CN102021233A - 一种定量检测akap12甲基化水平的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属表观遗传学领域，涉及肿瘤的基因诊断，具体涉及AKAP12基因启动子区域的甲基化，尤其对人AKAP12基因甲基化程度的检测。本发明提供了一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法，分别以样品和标准品的DNA为模板进行PCR扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然后根据每个标准品其差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较获得样品AKAP12甲基化百分比。本方法能检测低至1％的甲基化发生，且重复性高、简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控，可以作为肿瘤，尤其是结直肠癌的辅助诊断、监测和治疗。

Description

一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法及其应用

技术领域

本发明属表观遗传学领域，涉及肿瘤的基因诊断，具体涉及AKAP12基因启动子区域的甲基化，尤其对人AKAP12基因甲基化程度的检测。

背景技术

DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在胞嘧啶碱基上的第5位碳原子上增加一个甲基，使其转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应。发生在肿瘤中的甲基化现象，最主要的特点是全基因组的低甲基化和局部位点的高甲基化并存，例如启动子区域的CpG岛。这一现象既被认为是肿瘤抑癌基因失活的机制之一，也是肿瘤良恶性转化的重要判别标志。由于抑癌基因发生改变往往要早于细胞的恶性增生，因此检测抑癌基因的状态可以用于肿瘤发生的早期预测。

以往的一些研究表明在肿瘤组织、外周血(血浆/血清)、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中均可以发现肿瘤相关的甲基化DNA，癌变细胞可以释放DNA到外周血或者体液中，因而可以检测到肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。一项对肺癌患者血清中游离循环DNA的检测发现，大多数的肺癌患者血清中都存在一些基因启动子区高甲基化的现象(文献1)。同样Valenzuela等也发现在膀胱癌患者血清中和基因启动子异常甲基化高度相关(文献2)。外周血中高水平的游离DNA，特别DNA的高甲基化现象，常常与肿瘤的发生、发展、对治疗的反应性以及预后等都密切相关，因而可能将高甲基化作为肿瘤筛查、早期诊断、监测转移，预后复发的标记物，并能有助于早期发现有癌变倾向的细胞(文献3-5)。

检测外周血中抑癌基因甲基化水平，作为肿瘤的标记物具有很大潜力，因为甲基化分子标记物拥有以下明显的优势：1，通常甲基化会以“多发”的形式发生在一种肿瘤中，因此，挑选一些位点进行检测就能反映全部基因的状态。2，高甲基化通常发生在相同的基因区域，所以容易锁定目标。3，高甲基化发生在DNA水平，可以避免检测RNA或者免疫组化带来的其他因素的干扰。4，异常的结果是一个阳性的信号，能减少正常细胞的污染带来的困扰(文献6)。如Ellinger J等监测了膀胱癌患者血清中APC，DAPK，GSTP1，PTGS2，TIG1和Reprimo的甲基化DNA，发现三个基因(APC，GSTP1 and TIG1)的甲基化有助于膀胱癌的诊断和预后，对膀胱癌具有潜在的诊断价值。

A激酶锚定蛋白12(AKAP12/AKAP250/Gravin)位于6q24-q25，主要分布为细胞质中。最初是从重症肌无力的患者血清中得到的(文献7)，属于细胞特异性的AKAP。AKAP12主要参与PKA和PKC复合物的形成(文献8)，同时亦是一重要的β2肾上腺素受体复合物的调节基因(文献9)，并参与了蛋白定向、信号转导以及G蛋白偶联受体蛋白信号转导途径。最近的一些研究显示，AKAP12基因除了在多条信号通路中扮演重要的角色之外，还在多种肿瘤中缺失，例如黑素瘤(文献10)、乳腺癌(文献11)、前列腺癌(文献12)、胃癌(文献13)以及慢性淋巴细胞性白血病(文献14)等。同时Choi等人(文献13)在胃癌研究中首先报导了将异常的DNA甲基化与AKAP12表达缺失相对应。提示这可能是一个重要的肿瘤生长的负调节基因，这个基因可能是一个潜在的治疗基因，也有可能是一个有用的肿瘤生物标志物(文献13)。

参考文献：

1.Pan H，Califano J，Ponte JF，et al.Loss of heterozygosity patternsprovide fingerprints for genetic heterogeneity in multistep cancer progression oftobacco smoke-induced non-small cell lung cancer.Cancer Res 2005；65：1664-9.

