CN110317869A - 检测apoe基因型的kasp成套引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测APOE基因型的KASP成套引物及试剂盒，属于生物技术领域，KASP成套引物包括检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组、检测单倍体特异性的引物组、FAM荧光接头和HEX荧光接头；检测SNP位点rs429358的引物组包括两条正向引物和一条反向引物，检测SNP位点rs7412的引物组包括两条正向引物和一条反向引物；检测单倍体特异性的引物组包括一条正向引物和两条。该试剂盒包含上述KASP成套引物。该检测APOE基因型的KASP成套引物及试剂盒，可准确检测APOE基因型，解决了KASP不适用于APOE基因型的检测的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测APOE基因型的KASP成套引物。
背景技术
阿兹海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病。APOE基因多态性与AD发病显著相关。APOE基因有六种常见基因型，分别对应APOE蛋白的三种亚型：ε2、ε3和ε4。不同APOE基因型对低密度脂蛋白(LDL)受体的亲和力不同，致使其成为阿兹海默病的重大危险因素。通过检测APOE基因型可以得知个体是否属于易感人群，有助于疾病的诊断与提早治疗。
传统检测APOE基因的方法包括限制性片段长度多态性技术(RFLP)、Sanger测序等。其检测过程繁复，需要人工判断结果，并不适用于商业化检测。现有技术中虽然可使用探针法(TaqmanProbe)进行APOE的双倍体型的检测，但其引物要与荧光直接结合，生产和储存成本较高。竞争性等位基因特异性PCR(KASP)技术是由英国LGC公司开发，已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。但是KASP现阶段并没有用于APOE基因型的检测，这是因为APOE与AD的相关性是以单倍体型出现，针对SNP位点rs429358和rs7412，共有四种已知单倍体型(ε1(C-T)、ε2(T-T)、ε3(T-C)和ε4(C-C))，但使用KASP测定这两个位点时可能出现八种双倍体型结果，此时如果测试的两个位点的结果皆为杂合子时，是无法确定APOE单倍体型的。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种测定APOE基因型的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)成套引物，包括检测单倍体的单倍体特异性HDKASP(Haplotype determining KASP，HDKASP，单倍体决定性竞争性等位基因特异性PCR)引物组，使得在当两个SNP皆为杂合子的情况可以测定APOE的单倍体型。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：检测APOE基因型的KASP成套引物，包括检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组、检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组、FAM荧光接头和HEX荧光接头；
所述检测SNP位点rs429358的引物组包括引物1、引物2和引物3，所述引物1和引物2为正向引物，所述引物3为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；
所述检测SNP位点rs7412的引物组包括引物4、引物5和引物6，所述引物4和引物5为正向引物，所述引物6为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示；
所述检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组包括引物7、引物8和引物9，所述引物7为正向引物，引物8和引物9为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
所述FAM荧光接头和HEX荧光接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
本发明还提供了检测APOE基因型的试剂盒，包括上述的检测APOE基因型的KASP成套引物中检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组和检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组组成的混合引物，以及FAM荧光接头和HEX荧光接头。
本发明的有益效果在于：本发明提供的检测APOE基因型的KASP成套引物及包含该KASP成套引物的试剂盒，可用于检测APOE基因型，相较于传统检测APOE基因型的方法，整个检测过程中人为误差低，适用于大量样本的同时检测，检测周期短，大幅降低了检测时间和人工成本；本申请提供的KASP成套引物，其正反引物皆包含变异位点，使之分别对应检测ε1(FAM荧光)和ε4(HEX荧光)单倍体，进而可准确推断出双倍体型，避免出现误检和漏检，可准确检测APOE基因型，克服了KASP不适用于APOE基因型的检测的问题，有助于阿兹海默病的易感人群的提早发现，相较于Taqman Probe检测APOE的双倍体型，使用本发明提供的试剂盒，只需要设计普通引物，其荧光物可储存于Mastermix中，所需生产成本更低，更适于产业化生产。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式检测APOE双倍体型的结果示意图；
图2所示为本发明具体实施方式检测APOE双倍体型的结果示意图；
图3所示为本发明具体实施方式检测APOE双倍体型的结果示意图；
图4所示为本发明具体实施方式的实施例3的检测结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：通过对KASP成套引物的设计，克服了KASP不适用于APOE基因型的检测的问题。
请参照图1-4所示，本发明的检测APOE基因型的KASP成套引物，包括检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组、检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组、FAM荧光接头和HEX荧光接头；
所述检测SNP位点rs429358的引物组包括引物1、引物2和引物3，所述引物1和引物2为正向引物，所述引物3为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示(见表1)；
所述检测SNP位点rs7412的引物组包括引物4、引物5和引物6，所述引物4和引物5为正向引物，所述引物6为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示(见表1)；
所述检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组包括引物7、引物8和引物9，所述引物7为正向引物，引物8和引物9为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示(见表1)；
所述FAM荧光接头和HEX荧光接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示(见表1)。
