我国国民结直肠癌的发病率逐年增高，已高居男女各肿瘤发病率的前3～4位。手术治疗可使早期结直肠癌得到根治，而晚期结直肠癌经化放疗联合分子靶向治疗后平均生存时间仍不足30个月。因此，结直肠癌的早期诊断显得非常重要和迫切。结直肠癌早期诊断金标准的纤维结直肠镜是一种侵入性检查，要求完全彻底的肠道准备，隐私的暴露和镇静等不便之处，难以被人们广泛接受。大便潜血试验是目前临床推荐的结直肠癌早期筛查的标准非侵入手段，然而其敏感性较差，从15％～80％不等，大多文献报道不足30％，特异性也较低，不能满足结直肠癌的早期诊断。近年来研究表明DNA甲基化状态改变与结直肠癌的发生发展关系密切，并且贯穿整个过肿瘤发生发展过程；业已发现多个基因的异常高甲基化在结直肠癌中频繁发生。因此，DNA甲基化的异常有望作为结直肠癌早期诊断的分子标志物。恶性肿瘤患者外周血中存在游离的肿瘤相关DNA已引起肿瘤学界的极大关注，检测肿瘤患者外周血中肿瘤相关标志物是当前肿瘤研究的热点之一。研究人员在多种肿瘤患者外周血中发现与原发肿瘤相同的DNA变异。因此，本研究旨在通过检测直结肠癌患者外周血中DNA基因甲基化作为一种非创伤性直结肠癌临床诊断手段的生物学指标，目前国内尚无该方面的相关报道。

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌的治疗以手术为主，辅助予化疗和免疫治疗等。因此早发现是进行有效治疗和延长患者生命的关键。目前，结肠癌的诊断主要依靠结肠镜的使用。众所周知，结肠镜给患者带来很大的痛苦。在分子诊断和预后判定方面尚无准确、灵敏、特异的方法。

现今血清游离DNA是许多肿瘤及其他相关生物领域的研究热点。大量的临床及临床前期的实验结果表明肿瘤或肿瘤早期患者的血清中含有大量或一定量的游离DNA。这些血清游离DNA主要来自在循环血液中坏死、凋亡的肿瘤细胞；亦有可能由肿瘤细胞直接释放到血液中。这些血清游离DNA已经成为现代肿瘤学的研究热点，为肿瘤的早期诊断、预防和治疗的随访提供了可靠的依据和新的方向。DNA的甲基化在肿瘤的发生、发展和转归过程发挥重要的作用。作为一种表观遗传学的一个重要分支，DNA的甲基化在肿瘤的发病机理研究以及治疗方法的探究以及肿瘤的早期诊断中发挥重要的作用。本项开发计划采用分析早期结肠癌患者血清中游离的DNA中若干基因启动子区的甲基化程度，结合现代的生物信息技术和统计学原理能够早期特异、敏感、准确地诊结肠癌，同时为该患者的治疗随访和预后提供科学的依据。

目前，国内外还没有公开与直结肠癌早期诊断相关的rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度检测试剂盒的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测效率高，针对性强的一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒及其应用，其中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因基因启动子区甲基化水平与直结肠癌的患病率呈正相关。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括三对分别针对rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化特异性扩增引物及三个甲基化特异性测序引物：

rRNA_pseudogene甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGATTTTAGATTTTTTTTGAAGG-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACCTAAAAACCTCAAATTATTTTAAATCA-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性测序引物：

5’-GGATTTTAGATTTTTTTTGAAGGTA-3’

HECTD1甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-GATTGGAGGATAGTTTTGGGTTTTA-3'

HECTD1甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACTTACTACTACTTCTCCAAAACTTC-3″

HECTD1甲基化特异性测序引物：

5’-GTTGTGGTTTTTTAGTATTAAATTT-3’

ZNF843甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGAAAAGGTTTTAGTAGGAGAATGG-3'

ZNF843甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-CCACCCCCTCCACCTAAACAC-3'

ZNF843甲基化特异性测序引物：

5’-TGTTGGTTAGTTTTTTTTTTTTTGA-3’

一种用于直结肠癌早期诊断检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于直结肠癌早期诊断,是检测rRNA_pseudogene

(GACCCGATCTTTCTGCCCTTGATTCAAAACAATCTGAGGTCCCTAG)、HECTD1(CTAAGTTAACTACCTGTGTCTACGAGGAAGGGAAGTTCTGGAGAAGCAG)、

ZNF843(CTTCCCTCCTGATAACACCGACGTGCGTGTGGGGTCCACGGAACG)基因的甲基化程度来判定。

有益效果：本发明的用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒，首次公开了用于检测与直结肠癌相关的rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。以检测rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对直结肠癌早期诊断的检测，检测效率高，针对性强。

具体实施方式

一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括的三对分别针对rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化特异性扩增引物及三个甲基化特异性测序引物：

rRNA_pseudogene甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGATTTTAGATTTTTTTTGAAGG-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACCTAAAAACCTCAAATTATTTTAAATCA-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性测序引物：

5’-GGATTTTAGATTTTTTTTGAAGGTA-3’

HECTD1甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-GATTGGAGGATAGTTTTGGGTTTTA-3'

HECTD1甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACTTACTACTACTTCTCCAAAACTTC-3″

HECTD1甲基化特异性测序引物：

5’-GTTGTGGTTTTTTAGTATTAAATTT-3’

