CN110724743B - 人血液中结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与结直肠癌相关的甲基化生物标记物及其应用，所述与结直肠癌相关的甲基化生物标记物是cg21644830、cg11407741、cg12619536、cg04156369、cg15248577、cg16903605、cg00397851、cg01922936、cg17849956、cg15717808、cg18323466、cg15177071、cg19918758、cg26337020、cg01333350、cg07344025、cg03786924、cg04380513、和cg12665504的组合。本发明所筛选的19种生物标记物的组合与血液中与结直肠癌诊断高端相关，特别是所选择的生物标记物的组合，对于早期的结直肠癌样本的针对性很强，利用这些生物标记物以及相应的检测技术开展结直肠癌的无创早筛早诊意义重大。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及人血液中结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物及其应用。
背景技术
结直肠癌是常见的恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的10％，其在恶性肿瘤中居第3位，严重威胁着人类的健康。在我国，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率日渐增加，死亡率亦大幅增加，尤其在近十年，结直肠癌发病率的增加每年>4％，远超2％的国际水平。机制研究表明，结直肠癌主要是由基因突变和表观遗传学改变的逐渐积累和共同作用引起，这是一个发展较为缓慢的过程。在结直肠癌筛查方法中，仅有粪便隐血试验(fecal occult blood test，FOBT)和乙状结肠镜检查具有高级别的循证医学证据。FOBT是目前应用最为广泛的筛查方法，具有无创、价廉的优点，筛查敏感性30％～80％。研究显示，对参加至少一次筛查的人群而言，FOBT可以降低25％的死亡风险。乙状结肠镜主要观察远侧结肠的病变情况，达到60％～70％结肠镜的检查敏感性。乙状结肠镜筛查的理论基础在于多数结肠病变位于镜身所及的远端结肠，同时，部分伴有远端结肠病变的近侧肿瘤也可以在随后的结肠镜检查中得以诊断。乙状结肠镜的筛查效果受到肠道清洁程度、操作者经验、病变分布特点和筛检频率等因素的影响。此外，作为一种非侵入性的结直肠癌筛查方法，大便基因检测具有特异性高、敏感性强、无需行肠道准备、易于检查和接受等优点。目前的大便基因检测包括大便DNA检测(stool DNA testing,sDNA)及大便微小RNA检测(microRNA,miRNA)。
但是现有的结肠镜检查具有侵入性，对于结直肠癌患者来说大大降低了筛查的意愿。粪便基因检测目前主要依靠单一生物标记物或者少数几个生物标记物作为检测依据，存在检测准确率低，灵敏度低的缺点。
相对于血液样本而言，现有的检测技术依赖于粪便，而粪便样本普遍存在其他生物DNA污染问题，样本保存质量低，保存成本高，检测噪音高，并且样本易获得性及患者提供意愿较血液差。
液体活检(liquid biopsy，LB)作为精准医疗新技术，因其可定性定量检测肿瘤直接相关的肿瘤细胞和DNA，并具有非入侵性、取样便捷、实时监测等特点，逐步在肿瘤诊疗中发挥越来越重要的作用。
发明内容
基于此，本发明提供了用于诊断、预测人结直肠癌及其预后的差异化甲基化生物标记物。
实现上述目的技术方案如下。
人血液中与结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物，所述甲基化生物标记物是cg21644830、cg11407741、cg12619536、cg04156369、cg15248577、cg16903605、cg00397851、cg01922936、cg17849956、cg15717808、cg18323466、cg15177071、cg19918758、cg26337020、cg01333350、cg07344025、cg03786924、cg04380513、和cg12665504的组合。
在其中一些实施例中，所述甲基化生物标记物还包括以下中的至少一种：cg25602490、cg14590817、cg14652031、cg05376505、cg15385562、cg27116061、cg08592707、cg02408333、cg04342092、cg21583226、cg06952671、cg08327269、cg09942248、cg06287318、cg19019371、cg25262044、cg11092616、cg12926104、cg25184481、cg06779469、cg21621906、cg07927379、cg25832771、cg02362467、cg01419567、cg16673106、cg16057262、cg11416076、cg25213928、cg06918887、cg05937496、cg22329423、cg05155840、cg23434186、cg14101302、cg23232563、cg12080391、cg05095123、cg23198529、cg15547669、cg19239848、cg02270183、cg25918303、cg19752627、cg21995919、