CN105886641B - 用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对ACE2基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：5'‑GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG‑3'；甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：5'‑Biotin‑ATTCACCCCATTCTCCTA‑3'；甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：5'‑TTATTAAAAATATAAAAATATTAG‑3'；其优点是能够方便快捷地在分子水平上实现对原发性高血压的检测，检测效率高，针对性强。

Description

用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及原发性高血压的辅助诊断技术领域，特别涉及用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒及其应用，尤其指一种能用于检测与原发性高血压相关的血管紧张素转换酶2(ACE2)基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其应用。
背景技术
原发性高血压(Essential hypertension，EH)是一种常见的慢性非传染性疾病。由于其发病率、患病率高，并且能够导致心脑肾等重要脏器病变的发生和发展，因此原发性高血压已经成为严重威胁人类健康的三大杀手之一。高血压患者在长期治疗疾病的过程中承担着很大的经济压力, 许多国家也为高血压及其并发症的治疗付出了高昂的费用, 但每年仍然出现许多致残者。根据2015年世界卫生统计报告显示，我国18岁以上居民高血压患病率为37.4%，加之较低的知晓率和血压控制率，高血压防治工作一直不容乐观。由于高血压受环境和遗传多重因素的影响，同时缺乏特异性病变组织，针对这些特点，研究高血压具体发病机制尚在探索之中，并且逐渐成为近年来国内外心血管疾病领域专家和学者探讨的热点。
肾素血管紧张素醛固酮(RAAS)系统是机体进行血压调控的主要机制。同时血管紧张素2是其中重要的血管收缩剂，而血管紧张素转换酶2(ACE2)可通过降解血管紧张素2从而调节机体血压变化。国内外已经有大量研究报道了ACE2基因单核苷酸多态性与原发性高血压发病之间的关系，且研究多集中于rs2106809(C > T) 位点。
目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与原发性高血压相关的血管紧张素转换酶2基因启动子区域甲基化程度的试剂盒相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测效率高，针对性强的用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒及其应用，其中血管紧张素转换酶2基因启动子区甲基化水平与原发性高血压的患病率呈正相关。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对ACE2基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：
甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：
5'-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3'；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：
5'-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3'；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：
5'-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3'。
用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于原发性高血压辅助诊断、检测或筛查。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒公开了用于检测与原发性高血压相关的血管紧张素转换酶2基因启动子区域甲基化程度的试剂盒及其应用，血管紧张素转换酶2(ACE2)基因启动子区域的高甲基化水平导致ACE2基因的低表达，从而影响原发性高血压的发生和发展。因此，血管紧张素转换酶2基因启动子区域甲基化水平与原发性高血压的患病率呈正相关。以检测ACE2基因启动子区域甲基化水平为基础的检测试剂盒能够方便快捷地在分子水平上实现对原发性高血压的检测，检测效率高，针对性强，特异性强；同时，以ACE2基因启动子区域甲基化为靶点的药物有望成为原发性高血压辅助诊断、检测和筛选的一种新技术方法。
附图说明
图1为被检测序列所在区域(具体位置为ChrX:15568896-15630451)，以及所检测的5个CPG位点之间的关联性分析结果(例如CPG1与CpG2的Person相关系数为-0.035，CpG2与CpG3的Person相关系数为0.005)；
图 2为甲基化水平检测结果示例(图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示有CpG1到CpG5的甲基化程度分别为73%、35%、 20%、100%、12%)。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对ACE2基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：
甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：
5'-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3'；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：
5'-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3'；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：
5'-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3'。
用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于原发性高血压辅助诊断、检测或筛查。
1、研究对象的收集
从宁波市第七医院收集原发性高血压患者，高血压的诊断标准依据世界卫生组织的国际疾病分类第10版(ICD-10)，原发性高血压(EH)诊断标准采用2013欧洲高血压学会欧洲心脏病学会高血压管理指南的标准。排除糖尿病、继发性高血压、心肌梗死、冠心病、脑卒中、肾脏疾病、药物成瘾或者其他严重的疾病后，最后确定原发性高血压病人96例作为病例组(56.72 ± 8.71)，同时收集年龄(±3岁)、性别匹配且无原发性高血压家族史的96名正常者作为对照组(56.32 ± 8.23)。对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测载脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，迅速于超低温(-80°C)保存血样，以备用于标本统一提取基因组DNA。
2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo FisherScientific)检测所得DNA的浓度，以供ACE2基因启动子区域DNA甲基化水平的检测。
3、DNA甲基化水平测定
本研究采用焦磷酸测序技术对ACE2基因启动子区域的5个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
(1)甲基化特异性上游引物(Forward primer)：
5'-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3' (SEQ ID NO.1)；
(2)甲基化特异性下游引物(Reverse primer)：
5'-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3' (SEQ ID NO.2)；
(3)甲基化特异性测序引物(Sequencing primer)：
5'-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3' (SEQ ID NO.3)。
具体实验步骤：
A、采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(EZ DNAMethylation-GoldTMKit; ZYMORESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。
B、取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶(Zymo TaqTMPreMix, ZYMO RESEARCH)，并加入上述一对ACE2基因启动子区域甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95°C 10min的变性；接着95°C 30s，Tm 52.8 °C 40s，72°C50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72°C 7min。(注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定)
C、焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen)；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量(每样本3μl)转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物(50μl反应体积)中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer; Qiagen;)和120ml的变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen)；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具(PyroMark Vacuum Prep Filter Probes;Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70%乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。
D、焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen)对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析(甲基化水平检测结果示例见图2)。
4、数据分析
本次研究采用SPSS 18.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的5个CpG位点之间大部分不存在显著的关联(相关系数r < 0.436, P < 0.05，见图1)(注：P < 0.05时表示有统计学意义，下同)。进一步研究发现病例组和对照组之间的ACE2基因启动子区域CpG4(调整的P = 0.020)和CpG5(调整的P = 0.036)的甲基化水平存在显著差异。随后我们运用广义多因子降维法分析了5个CpG位点之间的交互作用，检测到5个CpG位点之间的显著的交互作用(OR = 7.33，调整的P = 0.011，见表2)。ROC曲线显示CpG5位点的甲基化水平能很好的预测原发性高血压的发病。
本发明能够用于检测与原发性高血压相关的ACE2基因启动子区域甲基化程度的检测试剂盒具有准确可靠，灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对ACE2基因启动子区域甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为原发性高血压的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
表 1: 病例组与对照组间的比较 (n=192)
注：表1中，n为样本数量；表格数据中，p值小于0.05，具有统计学意义。
表 2: ACE2基因启动子5个CpG位点之间高阶交互作用的GMDR模型
本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波大学
<120> 用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒及其应用
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtagatta agaggttaga ag
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
Biotin-attcacccca ttctccta
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttattaaaaa tataaaaata ttag

Claims (1)

1.用于辅助诊断原发性高血压的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒内包括一对ACE2基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：
甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：
5'-GGGTAGATTAAGAGGTTAGAAG-3'；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：
5'-Biotin-ATTCACCCCATTCTCCTA-3'；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：
5'-TTATTAAAAATATAAAAATATTAG-3'。
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