ZNF843甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGAAAAGGTTTTAGTAGGAGAATGG-3'

ZNF843甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-CCACCCCCTCCACCTAAACAC-3'

ZNF843甲基化特异性测序引物：

5’-TGTTGGTTAGTTTTTTTTTTTTTGA-3’

一种用于直结肠癌早期诊断的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于直结肠癌早期诊断。

1、收集100例结直肠癌患者外周血，所以病例均经病理证实，为获昨早期诊断信息，仅选直肠病中临床分期为I或II期患者，III或IV均被排除。患者均排除有直肠癌外其他肿瘤，抽外周血之前未经手术或化疗。另选取100例经直肠镜和病理检查无肿瘤病例为对照组。外周血标本收集后30min内送实验室，立即提取基因组DNA，置于-20℃冻存备用。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

2、基因组DNA的提取

应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo FisherScientific)检测所得DNA的浓度，以供rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区DNA甲基化水平的检测。

3、DNA甲基化水平测定

采用焦磷酸测序技术分别对rRNA_pseudogene

(GACCCGATCTTTCTGCCCTTGATTCAAAACAATCTGAGGTCCCTAG)，HECTD1(CTAAGTTAACTACCTGTGTCTACGAGGAAGGGAAGTTCTGGAGAAGCAG)和

ZNF843(CTTCCCTCCTGATAACACCGACGTGCGTGTGGGGTCCACGGAACG)基因启动子区进行DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：

rRNA_pseudogene甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGATTTTAGATTTTTTTTGAAGG-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACCTAAAAACCTCAAATTATTTTAAATCA-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性测序引物：

5’-GGATTTTAGATTTTTTTTGAAGGTA-3’

HECTD1甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-GATTGGAGGATAGTTTTGGGTTTTA-3'

HECTD1甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACTTACTACTACTTCTCCAAAACTTC-3″

HECTD1甲基化特异性测序引物：

5’-GTTGTGGTTTTTTAGTATTAAATTT-3’

ZNF843甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGAAAAGGTTTTAGTAGGAGAATGG-3'

ZNF843甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-CCACCCCCTCCACCTAAACAC-3'

ZNF843甲基化特异性测序引物：

5’-TGTTGGTTAGTTTTTTTTTTTTTGA-3’

具体实验步骤：

A.采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit；ZYMORESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。

B.取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶(Zymo TaqTM PreMix,ZYMO RESEARCH)，并分别加入rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件分别为：

rRNA_pseudogene基因

首先95℃10min的变性；接着95℃30s，57.3℃40s，72℃50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃7min。

HECTD1基因

首先95℃10min的变性；接着95℃30s，57.9℃40s，72℃50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃7min。

ZNF843基因

首先95℃10min的变性；接着95℃30s，57.6℃40s，72℃50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃7min。

C.焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer；Qiagen)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer；Qiagen)，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer；Qiagen；)和120ml的变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution；Qiagen)；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum PrepFilter Probes；Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5-10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。

D.焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents；Qiagen)对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见表1)。

4、数据分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析；各标本rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843甲基化检出率之间的比较采用卡方检验，P<0.05认为有统计学差异。诊断的敏感性和特异性采用相应公式计算。

结直肠癌外周血rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843甲基化的特性：rRNA_pseudogene(下调)，HECTD1(下调)和ZNF843SEPT9(上调)基因甲基化用于结直肠癌的诊断的敏感性分别为98％，97％，90％，特异性分别为97％，96％，91％，诊断准确率分别为0.98，0.96和0.91。三者联合检测直结肠癌的灵敏度为100％，特异性为100％，诊断准确率为1。

本发明可用于检测与直结肠癌相关的rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为直结肠癌的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。

表1 rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化水平在病例组与对照组间的比较(n＝107)

本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。

Claims

1.一种用于结直肠癌早期诊断的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒内包括三对分别针对rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化特异性扩增引物及三个甲基化特异性测序引物：

rRNA_pseudogene甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGATTTTAGATTTTTTTTGAAGG-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACCTAAAAACCTCAAATTATTTTAAATCA-3'

rRNA_pseudogene甲基化特异性测序引物：5’-GGATTTTAGATTTTTTTTGAAGGTA-3’

HECTD1甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-GATTGGAGGATAGTTTTGGGTTTTA-3'

HECTD1甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-AACTTACTACTACTTCTCCAAAACTTC-3″

HECTD1甲基化特异性测序引物：

5’-GTTGTGGTTTTTTAGTATTAAATTT-3’

ZNF843甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5'-TGGGAAAAGGTTTTAGTAGGAGAATGG-3'

ZNF843甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5'-CCACCCCCTCCACCTAAACAC-3'

ZNF843甲基化特异性测序引物：

5’-TGTTGGTTAGTTTTTTTTTTTTTGA-3’

2.一种如权利要求1所述的用于结直肠癌早期诊断的检测试剂盒的应用，其特征在于：所述的检测试剂盒能用于结直肠癌早期诊断,是检测rRNA_pseudogene(GACCCGATCTTTCTGCCCTTGATTCAAAACAATCTGAGGTCCCTAG)、HECTD1(CTAAGTTAACTACCTGTGTCTACGAGGAAGGGAAGTTCTGGAGAAGCAG)、ZNF843(CTTCCCTCCTGATAACACCGACGTGCGTGTGGGGTCCACGGAACG)基因的甲基化程度来判定。