cg12243375、cg03410436、cg12652174、cg15386368、cg27405960、cg00868383、cg17014953、cg15356923、cg10218490、cg15847198、cg02899206、cg01966612、cg11425280、cg14202910、cg15179725、cg10273340、cg24899571、cg14834850、cg24140030、cg22090773、cg24924091、cg26226802、cg06728579、cg22388982、cg07900968、cg20354430、cg11086760、cg09670616、cg17880199、cg24867142、cg24176678、cg05094548、cg01151699、cg19219577、cg25567337、cg26522240、cg23198902、cg11428482、cg00414171、cg18603154、cg04836221、cg01216370、cg18138147、cg14163665、cg07326648、cg10212705。
在其中一些实施例，所述甲基化生物标记物是cg01922936，cg12652174，cg18323466，cg10218490，cg26337020，cg07344025，cg14652031，cg16057262，cg04380513，cg12665504，cg12619536，cg15717808，cg17849956，cg02362467，cg21644830，cg21583226，cg04156369，cg23232563，cg00397851，cg06779469，cg02408333，c g21995919，cg01333350，cg12080391，cg16903605，cg11407741，cg06952671，cg15248577，cg03786924，c g00868383，cg19752627，cg19918758，cg25832771，cg21621906，cg23434186，cg01419567的组合。
在其中一些实施例，包括以上110种的生物标记物。
在其中一些实施例，所述结直肠癌是早期结直肠癌(1-2期结直肠癌)。
本发明的另一个目的是提供所述的与人结直肠癌相关的甲基化生物标记物在制备人检测结直肠癌的试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的是提供诊断、预测人结直肠癌的检测试剂盒。
所述诊断、预测结直肠癌的检测试剂盒，包括有检测上述的甲基化生物标记物的试剂。
本发明的发明人经过大量的实验，发现了人血液中与结直肠癌诊断相关的19种生物标记物的组合。特别地，所选择的生物标记物的组合，对于早期的结直肠癌样本的针对性非常强，这些生物标记物的选择对于早期结直肠癌的预测是非常好的。进一步，在19种生物标记物的基础上，构建更全面的血液中与结直肠癌诊断相关的110种生物标记物的检测平台，利用这些位点以及相应的检测技术开展结直肠癌的无创早筛早诊意义重大。
附图说明
图1是实施例2中110个位点在结直肠癌与正常组织样本的表达热图。
图2是实施例2中cg21995919位点的ROC曲线。
图3是实施例2中cg03786924位点的ROC曲线。
图4是实施例2中cg15248577位点的ROC曲线。
图5是实施例3中19个位点试集ROC曲线。
图6是实施例4中19个位点试集ROC曲线。
图7是实施例5中19个位点试集ROC曲线。
图8是实施例6中19个位点试集ROC曲线。
图9是实施例7中9个位点试集ROC曲线。
图10是实施例8中37个位点试集ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中，CpG位点表示二核苷酸对，碱基鸟嘌呤(G)紧随胞嘧啶(C)之后，CpG是胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)的缩写。
本发明中，“标记物”是指能够用于指示受试者患有结直肠癌的情况。这些标记物可以是核酸序列、大分子、小分子等等，例如可以是一定长度的核酸序列，也可以是一个特定位点的核苷酸或者两个特定位点的核苷酸，其与受试者患有结直肠的情况。根据本发明的实施例，本发明提供的标记物指的是能够用于检测、预测或者诊断受试者是否患者结直肠的CpG位点。
本发明中，早期结直肠癌，主要是指1-2期结直肠癌。
本发明中，分析所述标记物的位点甲基化的情况，分析的方法可以包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法(nextgeneratio sequencing,NGS)、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合。本发明的一个实施例中，基于二代测序法。
实施例1
本实施例公开了上述用于预测结直肠癌ctDNA差异性甲基化标记物(marker)的检测方法，具体包括以下步骤：
1.全血处理
1.1利用EDTAK2抗凝真空采血管(BD，Cat#367525)采集10mL全血，充分混匀，避免出现溶血，并在4-6小时内对全血进行血浆分离处理。
1.2全血于低速离心机进行4℃，1600g，15min离心处理，小心吸取上层血浆，避免吸取中间的白膜层，所得血浆再次于高速离心机进行4℃，16000g，10min离心处理，获得所需样品血浆。
2.组织样本处理
