CN108796080B - 用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组 - Google Patents

用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针。SEPT9的正向引物选自SEQ ID NO：1~25的任意一条，SEPT9的反向引物选自SEQ ID NO:26‑51的任意一条，SEPT9的Blocker引物选自SEQ ID NO：52‑67中的任意一条，SEPT9的探针选自SEQ ID NO:68‑90中的任意一条。SDC2的正向引物选自SEQ ID NO：91~117的任意一条，SDC2的反向引物选自SEQ ID NO:118‑143的任意一条，SDC2的Blocker引物选自SEQ ID NO：144‑156中的任意一条，SDC2的探针选自SEQ ID NO:157‑174中的任意一条。相对于现有技术，本发明的有益效果是：同时检测SEPT9和SDC2甲基化水平，灵敏度高，特异性好，用于筛查/检测/诊断早期结直肠癌。

Description

用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种检测生物样本同时检测SEPT9和SDC2甲基化水平的引物和探针组，用于筛查/检测/诊断早期结直肠癌。
背景技术
结直肠癌是一种最常见的恶性肿瘤，2015年中国癌症统计数据显示直肠癌均位列中国男性和女性癌症发病类型的前五位，且结直肠癌在过去十年中呈现出逐年上升的趋势。当前结直肠癌的初治分期比例为：I期占15％；II期占20％-30％；III期占30％-40％；IV期占20％-25％。在生存期方面，I期患者的5年生存率可达90％以上，而IV期患者只有略大于10％的生存率。因此，实现结直肠癌的早期筛查从而达到早诊早治疗对于提高患者的生存率进而提升全面健康水平有着重要意义。肠镜作为结直肠癌筛查的金标存在诸多缺陷，该方法对操作者要求高，同时作为一种侵入性的检查方式，患者的痛苦大、接受度较低，目前的筛查率不足3％，因此导致中国的结直肠癌早期发现率远低于发达国家水平。
目前结直肠癌检测方法有很多种，如粪便隐血试验、结直肠镜检、计算机扫描断层成像(CT)或粪便DNA检测，以上方法目前都得到了一定的应用，但也都存在一定的缺陷。结直肠镜镜检是目前结直肠癌筛查中灵敏度最高的方法，但是该方法要求专业的操作者进行操作，同时该方法价格昂贵，患者的接受度较低，在早期筛查结直肠上存在一定的缺陷。粪便隐血试验是作为一种快速检测方法，在结直肠癌筛查中也有广泛的应用，是特异性较低，因此存在大量的假阳性，而且检测结果易受要饮食和药物的干扰。其它方法如CT只能检测到中晚期的癌症，因此无法在早期筛查中应用；而粪便DNA筛查技术检测结果易被粪便中杂质干扰，而且当前粪便DNA检测方法是同时筛查多个生物标记物，且检测成本极高，当前在中国这样的发展中国家难以推广，同时，过于繁琐的操作步骤，也使得其难以在医院推广使用。
非正常DNA甲基化与很多疾病的发生和维持有着紧密联系，特别是近年来的研究成果表明DNA甲基化在癌症的诱发和维持中起着重要作用，使之成为很多癌症的很好的生物标志物。
SEPT9是一种非常有效的癌症DNA甲基化标记物，已有研究证明SETP9在结直肠癌组织和正常组织中呈现明显的表达差异。多配体蛋白聚糖-2(SDC2)蛋白常作为一种整合膜蛋白起作用，已知其通过胞外基质蛋白受体参与细胞增殖、迁移和细胞间相互作用。SDC2基因在间充质细胞而不是正常结肠组织的上皮细胞中表达，已有研究表明，结直肠癌患者呈现高频SDC2的异常甲基化。
发明内容
本发明针对当前结直肠癌早期筛查/检测/诊断方法的缺陷，提供了一种同时检测生物样本中SEPT9和SDC2基因甲基化水平的引物和探针组，通过提取生物样本中的DNA，采用荧光定量PCR技术，检测生物样本中是否含有甲基化的SEPT9或SDC2基因，从而实现结直肠癌的早期筛查/检测/诊断。
为解上述技术问题，本发明采用如下技术方案：用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针。
SEPT9的正向引物选自SEQ ID NO：1～25的任意一条，SEPT9的反向引物选自SEQID NO:26-51的任意一条，SEPT9的Blocker引物选自SEQ ID NO：52-67中的任意一条，SEPT9的探针选自SEQ ID NO:68-90中的任意一条。
SDC2的正向引物选自SEQ ID NO：91～117的任意一条，SDC2的反向引物选自SEQID NO:118-143的任意一条，SDC2的Blocker引物选自SEQ ID NO：144-156中的任意一条，SDC2的探针选自SEQ ID NO:157-174中的任意一条。
还含有一组内参基因引物探针组，其中所述内参基因为ACTB；所述ACTB的正向引物为SEQ ID NO：175，反向引物为SEQ ID NO:176，ACTB的探针选自SEQ ID NO:177。
检测对象为从生物样本中经过基因组DNA提取、纯化后再使用亚硫酸氢盐转化、再纯化得到的DNA样本(其作为PCR反应体系的DNA模板，亚硫酸氢盐转化后经过常规的纯化操作得到PCR所需DNA模板)。所述的亚硫氢盐为亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠和无水硫酸钠中的一种或多种，亚硫酸氢盐的浓度为8～10M；亚硫酸氢盐转化过程的反应条件为：DNA加入到8～10M亚硫酸氢盐溶液中，70～90℃加热30～60分钟。
SEPT9、SDC2、ACTB甲基化的检测同时在一个荧光定量PCR反应中完成或单独针对一个位点(SEPT9、SDC2或ACTB)进行荧光定量PCR反应。
SEPT9的Blocker引物和/或SDC2的Blocker引物在3’末端修饰磷酸基、C3、C9、C18中的一种。