2.Valenzuela MT，Galisteo R，Zuluaga A，et al.Assessing the use ofp16(INK4a)promoter gene methylation in serum for detection of bladder cancer.EurUrol 2002；42：622-8.

3.Esteller M，Fraga MF，Paz MF，et al.Cancer epigenetics and methylation.Science 2002；297：1807-8.

4.Zhong XY，Ladewig A，Schmid S，et al.Elevated level of cell-freeplasma DNA is associated with breast cancer.Arch Gynecol Obstet 2007；276：327-31.

5.Ellinger J，Haan K，Heukamp LC，et al.CpG island hypermethylation incell-free serum DNA identifies patients with localized prostate cancer.Prostate2008；68：42-9.

6.Yates DR，Rehman I，Abbod MF，et al.Promoter hypermethylationidentifies progression risk in bladder cancer.Clin Cancer Res 2007；13：2046-53.

7.Gordon T，Grove B，Loftus JC，et al.Molecular cloning and preliminarycharacterization of a novel cytoplasmic antigen recognized by myasthenia gravis sera.J Clin Invest 1992；90：992-9.

8.Nauert JB，Klauck TM，Langeberg LK，Scott JD.Gravin，an autoantigenrecognized by serum from myasthenia gravis patients，is a kinase scaffold protein.Curr Biol 1997；7：52-62.

9.Shih M，Lin F，Scott JD，et al.Dynamic complexes of beta2-adrenergicreceptors with protein kinases and phosphatases and the role of gravin.J Biol Chem1999；274：1588-95.

10.Millikin D，Meese E，Vogelstein B，et al.Loss of heterozygosity forloci on the long arm of chromosome 6 in human malignant melanoma.Cancer Res1991；51：5449-53.

11.Tibiletti MG，Sessa F，Bernasconi B，et al.A large 6q deletion is acommon cytogenetic alteration in fibroadenomas，pre-malignant lesions，andcarcinomas of the breast.Clin Cancer Res 2000；6：1422-31.

12.Xia W，Unger P，Miller L，et al.The Src-suppressed C kinasesubstrate，SSeCKS，is a potential metastasis inhibitor in prostate cancer.Cancer Res2001；61：5644-51.

13.Choi MC，Jong HS，Kim TY，et al.AKAP12/Gravin is inactivatedby epigenetic mechanism in human gastric carcinoma and shows growth suppressoractivity.Oncogene 2004；23：7095-103.

14.van′t Veer MB，Brooijmans AM，Langerak AW，et al.Thepredictive value of lipoprotein lipase for survival in chronic lymphocytic leukemia.Haematologica 2006；91：56-63.

发明内容

本发明的目的是建立一种以甲基化敏感的高分辨融解曲线(MS-HRM)法为基础，用于检测组织、外周血、其他体液等标本中AKAP12启动子DNA甲基化的定量方法。

本发明的另一个目的是将上述方法应用于存在AKAP12基因启动子区高甲基化的情况(例如肿瘤发生，特别是结直肠癌)中的辅助诊断或预后监测等的用途。

研究表明，AKAP12在结直肠癌组织中表达下调比率为68.9％且甲基化比率为77.8％，并与肿瘤的分级分期具有相关性。在前期研究的基础上，本发明建立一种甲基化敏感性高分辨融解曲线(MS-HRM)法快速定量检测肿瘤患者外周血中DNA的AKAP12启动子区域甲基化程度方法，具有较高的灵敏度和重复性，能揭示AKAP12甲基化程度与肿瘤之间的相关性，分析其与肿瘤发生，发展，转移和复发之间的关系。本方法创伤小、简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的实时监控，实现对肿瘤患者早期诊断、疾病进程的估计、微转移或复发等全方位监控。

