CN103911456B - 一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；其通过检测与阿尔茨海默病相关的脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于阿尔茨海默病的早起发现和及时治疗。

Description

一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病的辅助诊断技术领域，特别涉及一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法，特别指一种能用于检测与阿尔茨海默病相关的脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种系统性神经退行性疾病，其临床表现为高级认知功能低下，主要特征包括脑细胞内神经纤维缠结及细胞外老年斑。阿尔茨海默病患者需要终生护理，因此给社会和家庭带来极大的经济负担。阿尔茨海默病是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找阿尔茨海默病相关基因进而阐明痴呆症发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展阿尔茨海默病的病因研究，且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与阿尔茨海默病的关联性上，但其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了阿尔茨海默病预防及治疗水平的提高。
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor)是一种具有神经营养作用的蛋白质，广泛存在于人的神经系统中。脑源性神经营养因子是由位于11号染色体的脑源性神经营养因子基因(brain-derived neurotrophic factor gene，BDNF)(chr11: 27676439..27743604)编码而成的。国内外已有大量研究报道了BDNF 基因单核苷酸多态性与阿尔茨海默病发病的关系，且研究多集中于Val66Met和C270T多态位点。
目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与阿尔茨海默病相关的脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、针对性强、检测准确率高的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒；通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断阿尔茨海默病，检测方法简单、检测效率高。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：
所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5’- TTAGTATTTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGT -3’；
所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5’- Biotin-CCCCCATCATAACTAAAAATCT -3’；
所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5’- GGGAAAGTTGTTGGG -3’。
为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：包括以下步骤：
步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；
步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增；
步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM甲基化特异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中，在琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温；
步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤四中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。
上述的步骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。
上述的步骤二中采用EZ DNA甲基化试剂盒。
上述的步骤三中PCR扩增条件为：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 40s，72℃ 50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。
上述的步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMark Q24焦磷酸测序。
本发明一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法，所述的检测试剂盒包含一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；其优点在于：通过检测与阿尔茨海默病相关的脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于阿尔茨海默病的早起发现和及时治疗。
附图说明
图1为被检测序列所在区域以及4个CpG位点的相关性示意图；
图2为DNA甲基化水平检测结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：
所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5’- TTAGTATTTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGT -3’；
所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5’- Biotin-CCCCCATCATAACTAAAAATCT -3’；
所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5’- GGGAAAGTTGTTGGG -3’。
一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：包括以下步骤：
步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；
步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
     步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增；
     步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM甲基化特异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中，在琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温；
步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤四中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。
实施例中，步骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。
实施例中，步骤二中采用EZ DNA甲基化试剂盒。
实施例中，步骤三中PCR扩增条件为：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 40s，72℃ 50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。
实施例中，步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMark Q24焦磷酸测序。
脑源性神经营养因子基因启动子区域的高甲基化水平导致阿尔茨海默病基因的低表达，从而影响阿尔茨海默病的发生和发展。因此，脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关，以检测阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对阿尔茨海默病的检测，检测效率高，针对性强。
下面通过实验证明脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关。
1、  研究对象的收集
从宁波市某三甲医院收集阿尔茨海默病患者，痴呆诊断标准依据世界卫生组织的国际疾病分类第10版(ICD-10)，阿尔茨海默病(AD)诊断标准采用NINCDS-ADRDA标准。排除血管性痴呆，路易体痴呆等疾病后，最后确定阿尔茨海默病人44例作为病例组(80.00±8.92岁)，同时收集年龄匹配且无痴呆家族史的62名正常者作为对照组(79.63±7.85岁)。对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测载脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。