本发明还提供包含前述的引物和探针组的扩增体系，扩增体系具体组分为
Figure BDA0001686335040000031
本发明还提供用于检测生物样本中SEPT9和SDC2甲基化的引物和探针组作为结直肠癌及其癌前病变的早期筛查/检测/诊断的试剂的应用；还提供前述的扩增体系作为结直肠癌及其癌前病变的早期筛查/检测/诊断的试剂的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：同时检测SEPT9和SDC2甲基化水平，灵敏度高，特异性好，用于筛查/检测/诊断早期结直肠癌。
附图说明
图1为1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SEPT9基因扩增曲线图；
图2为1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SDC2基因扩增曲线图；
图3为SEPT9单一引物探针组和SEPT9与SDC2组合引物探针组检测甲基化SEPT9和效果图；
图4为SDC2单一引物探针组和SEPT9与SDC2组合引物探针组检测甲基化SDC2效果图；
图5为SEPT9和SDC2引物探针组合检测17例结直肠癌组织及对应癌旁组织的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
以已知SEPT9和SDC2基因全甲基化的细胞系的基因组序列为DNA模板，使用8M亚硫酸氢铵溶液，70℃加热60分钟对DNA模板转化后，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后得到转化后DNA模板，再进行PCR反应。PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。
表1实施例1的PCR反应体系
组分 终浓度
PCR反应缓冲液 1X
DNA聚合酶 0.1U/μL
dNTPs混合液 0.4mM
Mg2+ 2mM
SEQ ID NO:20 0.5μM
SEQ ID NO:38 0.5μM
SEQ ID NO:53 0.4μM
SEQ ID NO:79 0.1μM
SEQ ID NO:99 0.2μM
SEQ ID NO:127 0.2μM
SEQ ID NO:144 0.1μM
SEQ ID NO:167 0.1μM
SEQ ID NO:175 0.2μM
SEQ ID NO:176 0.2μM
SEQ ID NO:177 0.1μM
去离子水 补水至15μL
转化后DNA模板 15μL
其中，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:144的3’端分别使用磷酸基和C3修饰。反应体系为15ul反应液加上15ul的转化后DNA模板，总体积30ul。15ul反应液为除了转化后DNA模板以外的其余组分。以下同。
表2PCR反应条件
Figure BDA0001686335040000041
图1为实施例1的1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SEPT9基因扩增曲线，图2为实施例1的1000拷贝，100拷贝和10拷贝甲基化SDC2基因扩增曲线，如图1和2所示，甲基化的SEPT9和SDC2在同样的反应条件下扩增效果良好，检测灵敏度均可达到10拷贝。
实施例2
以已知SEPT9和SDC2基因全甲基化的细胞系的基因组序列为DNA模板，使用9M亚硫酸氢铵溶液，80℃加热40分钟对DNA模板转化后，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后得到转化后DNA模板，再进行PCR反应。单独采用SEPT9引物探针组的PCR反应的组分如表3所示，单独采用SDC2引物探针组的PCR反应的组分如表4所示，同时采用SDC2和SEPT9组合引物探针组的PCR反应的组分如表5所示。实施例2的PCR反应条件如表6所示。
表3单独采用SEPT9引物探针组的PCR组分
组分 终浓度
PCR反应缓冲液 1X
DNA聚合酶 0.1U/μL
dNTPs混合液 0.4mM
Mg2+ 2mM
SEQ ID NO:3 1μM
SEQ ID NO:28 1μM
SEQ ID NO:52 0.8μM
SEQ ID NO:72 0.1μM
SEQ ID NO:175 0.2μM
SEQ ID NO:176 0.2μM
SEQ ID NO:177 0.1μM
去离子水 补水至15μL
转化后DNA模板 15μL
其中，SEQ ID NO:52的3’端使用C9修饰。
表4单独采用SDC2引物探针组的PCR组分
组分 终浓度
PCR反应缓冲液 1X
DNA聚合酶 0.1U/μL
dNTPs混合液 0.4mM
Mg2+ 2mM
SEQ ID NO:91 0.4μM
SEQ ID NO:118 0.4μM
SEQ ID NO:144 0.2μM
SEQ ID NO:164 0.2μM
SEQ ID NO:175 0.2μM
SEQ ID NO:176 0.2μM
SEQ ID NO:177 0.1μM
去离子水 补水至15μL
转化后DNA模板 15μL
其中，SEQ ID NO:144的3’端使用C9修饰。
表5采用SEPT9和SDC2组合引物探针组组合的PCR组分
组分 终浓度
PCR反应缓冲液 1X
DNA聚合酶 0.1U/μL
dNTPs混合液 0.4mM
Mg2+ 2mM
SEQ ID NO:3 1μM
SEQ ID NO:28 1μM
SEQ ID NO:52 0.8μM
SEQ ID NO:72 0.1μM
SEQ ID NO:91 0.4μM
SEQ ID NO:118 0.4μM
SEQ ID NO:144 0.2μM
SEQ ID NO:164 0.2μM