本发明提供了一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法，对样品DNA进行修饰后，分别以样品和标准品的DNA为模板进行PCR扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然后根据每个标准品其差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较获得样品AKAP12甲基化百分比。

上述方法中，以甲基化敏感性高分辨融解曲线制作方法制作标准曲线。

上述方法中，每一份标准品对应一条标准曲线，相对应的甲基化水平分别为100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、1％或者0％。

上述方法中，对样品DNA进行修饰时，将样品DNA中未甲基化的位点与甲基化的位点修饰成不同的基团。可以采用与原先甲基化基团不同的基团对样品进行修饰，也可以使原先未甲基化的位点改变为可以识别的其它基团。例如，非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下来。

上述方法中，进行PCR扩增的引物是5’-GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’和5’-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3’。相应的退火温度设在57-55摄氏度，例如56摄氏度。

上述方法中，进行高分辨率熔解曲线分析的条件可以采取：95℃ 2min，40℃ 2min预处理后，熔解温度76～88℃，每升高0.1℃采集一次数据。

本发明中定量检测AKAP12甲基化水平的方法，具体包括标本处理、甲基化修饰、标准品的制备、PCR扩增、高分辨融解曲线分析及其标准品检测和标准曲线的建立等步骤。

1.标本来源：可以是组织、外周血、其他体液等标本，提取基因组DNA。

2.甲基化修饰：取上述DNA样本1μg，进行亚硫氰酸盐修饰。

3.标准品的制备：以100％甲基化的标准品和100％非甲基化的的标准品混合，制成0-100％浓度的标准曲线。

4.HRM测定方法：使用软件methyprimer设计引物如下：

HRM-F：5’-GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’

HRM-R：5’-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3’

进行PCR扩增，并进行高分辨率熔解曲线分析，条件为：95℃ 2min，40℃2min预处理后，熔解温度76～88℃，每升高0.1℃采集一次数据。获得高分辨率熔解曲线图，采集相应的荧光信号。

5.标准曲线的建立：用HRM方法检测0-100％标准品荧光信号强度，减去0％标准品荧光信号强度，得到差异荧光信号强度，以标准品的百分含量为横坐标，以差异显示的荧光强度为纵坐标，据此建立双对数标准曲线。

6.未知标本的检测：用HRM方法检测未知样品得到荧光信号强度，分别减去0％的标准品荧光信号强度，得到差异显示荧光信号强度，据此根据标准曲线推算出未知标本的AKAP12甲基化的百分比。

7.HRM方法的重复性和敏感度：取甲基化标准品重复检测4次，观察检出最低的百分比含量以及批内和批间的CV。

8.统计学分析：AKAP12甲基化程度与病理参数的相关性采用Fisher’s检验分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

本发明的定量检测AKAP12甲基化水平的方法可用于制备肿瘤诊断试剂。

本发明还提供了定量检测AKAP12甲基化水平的方法在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

本发明中，可为临床表现为原因不明的排便习惯改变、原因不明的缺铁性贫血、消瘦、乏力、或者原因不明的肠梗阻、腹部肿块、腹痛等，疑有结直肠癌的患者检测AKAP12甲基化水平，协助结直肠癌的诊断或者筛查。

本发明中，可采用该方法对有慢性结肠炎、结肠腺瘤性息肉，特别是家族性结肠息肉病患者，应重点进行癌前普查。

本发明中，可采用该方法根据AKAP12基因甲基化的程度，推测病理进程，能有助于AKAP12启动子区域甲基化升高的情况，特别是肿瘤，尤其是结直肠癌的临床治疗效果和预后检测等。

本发明还提供了一种定量检测AKAP12甲基化水平的试剂盒。该试剂盒含有制作标准曲线的标准品、阳性质控和阴性质控反应体系。

每一份标准品对应一条标准曲线，相对应的甲基化水平分别为100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、1％或者0％。