临床手术切除结直肠癌肠癌组织样本后，4采用％的中性福尔马林固定，经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋切片，最终形成结直肠癌组织FFPE样本。
3.血浆cfDNA和组织DNA的提取。
血浆cfDNA提取具体操作步骤按照Thermo Fisher公司的MagMAX TM Cell-FreeDNA Isolation Kit说明书进行，组织DNA提取具体操作步骤按照Qiagen公司的AllPreDNA/RNA FFPE Kit说明书进行。
4.将提取后的组织DNA进行打断，血浆cfDNA无需进行打断，具体操作如下：
4.1取组织DNA，用EB补足体积至130ul，转移至打断管中于Covaris M220按照以下程序进行打断：
4.2将打断完的组织DNA转移至1.5ml离心管中，用Nanodrop 2000测定打断后浓度。
5.将提取的血浆cfDNA或是打断后的组织DNA进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNA Methylation-Lightning Kit说明书进行。
6.对转化后的DNA进行建库，具体的操作步骤按照AnchorDx的AnchorDxEpiVisioTM Methylation Library Prep Kit(AnchorDx,Cat#A0UX00019)以及AnchorDxEpiVisioTM Indexing PCR Kit(AnchorDx,Cat#A2DX00025)说明书进行。得到测序预文库。
7.对测序预文库进行特定区域捕获，具体的操作步骤参考AnchorDx PanMet V2–Pan-cancer methylation panel(AnchorDx,Cat#A0UX00023)的说明进行，形成测序终文库。
8.采用Illumina公司的测序仪对测序终文库进行测序，得到测序结果。
9.数据的分析：
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bamfile)，对bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
实施例2
本实施例公开了一种用于诊断结直肠癌的甲基化特异性生物标记物，利用113例肠镜无异常的正常人的组织样本以及195例结直肠癌病人的组织样本，利用实施例1所述方法进行组织样本甲基化水平分析。利用在不同组别的甲基化水平差异筛选出与结直肠癌相关的生物标记物，并对位点数据在正常与结直肠癌样本中进行聚类分析，结果请见图1。从图1可以看到，一共筛选出110个在正常与结直肠癌样本存在最显著异常甲基化的位点。图中，红色为位点高甲基化表达，蓝色为位点低甲基化表达。该110个甲基化生物标记物(以下简称位点或者marker)为：
cg25602490、cg14590817、cg15248577、cg14652031、cg05376505、cg15385562、cg27116061、cg08592707、cg02408333、cg04342092、cg21583226、cg06952671、cg08327269、cg09942248、cg06287318、cg19019371、cg25262044、cg11092616、cg12926104、cg25184481、cg06779469、cg21621906、cg07927379、cg25832771、cg02362467、cg21644830、cg07344025、cg16903605、cg26337020、cg01922936、cg01419567、cg19918758、cg16673106、cg16057262、cg12665504、cg04380513、cg11416076、cg17849956、cg00397851、cg04156369、cg25213928、cg06918887、cg11407741、cg05937496、cg15177071、cg22329423、cg05155840、cg23434186、cg18323466、cg14101302、cg23232563、cg12080391、cg05095123、cg23198529、cg15547669、cg19239848、cg02270183、cg25918303、cg19752627、cg21995919、cg12243375、cg12619536、cg03410436、cg12652174、cg15386368、cg27405960、cg15717808、cg00868383、cg17014953、cg15356923、cg03786924、cg10218490、cg15847198、cg02899206、cg01333350、cg01966612、cg11425280、cg14202910、cg15179725、cg10273340、cg24899571、cg14834850、cg24140030、cg22090773、cg24924091、cg26226802、cg06728579、cg22388982、cg07900968、cg20354430、cg11086760、cg09670616、cg17880199、cg24867142、cg24176678、cg05094548、cg01151699、cg19219577、cg25567337、cg26522240、cg23198902、cg11428482、cg00414171、cg18603154、cg04836221、cg01216370、cg18138147、cg14163665、cg07326648、cg10212705。