SEQ ID NO:175 0.2μM
SEQ ID NO:176 0.2μM
SEQ ID NO:177 0.1μM
去离子水 补水至15μL
转化后DNA模板 15μL
其中，SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:144的3’端都使用C9修饰。
表6实施例2的PCR反应条件
Figure BDA0001686335040000061
图3为单一SEPT9引物探针组和与SEPT9和SDC2组合引物探针组检测甲基化SEPT9效果示意图，图4为单一SDC2引物探针组与SEPT9和SDC2组合引物探针组检测甲基化SDC2效果示意图，如图3和4可以看出，SDC2和SEPT9的组合检测和单独检测并无明显差异。
实施例3
以结直肠癌组织和匹配的癌旁组织为检测对象，采用凯杰的DNeasy Blood&Tissue Kit提取DNA后，使用6M亚硫酸氢铵溶液，3M亚硫酸氢钠和1M无水硫酸钠配置成10M亚硫酸氢盐溶液DNA转化后，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后得到转化后DNA模板，再进行PCR反应，转化条件为90℃加热30分钟。PCR反应体系见表7，PCR反应条件见表8。
表7实施例3的PCR组分
组分 终浓度
PCR反应缓冲液 1X
DNA聚合酶 0.1U/μL
dNTPs混合液 0.4mM
Mg2+ 2mM
SEQ ID NO:1 1.5μM
SEQ ID NO:30 1.5μM
SEQ ID NO:55 1μM
SEQ ID NO:80 0.2μM
SEQ ID NO:96 0.5μM
SEQ ID NO:129 0.5μM
SEQ ID NO:156 0.2μM
SEQ ID NO:163 0.1μM
SEQ ID NO:175 0.2μM
SEQ ID NO:176 0.2μM
SEQ ID NO:177 0.1μM
去离子水 补水至15μL
转化后DNA模板 15μL
其中，SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:156的3’端分别使用磷酸基和C18修饰。
表8实施例3的PCR反应条件
Figure BDA0001686335040000071
图5为SEPT9和SDC2引物探针组合检测17例结直肠癌组织及对应癌旁组织的效果示意图，由图5可以看出SEPT9和SDC2均可很好的区分结直癌组织和癌旁组织，因此可以用于结直肠癌的早期筛查/检测/诊断。
实施例4
收集20例II期～IV期结直肠血清样本，体积约为1.5mL，标记为结直肠癌组，收集56例无明显消化道疾病的病人血清样本，体积约为1mL，标记为正常组；使用苏州唯善生物科技有限公司的血液游离DNA提取试剂盒进行DNA提取，然后使用9M亚硫酸氢铵溶液80℃加热45分钟转化后，然后使用Axygen胶纯化试剂盒纯化后得到转化后DNA模板，再进行PCR反应。实施例4的PCR反应体系见表9，反应条件见表10。SEPT9和SDC2引物探针组合检测血液游离DNA中SEPT9和SDC2甲基化效果见表11。
表9实施例4的PCR组分
组分 终浓度
PCR反应缓冲液 1X
DNA聚合酶 0.1U/μL
dNTPs混合液 0.4mM
Mg2+ 2mM
SEQ ID NO:13 1.5μM
SEQ ID NO:50 1.5μM
SEQ ID NO:61 1μM
SEQ ID NO:74 0.2μM
SEQ ID NO:97 0.4μM
SEQ ID NO:125 0.4μM
SEQ ID NO:155 0.2μM
SEQ ID NO:165 0.1μM
SEQ ID NO:175 0.2μM
SEQ ID NO:176 0.2μM
SEQ ID NO:177 0.1μM
去离子水 补水至15μL
DNA模板 15μL
其中，SEQ ID NO：61和SEQ ID NO:155的3’端分别均使用C3修饰。
表10实施例4的PCR反应条件
Figure BDA0001686335040000081
表11.SEPT9和SDC2引物探针组合检测血液游离DNA中SEPT9和SDC2甲基化效果
Figure BDA0001686335040000082
Figure BDA0001686335040000091
由表11可以看出，SEPT9和SDC2组合检测后可以明显提高结直肠癌的灵敏度，且依然具有很高的特异性。
本发明的序列1-177如下表12所示。
表12各引物和探针序列
Figure BDA0001686335040000092
Figure BDA0001686335040000101
Figure BDA0001686335040000111
Figure BDA0001686335040000121
Figure BDA0001686335040000131
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 苏州唯善生物科技有限公司
<120> 用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组
<130> xhx2018060601
<141> 2018-06-06
<160> 177
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaataatccc atccaactac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtagttggat gggattattt 20
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<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