上述试剂盒中，进行PCR扩增的引物是5’-GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’和5’-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3’。

阳性质控和阴性质控反应体系包括PCR扩增的阳性对照和阴性对照等。

本发明中，按常规方法制备含有上述标准品、阳性质控、阴性质控反应体系的试剂盒，有望运用到临床。

经本研究证实，通过AKAP12甲基化程度发现其与肿瘤之间存在相关性，特别是肿瘤的病理级别和恶性程度具有相关性。本方法能检测低至1％的甲基化发生，且创伤小(外周血等标本)、重复性高，且简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控。该方法的建立无疑对存在AKAP12甲基化异常升高的情况，特别是肿瘤，尤其是结直肠癌的诊断、监测和治疗都具有一定的辅助作用。

附图说明

图1-图4：运用HRM方法制作甲基化标准曲线：100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、1％和0％甲基化标准品的HRM熔解曲线。

图1：通过定量PCR检测，显示所有的标准品的起始量均处于同一检测水平。

图2：标准品在融解温度从76℃上升到88℃的过程中，显示的荧光信号。

图3：每个标准品检测的荧光信号减去0％的未甲基化的标准品的荧光信号(即差异显示荧光信号)。

图4：融解曲线显示PCR产物反应的特异性。

图5：标准品所对应的荧光信号的强度取双对数得到的标准曲线。其线性方程为y＝0.4759x+0.8708，其中R²＝0.9755。

图6-8：结直肠癌标本中出现不同程度甲基化(标本1和标本2，如图6和7所示)，获得各自的差异荧光信号的强度，根据线性方程式，计算出待测标本的甲基化程度的百分数，待测样本及其不同的病理分级得到的百分比的结果分布(图8)，在这一系列浓度曲线中的相应位置则代表了其甲基化程度的高低。

具体实施方式

检测结直肠癌患者以及健康者的AKAP12基因甲基化程度

1.标本来源：

在经病理确诊的80例结直肠癌患者以及健康志愿者20例外周血标本，分离血清，使用QIAamp DNA Extract Kit(QIAGEN，德国)提取基因组DNA。

2.甲基化修饰：取上述DNA样本1μg，使用EZ DNA Methylation-Gold Kit，按照说明书进行甲基化修饰。

3.标准品的建立

以CpGenome Universal Methylated DNA(Chemicon，美国)作为100％甲基化的标准品，以100％非甲基化的健康人外周血DNA作为稀释剂，分别制成100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、1％和0％系列浓度的标准曲线。

4.HRM测定方法的建立：使用软件methyprimer设计引物如下：HRM-F：5’-GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’，HRM-R：5’-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3’，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增条件：95℃ 5min，94℃30s、56℃ 30s、72℃ 30s，40个循环后，72℃ 5min延伸。使用ABI 9700扩增后，将样品管转移到ROTOR Gene 6000，进行高分辨率熔解曲线分析，条件为：95℃ 2min，40℃ 2min预处理后，熔解温度76～88℃，每升高0.1℃采集一次数据。获得高分辨率熔解曲线图，获得的荧光信号。

结果显示：如图1所示，运用HRM方法制作甲基化标准曲线：100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、1％和0％甲基化标准品的HRM熔解曲线从右往左依次排列(如图1-4所示)。甲基化修饰的主要原理是：亚硫酸氢盐可以将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶仍然以胞嘧啶保留下来，用它处理样本后，再进行PCR扩增，由于甲基化的序列G∶C含量比较高，因此，Tm值也比相应的非甲基化序列高，Tm值与甲基化程度成正比。所以在熔解曲线图中，Tm值随着甲基化程度的升高而升高，曲线从左往右依次分开排列，因此能精确地划分标本甲基化程度。图1表示通过定量检测的荧光曲线，显示所有的标准品的起始量均处于同一检测水平。图2显示标准曲线在融解温度从76℃上升到88℃的过程中，显示出荧光信号的差异。图3为每个浓度的标准品检测的荧光信号减去0％的未甲基化的标准品的荧光信号(即差异显示的荧光信号)的图。图4为显示了检测反应的特异性。