表1
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的检测APOE基因型的KASP成套引物及包含该KASP成套引物的试剂盒，可用于检测APOE基因型，相较于传统检测APOE基因型的方法，整个检测过程中人为误差低，适用于大量样本的同时检测，检测周期短，大幅降低了检测时间和人工成本，；本申请提供的KASP成套引物，其正反引物皆包含变异位点，使之分别对应检测ε1(FAM荧光)和ε4(HEX荧光)单倍体，进而可准确推断出双倍体型，避免出现误检和漏检，可准确检测APOE基因型，克服了KASP不适用于APOE基因型的检测的问题，有助于阿兹海默病的易感人群的提早发现，相较于Taqman Probe检测APOE的双倍体型，使用本发明提供的试剂盒，所需生产成本更低，更适于产业化生产。
进一步的，所述引物1、引物4和引物9的5’端均接有FAM荧光接头；所述引物2、引物5和引物8的5’端均接有HEX荧光接头。
本发明的检测APOE基因型的试剂盒，包括上述的检测APOE基因型的KASP成套引物中检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组和检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组组成的混合引物，以及FAM荧光接头和HEX荧光接头。
进一步的，上述的检测APOE基因型的试剂盒中，所述混合引物中正向引物和反向引物的摩尔比为2:1。
进一步的，上述的检测APOE基因型的试剂盒中，所述正向引物的工作浓度为26mM，所述反向引物的工作浓度为13mM。
由上述描述可知，正反引物在PCR扩增反应体系中的浓度分别为26mM和13mM。
实施例1：
检测APOE基因型的试剂盒，包括检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组和检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组组成的混合引物，以及FAM荧光接头和HEX荧光接头、FAM荧光接头和HEX荧光接头，所述混合引物由引物1-9组成；所述引物1-9的核苷酸序列如表1所示。
实施例2：
检测APOE基因型的具体方法：
1)提取待测样品的DNA；
2)采用步骤1所得的待测样品的DNA作为DNA模板，使用实施例1的试剂盒，配置得到PCR反应体系进行PCR扩增；
所述PCR反应体系(5μL)由2.5μL的Master mix、0.07μL的混合引物和2μL的DNA模板、余量无菌水组成，所述Master mix中包括FAM荧光接头、HEX荧光接头、MgCl2、Taq聚合酶、Buffer、dNTP和ROX Passive荧光标记，其中MgCl2的浓度为2.5mM。
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物单倍体型。
其中，PCR反应条件如表2所示。
表2
即，PCR反应程序为：
94℃变性15min，
退火循环：94℃变性20s；61℃退火60s，每循环一次退火温度降0.6℃。共10个循环，降温9次。最后一个循环的退火温度为55.6℃。
延伸循环：94℃变性20s，55℃退火60s，共30个循环。
4)结果判定如图1-3和表3所示。
表3
使用KASP对APOE双倍体型测定结果进行判断。当rs429358或rs7412其中一个位点为纯合子时，双倍体型可以被判断(1-6行)。当两者皆为杂合子时，采用HDKASP步骤，可以进一步确定ε1或ε4单倍体的存在，从而判定双倍体型。其中取ε1和ε4而非ε2和ε3测定是因为：一，ε1为稀有单倍体，使用特异性引物测出ε1可以增加可信度；二，ε4为AD的风险因子，HDKASP的HEX结果在绝大多数情况下可以作为二次认证，重复确认样本为携带者，进而提升了检测的准确性。
实施例3：
使用本发明提供的检测APOE基因型的KASP成套引物，对千人基因组计划中的192名中国人进行APOE基因型的检测，分析结果见图4和表4所示，其中第1-101号为CHB(中国，北京)，102-192号为CDX(中国傣族，西双版纳)；结果显示，这192例样本中只出现了5种双倍体型，并且只有4人的rs429358和rs7412都是杂合子，即ε4/ε2双倍体型，这192个样本中不存在稀有的单倍体型ε1。
表4
综上所述，本发明提供的检测APOE基因型的KASP成套引物及包含该KASP成套引物的试剂盒，可用于检测APOE基因型，相较于传统检测APOE基因型的方法，整个检测过程中人为误差低，适用于大量样本的同时检测，检测周期短，大幅降低了检测时间和人工成本，可准确检测APOE基因型，克服了KASP不适用于APOE基因型的检测的问题，有助于阿兹海默病的易感人群的提早发现。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 深圳达安佶科技有限公司
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Claims (5)
1.一种检测APOE基因型的KASP成套引物，其特征在于，包括检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组、检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组、FAM荧光接头和HEX荧光接头；
所述检测SNP位点rs429358的引物组包括引物1、引物2和引物3，所述引物1和引物2为正向引物，所述引物3为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；
所述检测SNP位点rs7412的引物组包括引物4、引物5和引物6，所述引物4和引物5为正向引物，所述引物6为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
所述检测单倍体特异性的引物组包括引物7、引物8和引物9，所述引物7为正向引物，引物8和引物9为反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
所述FAM荧光接头和HEX荧光接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的检测APOE基因型的KASP成套引物，其特征在于，所述引物1、引物4和引物9的5’端均接有FAM荧光接头；所述引物2、引物5和引物8的5’端均接有HEX荧光接头。
3.检测APOE基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任意一项所述的检测APOE基因型的KASP成套引物中检测SNP位点rs429358的引物组、检测SNP位点rs7412的引物组和检测单倍体的单倍体特异性HDKASP引物组组成的混合引物，以及FAM荧光接头和HEX荧光接头。
4.根据权利要求3所述的检测APOE基因型的试剂盒，其特征在于，所述混合引物中正向引物和反向引物的摩尔比为2:1。
5.根据权利要求4所述的检测APOE基因型的试剂盒，其特征在于，所述正向引物的工作浓度为26mM，所述反向引物的工作浓度为13mM。
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2019
- 2019-08-22 CN CN201910777455.7A patent/CN110317869A/zh active Pending
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