2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo Fisher Scientific)检测所得DNA的浓度，以供BDNF基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
3、DNA甲基化水平测定
本实验采用焦磷酸测序技术对BDNF基因启动子区的4个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
(1)甲基化特异性上游引物(Forward primer)
5’- TTAGTATTTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGT -3’，
(2)甲基化特异性下游引物(Reverse primer)
5’- Biotin-CCCCCATCATAACTAAAAATCT -3’，
(3)甲基化特异性测序引物(Sequencing primer)
5’- GGGAAAGTTGTTGGG -3’。
DNA甲基化水平测定的具体步骤：
第一步：采用EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit; ZYMO RESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。
第二步：取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶(Zymo TaqTM PreMix, ZYMO RESEARCH)，并加入上述一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 40s，72℃ 50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。(注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)
第三步：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer; Qiagen;)和120ml的变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen)；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。
第四步：焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen)对第三步中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见图2)。图2中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图2所示CpG1到CpG4的甲基化程度分别为10%，3%，7%，7%。
4、数据分析
本次实验采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的4个CpG位点间存在显著关联(相关系数r > 0.831，p < 0.001，有统计学意义，见图1)(注：p < 0.05时表示有统计学意义，下同)，所以我们把CpG1-CpG4求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异(p = 0.004，见表 1)。因此，我们分性别比较了病例组和对照组间阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平的差异，结果(见表 2)发现CpG2在男性中与阿尔茨海默病存在关联(p = 0.018)，而CpG4在女性中与阿尔茨海默病相关(p = 0.039)。
图1为被检测序列所在区域：具体位置为Chr11:27743743..27743904；以及所检测的4个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.924，CpG2与CpG3的相关系数为0.837）。
表 1 病例组与对照组间的比较(n=108)
分组 病例组 (n=44) 对照 (n=62) p 值
年龄 80.00±8.92 79.63±7.85 0.821
TP (g/L) 68.74±6.80 65.77±9.58 0.135
ALB (g/L) 38.43±3.82 36.65±3.89 0.045
GLB (g/L) 30.31±5.30 30.03±5.70 0.830
A/G 1.31±0.22 1.27±0.23 0.432
ALT (U/L) 13.81±10.51 18.12±13.34 0.183a
ALP (U/L) 78.96±24.27 96.33±62.80 0.147a
TBA (μmol/L) 6.80±3.81 5.96±5.85 0.499
AST (U/L) 20.75±7.19 23.41±11.64 0.348a
Glu (mmol/L) 5.18±1.57 5.51±2.69 0.359b
TG (mmol/L) 1.34±0.77 1.41±0.97 0.896a
TC (mmol/L) 4.43±1.04 4.25±1.24 0.430
HDL-C (mmol/L) 1.06±0.20 1.03±0.30 0.136
ApoA (g/L) 1.06±0.21 0.93±0.20 0.006
ApoB (g/L) 0.66±0.18 0.72±0.26 0.235
Lp(a) (g/L) 179.19±231.22 34.56±27.13 1.68E-04a*
ApoE (mg/L) 37.73±17.44 36.69±10.37 0.800
UREA (mmol/L) 7.72±9.84 6.45±3.42 0.778b
CRE (μmol/L) 82.09±46.59 78.83±29.82 0.700
UA (μmol/L) 308.39±104.87 308.41±111.66 0.999
Hcy (μmol/L) 19.76±10.82 17.64±20.63 0.045a
CRP (mg/L) 6.20±11.72 14.84±25.97 0.014a
BDNF平均甲基化(%) 9.50±4.43 7.45±2.77 0.004
表 2分层后病例组与对照组间的比较 (n=108)
分组 病例组 对照组 p 值
全部 　 　 　
CpG1 (%) 11.82±5.32 9.89±3.13 0.021
CpG2 (%) 6.39±4.27 4.39±1.92 0.002#
CpG3 (%) 9.64±4.24 7.58±3.45 0.007
CpG4 (%) 10.16±4.69 7.95±3.29 0.005
BDNF平均甲基化(%) 9.50±4.43 7.45±2.77 0.004#
男性 　 　 　
CpG1 (%) 10.85±2.87 9.87±2.72 0.191
CpG2 (%) 5.60±1.98 4.42±1.73 0.018
CpG3 (%) 8.25±2.53 7.40±2.79 0.249
CpG4 (%) 8.80±2.91 7.96±3.07 0.303
BDNF平均甲基化(%) 8.38±2.46 7.41±2.39 0.142
女性 　 　 　
CpG1 (%) 12.62±6.67 9.94±4.12 0.150
CpG2 (%) 7.04±5.47 4.29±2.42 0.060
CpG3 (%) 10.79±5.02 8.06±4.85 0.090
CpG4 (%) 11.29±5.58 7.94±3.90 0.039
BDNF平均甲基化(%) 10.44±5.45 7.56±3.67 0.066
注：n表示样本个数，p值小于0.05，具有统计学意义；加#表示多重检测后p值依旧具有统计学意义；加a表示进行过对数转换；加b表示运用非参数秩和检验。
本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>  宁波大学
<120>  一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法
<130> 
<160>  3    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
TTAGTATTTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGT                          
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
CCCCCATCATAACTAAAAATCT
 
<210>  3
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
GGGAAAGTTGTTGGG

Claims (1)

1.一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒包含一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：
所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：
5’- TTAGTATTTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGT -3’；
所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：
5’- Biotin-CCCCCATCATAACTAAAAATCT -3’；
所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：
5’- GGGAAAGTTGTTGGG -3’。
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