CN111500705B - IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用 - Google Patents

IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用。该gAN肠道菌群标志物，包括链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)中的至少一种。发明人通过收集IgAN患者与正常人群的粪便样本，由粪便样本中的微生物出发，筛选出其中与IgAN相关性较高的肠道微生物，利用这一类或几类肠道微生物作为生物标志物，可以有效确定受试者是否有IgAN的患病风险，或对IgAN患者的治疗方案的效果做出一定的判断。

Description

IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及肾病技术领域，尤其是涉及一种IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用。
背景技术
IgA肾病(Immunoglobulin A nephropathy，IgAN)是原发性肾小球肾炎中最常见的一种慢性肾功能损伤的疾病。IgAN是我国慢性肾衰竭的最主要病因。然而，IgAN的发病机制尚不明确，与病菌感染、黏膜免疫、细胞免疫及炎症介质等诸多因素有关。同时，越来越多的研究证据也表明，遗传因素在IgAN的发生中起着不可忽视的作用。
由于难以辨明IgAN的发病机制，对IgAN的诊断仍然缺乏方便、快捷、有效的方法。临床上常采用多种方法多种指标结合的方式来对IgAN进行诊断，例如测定病人血清IgA的水平、对尿液进行检查确定尿蛋白血尿的情况、测定肾小球滤过率(GFR)以及肾活检(RenalBiopsy)等。其中，对IgAN的进行诊断的金标准是肾活检。然而，肾活检操作较为复杂，检测过程具有创伤性和疼痛性，并且极有可能在一定程度上引起其他并发症。因此，需要一种方便快捷的方法用来指导临床IgAN的诊断和治疗。
肠道菌群是人体肠道内的多种微生物的总称，群落中的微生物总数达100万亿个，约为人类本身的细胞总数的10～20倍，因此被称为人类的“第二基因组”，对机体的健康至关重要。一方面，它们可以通过影响宿主的代谢及基因表达来影响宿主的生理活动，并直接参与人体的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、抗病等诸多方面。另一方面，肠道菌群的失衡也被认为和诸多人体炎症性疾病存在着密切的关联，能引起宿主低水平、全身性的慢性炎症。越来越多的研究表明，人类的多种疾病与肠道菌群的功能密不可分，如炎症性肠病(IBD)、肝病、二型糖尿病、肿瘤等。现有临床实践显示，炎症性肠病患者中，IgAN是最常被诊断的疾病。这可能暗示肠道菌群在IgAN的发生发展中也扮演着重要角色。因此，有必要针对肠道菌群开发出特异的IgAN生物标志物，为疾病的快速灵敏诊断提供新的科学思路。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种IgAN肠道菌群标志物，包括链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)中的至少一种。
本发明实施例的肠道菌群标志物至少具有如下有益效果：
发明人通过收集IgAN患者与正常人群的粪便样本，由粪便样本中的微生物出发，筛选出其中与IgAN相关性较高的肠道微生物，利用这一类或几类肠道微生物作为生物标志物，可以有效确定受试者是否有IgAN的患病风险，或对IgAN患者的治疗方案的效果做出一定的判断。
第二方面，本发明的一个实施例提供了一种IgAN代谢物标志物，包括胆红素(bilirubin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、硬脂酰胺(stearamide)、苯丙氨酸(phenylalanine)、顺-9,10-环氧硬脂酸(cis-9,10-epoxystearic acid)、溶血磷脂酰乙醇胺17:0(PE lyso 17:0)中的至少一种。
本发明实施例的代谢物标志物至少具有如下有益效果：
发明人通过收集IgAN患者与正常人群的血液样本，发现特定的几种代谢产物在患者与正常人群中存在明显的差异，这些具有明显含量差异的代谢物可以作为IgAN的生物标志物用以诊断或预后评估。
第三方面，本发明的一个实施例提供了一种上述的IgAN肠道菌群标志物或IgAN代谢物标志物在制备IgAN诊断和/或预后试剂中的应用。通过检测受试者的粪便样本获得肠道菌群的相关信息，将其中的肠道菌群标志物的含量与预设阈值进行比较，进而判断受试者是否与IgAN的患病风险，或对患者的治疗方案的疗效做出合理有效的判断；或者通过检测受试者的血清、尿液、粪便等样本中的代谢物的相关信息，将其中的代谢物标志物的含量与预设阈值进行比较，进而判断受试者是否与IgAN的患病风险，或对患者的治疗方案的疗效做出合理有效的判断。
第四方面，本发明的一个实施例提供了一种上述的IgAN肠道菌群标志物或IgAN代谢物标志物在筛选预防和/或治疗IgAN的药物中的应用。通过检测受试者在完成周期性的药物使用后，粪便样本中的肠道菌群标志物的含量是否下降到阈值以下来判断药物是否通过筛选；或者通过检测受试者在完成周期性的药物使用后，血清、尿液、粪便等样本中的代谢物标志物的含量是否下降到阈值以下来判断药物是否通过筛选。
其中，含量、阈值既可以是单一或多个标志物的含量或丰度，也可以是对多个标志物的含量或丰度进行建模分析处理得到的相对值。