其中，这些甲基化生物标记物(marker)在以上的113例肠镜无异常的正常人的组织样本以及195例结直肠癌病人的组织样本中进行二分类判断，单独每个位点AUC可以高达0.981，如位点cg21995919。请见图2。其中，其他的位点的AUC也大部分在0.9以上，如cg03786924的AUC为0.96(请见图3)，cg15248577的AUC为0.974(请见图4)。说明了利用该方法筛选出来的位点都与结直肠癌高度相关。
实施例3
利用其中19个位点的信息，对113例肠镜无异常的正常人以及195例结直肠癌病人组织样本进行检测，具体的实验以及下机数据处理与实施例1一致，利用随机森林模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行20次重复，在98％的特异性下，测试集的1期的检测灵敏度为96.7％±0.036，2期的检测灵敏度为98％±0.037，3期的检测灵敏度为98.2％±0.029，4期的检测灵敏度为91.5％±0.068，对于可治疗的结直肠癌样本(1-3期)，检测的整体灵敏度为97.5％±0.022，对于所有的结直肠癌样本，检测的整体灵敏度为95.2％±0.036。整体的AUC为0.99±0.007。表明了这些位点组合与结直肠癌的高度相关。结果请见图5。
所述19个生物标记物：cg21644830、cg11407741、cg12619536、cg04156369、cg15248577、cg16903605、cg00397851、cg01922936、cg17849956、cg15717808、cg18323466、cg15177071、cg19918758、cg26337020、cg01333350、cg07344025、cg03786924、cg04380513、和cg12665504。
实施例4
利用以上19个位点(与实施例3相同)的信息，对116例肠镜无异常的正常人以及85例1-2期结直肠癌病人组织样本进行检测，具体的实验步骤与下机数据处理与实施例1一致，利用随机森林模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行20次重复，在98％的特异性下，测试集的1期的检测灵敏度为94.6％±0.051，2期的检测灵敏度为98.6％±0.031，对于预后效果较好的早期结直肠癌样本(1-2期)，检测的整体灵敏度为96.6％±0.035。整体的AUC为0.99±0.007。表明了这些位点与早期的结直肠癌的高度相关。结果请参见图6。
本实施例与实施例3的主要区别在于，基于不同时期的肿瘤样本数据进行建模分析，模型学习的数据关系是不同的，从而对于测试集的样本预测模型也不尽相同。本实施例更加针对的是1-2期样本的数据特征，应该说对于早期的结直肠癌样本的针对性更强，但是也通过分析看到，通过两种不同的数据集学习得到的测试集预测，在早期的样本中，一样的特异性下，灵敏度相差无几，也证明了这些位点的选择以及对于早期结直肠癌的预测都是非常好的。
实施例5
利用以上的19个位点在血浆样本中进行测试，对222例肠镜无异常的正常人以及438例结直肠癌病人血浆样本进行检测，利用随机森林模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行20次重复，在90％的特异性下，各分期的检测灵敏性为(I:68.7％±0.09,II:85.5％±0.042,III:88.9％±0.057,IV:95.5％±0.032,可治愈的I-III:81.1％±0.05,I-IV:84.1％±0.042)，在95％的特异性下，各分期的检测灵敏性为(I:58.2％±0.115,II:81％±0.053,III:82.8％±0.067,IV:94.8％±0.032,可治愈的I-III:74.3％±0.065,I-IV:78.7％±0.053)整体的AUC为0.94±0.013。表明了这些位点的组合对于结直肠癌血浆样本的检测灵敏度也是相当不错的，非常有利于利用这些位点的组合进行无创、灵敏地检测出结直肠癌。结果请参见图7。
实施例6
利用以上19个位点在血浆样本中进行测试，对222例肠镜无异常的正常人以及191例早期(1-2期)结直肠癌病人血浆样本进行检测，利用随机森林模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行20次重复，在90％的特异性下，对于所有的早期结直肠癌样本，各分期的检测灵敏性为(I:65.2％±0.103,II:84.6％±0.065,可治愈的I-II:76.1％±0.070)，整体的AUC为0.92±0.02。表明了这些位点的一个子集对于结直肠癌早期血浆样本的检测灵敏度也是相当不错的，非常有利于利用这些位点的组合进行无创、灵敏地检测出早期结直肠癌。结果请参见图8。
实施例7