5.标准曲线的建立：用HRM方法检测0-100％标准品得到的荧光信号的强度，减去0％的标准品的荧光信号的强度，得到差异显示的荧光信号强度，据此建立双对数标准曲线。

结果显示：根据每个浓度的标准品对应的荧光信号的强度(表1所示)，取双对数做图，得到标准曲线如图5所示，得到的线性方程为y＝0.4759x+0.8708，其中R2＝0.9755。本研究探索采用HRM方法，使用商品化的100％甲基化标准品，建立甲基化标准曲线，以定量检测样本甲基化程度。

表1AKAP12基因甲基化程度

甲基化百分比(％)	减去0％甲基化DNA后的荧光差异
		1008060402010510	62.9758.0152.8845.3136.4122.4712.538.080

6.未知标本的检测：用HRM方法检测未知样品得到的荧光信号的强度，分别减去0％的标准品的荧光信号的强度，得到差异显示的荧光信号强度，据此根据标准曲线推算出未知标本的AKAP12甲基化的百分比。

结果显示：结果显示80例结直肠癌标本中有38例(47.5％)出现不同程度甲基化(标本举例如图6和7所示)，后根据各自的差异荧光信号的强度，利用线性方程式，推测出待测标本的甲基化程度的百分数，待测样本及其不同的病理分级得到的百分比的结果分布(图8)，在这一系列浓度曲线中的相应位置则代表了其甲基化程度的高低。本实验中，我们发现外周血中AKAP12的甲基化程度与结直肠癌的病理分级和恶性程度成正比(如表2所示)，这预示AKAP12启动子甲基化改变与癌变早期相关，可以成为评估AKAP12甲基化异常升高的疾病，特别是肿瘤，尤其是结直肠癌恶性程度的重要指标。本研究也证明AKAP12启动子甲基化水平与肿瘤恶性程度密切相关，可作为判断前列腺癌恶性程度的潜在的分子标志物。

表2

7.HRM方法的重复性和与敏感性：取100％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、1％和0％甲基化标准品重复检测4次，观察检出最低的百分比含量以及批内和批间的CV。

结果显示：实验中选择了3个甲基化程度不同的标本(标本A、B和C)，来计算实验中批内和批间的变异系数(CV)％，同一检测过程中，重复检测4次计算批内差异，为6.14％到9.90％。分4天检测同一标本来计算批间差异，为14.5％到17.2％(如表3所示)。

表3

8.统计学分析：AKAP12甲基化程度与病理参数的相关性采用Fisher’s检验分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

Claims (8)

1.一种定量检测AKAP12甲基化水平的方法，其特征在于，对样品DNA进行修饰后，分别以样品和标准品的DNA为模板进行PCR扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然后根据每个标准品差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较获得样品AKAP12甲基化百分比。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以甲基化敏感性高分辨融解曲线制作方法制作标准曲线。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对样品DNA进行修饰时，将样品DNA中未甲基化的位点与甲基化的位点修饰成不同的基团。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行PCR扩增的引物是5’-GGCGGTTGTTTGGATTTGGGTT-3’和5’-AACACGCCCTACAACAACATCTA-3’。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行高分辨率熔解曲线分析的条件为：95℃2min，40℃2min预处理后，熔解温度76～88℃，每升高0.1℃采集一次数据。

6.权利要求1、2、3、4或者5所述的方法用于制备肿瘤诊断试剂。

7.权利要求1、2、3、4或者5所述的方法在制备诊断结直肠癌诊断试剂中的应用。

8.一种定量检测AKAP12甲基化水平的试剂盒，其特征是该试剂盒含有制作标准曲线的标准品、阳性质控和阴性质控反应体系。

Images