agttggatgg gattatttyg 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
craaataatc ccatccaac 19
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gttggatggg attatttyg 19
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<211> 20
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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ttggatggga ttatttcgga t 21
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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gattygttgt ttattagtta ttat 24
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gygtaggagg aggaagygag c 21
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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ygtaggagga ggaagyga 18
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<213> Homo sapiens
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tcrcttcctc ctcctacr 18
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<211> 18
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<213> Homo sapiens
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<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 117
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<211> 19
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<211> 19
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 20
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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cgagttcgag ttttcgagtt 20
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Claims (5)

1.用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组的扩增体系，其特征在于，包括SEPT9的扩增引物、Blokcer引物和探针，以及SDC2的扩增引物、Blocker引物和探针；SEPT9的正向引物为SEQ ID NO：20，SEPT9的反向引物为SEQ ID NO:38，SEPT9的Blocker引物为SEQ ID NO：53，SEPT9的探针为SEQ ID NO:79；SDC2的正向引物为SEQ ID NO：99，SDC2的反向引物为SEQ ID NO:127，SDC2的Blocker引物为SEQ ID NO：144，SDC2的探针为SEQ ID NO:167；还含有一组内参基因引物探针组，其中所述内参基因为ACTB；所述ACTB的正向引物为SEQ ID NO：175，反向引物为SEQ ID NO:176，ACTB的探针选自SEQ ID NO:177；
检测对象为从生物样本中经过基因组DNA提取、纯化后再使用亚硫酸氢盐转化得到的DNA样本；所述的亚硫酸氢盐为亚硫酸氢铵，亚硫酸氢盐的浓度为8M；亚硫酸氢盐转化过程的反应条件为：DNA加入到8M亚硫酸氢盐溶液中，70℃加热60分钟。
2.如权利要求1所述的用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组的扩增体系，其特征在于，SEPT9、SDC2、ACTB甲基化的检测同时在一个荧光定量PCR反应中完成或单独针对一个位点进行荧光定量PCR反应。
3.如权利要求1所述的用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组的扩增体系，其特征在于，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:144的3’端分别使用磷酸基和C3修饰。
4.如权利要求1所述的用于结直肠癌诊断、检测或筛查的引物和探针组的扩增体系，其特征在于，扩增体系具体组分为：
Figure FDA0003591481040000011
5.权利要求1～4任一项所述的扩增体系在制备结直肠癌及其癌前病变的早期筛查、检测或诊断的试剂的应用。
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