在以上19个位点中，随机选取9个位点(cg01922936，cg11407741，cg04156369，cg00397851，cg01333350，cg12619536，cg15717808，cg15248577，和cg16903605)，组合一个组合。在血浆样本中进行测试，对222例肠镜无异常的正常人以及438例结直肠癌病人血浆样本进行检测，利用随机森林模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行20次重复，在90％的特异性下，各分期的检测灵敏性为(I:54.7％±0.078,II:82.5％±0.05,III:83.1％±0.064,IV:95.1％±0.035,可治愈的I-III:74％±0.046,I-IV:78.4％±0.037)，在95％的特异性下，各分期的检测灵敏性为(I:48.5％±0.08,II:78.5％±0.049,III:79.5％±0.073,IV:93.9％±0.034,可治愈的I-III:69.4％±0.043,I-IV:74.6％±0.034)整体的AUC为0.91±0.012。相比实施例5的19个位点组合，该实施例的9个位点的组合在结直肠癌中的各分期中的检测灵敏性都有所下降。请参见图9。
实施例8
利用以上其中的19个位点，再从剩余的91个位点中随机选取18个位点，组合一个37位点的组合。在血浆样本中进行测试，对222例肠镜无异常的正常人以及438例结直肠癌病人血浆样本进行检测，利用随机森林模型进行建模分析，按照6：4的切分，进行20次重复，在90％的特异性下，各分期的检测灵敏性为(I:63.7％±0.124,II:86.1％±0.061,III:87.1％±0.058，IV:96％±0.025,可治愈的I-III:79.3％±0.061,I-IV:82.8％±0.049)，在95％的特异性下，各分期的检测灵敏性为(I:55.4％±0.102,II:82.1％±0.062，III:83％±0.058,IV:95.2％±0.03，可治愈的I-III:73.9％±0.056，I-IV:78.4％±0.047)整体的AUC为0.94±0.01。相比实施例5的19个位点组合，37个位点的组合在更高地特异性下，某些分期的检测灵敏性有一定的提高。请参见图10。
37个位点的信息：cg01922936，cg12652174，cg18323466，cg10218490，cg26337020，cg07344025，cg14652031，cg16057262，cg04380513，cg12665504，cg12619536，cg15717808，cg17849956，cg02362467，cg21644830，cg21583226，cg04156369，cg23232563，cg00397851，cg06779469，cg02408333，c g21995919，cg01333350，cg12080391，cg16903605，cg11407741，cg06952671，cg15248577，cg03786924，c g00868383，cg19752627，cg19918758，cg25832771，cg21621906，cg23434186，cg01419567。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.人血液中与结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物，其特征是，所述甲基
化生物标记物是cg21644830、cg11407741、cg12619536、cg04156369、cg15248577、cg16903605、cg00397851、cg01922936、cg17849956、cg15717808、cg18323466、cg15177071、cg19918758、cg26337020、cg01333350、cg07344025、cg03786924、cg04380513、和cg12665504的组合；所述结直肠癌是早期结直肠癌，所述早期结直肠癌是1-2期结直肠癌。
2.人血液中与结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物，其特征是，所述甲基化生物标记物是cg01922936，cg12652174，cg18323466， cg10218490， cg26337020，cg07344025 ，cg14652031，cg16057262，cg04380513，cg12665504，cg12619536，cg15717808，cg17849956，cg02362467，cg21644830，cg21583226，cg04156369，cg23232563，cg00397851，cg06779469，cg02408333，c g21995919，cg01333350，cg12080391，cg16903605，cg11407741，cg06952671， cg15248577， cg03786924， cg00868383，cg19752627，cg19918758，cg25832771，cg21621906，cg23434186，cg01419567的组合；所述结直肠癌是早期结直肠癌，所述早期结直肠癌是1-2期结直肠癌。
3.检测权利要求1-2任一项所述的甲基化生物标记物的试剂在制备检测人早期结直肠癌的试剂盒中的应用。
4.一种诊断、预测人早期结直肠癌的检测试剂盒，其特征是，包括检测权利要求1-2任一项所述的甲基化生物标记物甲基化的试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征是，所述试剂是根据采用焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合所使用的试剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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