第五方面，本发明的一个实施例提供了一种试剂盒，该包括用于检测标志物的含量的试剂，这些标志物为上述的IgAN肠道菌群标志物和/或IgAN代谢物标志物。在IgAN患者与正常健康对照组人群的粪便样本中的链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)的微生物的量存在显著差异、粪便样本与血清样本中的胆红素(bilirubin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、硬脂酰胺(stearamide)、苯丙氨酸(phenylalanine)、顺-9,10-环氧硬脂酸(cis-9,10-epoxystearic acid)、溶血磷脂酰乙醇胺17:0(PE lyso 17:0)存在显著差异，通过检测试剂对上述一种或几种标志物进行检测，可以对受试者是否患有IgAN、IgAN患者用药的有效性以及检测患者的预后状况做出准确有效的判断。
第六方面，本发明的一个实施例提供了一种评估IgAN风险的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得受试者样本中IgAN肠道菌群标志物和/或IgAN代谢物标志物的含量；
(2)将含量与预设阈值进行比较，根据比较结果判断IgAN风险；
该方法不适用于疾病的诊断和/或治疗。
其中，IgAN风险是指受试者是否患有IgAN，根据与阈值的比较还可以进一步包括患病的风险；或者指IgAN患者的预后情况；或者指待筛选药物对IgAN模型的效用。
根据本发明的一些实施例的方法，对于肠道菌群标志物的含量的获得，可以通过对样本进行16S测序；对于代谢物标志物的含量的获得，可以通过对样本进行色谱分析、质谱检测等方式。
根据本发明的一些实施例的方法，满足以下至少一种条件，可以判断受试者患有IgAN，或者IgAN患者的预后较差，或者药物不符合筛选条件：
(1)链球菌属(Streptococcus)的含量比阈值高；
(2)肠球菌属(Enterococcus)的含量比阈值低；
(3)拟杆菌属(Bacteroides)的含量比阈值高；
(4)胆红素(bilirubin)的含量比阈值高；
(5)甲氧苄啶(trimethoprim)的含量比阈值低；
(6)硬脂酰胺(stearamide)的含量比阈值低；
(7)苯丙氨酸(phenylalanine)的含量比阈值高；
(8)溶血磷脂酰乙醇胺17:0(PE lyso 17:0)的含量比阈值低。
第七方面，本发明的一个实施例提供了一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，用于执行上述的方法。通过执行上述方法，可以准确有效地确定受试者是否患有IgAN，或IgAN患者的预后情况。
第八方面，本发明的一个实施例提供了一种评估受试者的IgAN风险的系统，该系统包括：
检测装置，用于确定受试者样本中IgAN肠道菌群标志物和/或IgAN代谢物标志物的含量；
比对装置，用于将含量与预设阈值进行比较，根据比较结果判断IgAN风险。
根据本发明的一些实施例的系统，其中的检测装置包括：
核酸分离装置，用于从受试者的样本中分离核酸样本；
测序装置，用于检测核酸样本中IgAN肠道菌群标志物的含量。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的IgAN患者与健康对照组的粪便代谢物的聚类分析结果。
图2是本发明的一个实施例的IgAN患者与健康对照组的血清代谢物的聚类分析结果。
图3是本发明的一个实施例的IgAN患者与健康对照组的粪便代谢物的代谢通路分析结果。
图4是本发明的一个实施例的IgAN患者与健康对照组的血清代谢物的代谢通路分析结果。
图5是本发明的一个实施例的胆红素的ROC曲线。
图6是本发明的一个实施例的甲氧苄啶的ROC曲线。
图7是本发明的一个实施例的硬脂酰胺的ROC曲线。
图8是本发明的一个实施例的苯丙氨酸的ROC曲线。
图9是本发明的一个实施例的顺-9,10-环氧硬脂酸的ROC曲线。
图10是本发明的一个实施例的溶血磷脂酰乙醇胺17:0的ROC曲线。
图11是本发明的又一实施例的用于评估受试者的IgAN风险的系统的组成示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
肠道菌群标志物筛选
本项目已通过医学伦理委员会审查，所有志愿者均已获得知情同意，签署同意书。
1.样本的收集
实验分为两组，肾活检确诊的IgAN患者30例，正常健康对照组30例。
所有入选的IgAN患者与正常健康对照组的志愿者性别年龄等基本条件相匹配，且均没有如系统性红斑狼疮、慢性肝脏疾病、恶性肿瘤、糖尿病、慢性肠胃疾病、神经系统疾病以及其他自身免疫性疾病。所有入选的志愿者至少三个月内未接受过糖皮质激素及免疫抑制剂的治疗，一个月内未接受过任何抗生素治疗，一个月内未食用过酸奶等益生菌食品。
早餐前采集两组人员的粪便样本，按照德国Sarstedt的粪便收集系统要求进行采样，使用无菌的抹刀将粪便混合均匀，取1g存储于无菌的冷冻管中，并存储到-80℃。
2.16S测序
2.1DNA的提取
取粪便样品1g，置于冰上，按照E.Z.N.A.stool DNA Kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)的使用说明进行粪便DNA的提取。
2.2建库及测序
无菌水稀释提取到的DNA样品至1ng/μL，以稀释后的基因组DNA为模板，采用16SrDNA V3-V4区域特异性的引物进行PCR扩增。
扩增引物如下：
341F：CCTACGGGNGGCWGCAG(SEQ ID No.1)；
806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT(SEQ ID No.2)。
扩增程序为：95℃，2min；98℃，10s，62℃，30s，68℃，30s，27个循环；68℃，10min。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，回收目的条带。使用用
Figure BDA0002475386960000051
DNA PCR-FreeSample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，应用高通量测序平台Illumina HiSeq2500对样品进行测序分析。每个样本产生出不低于1万条tags或者100M数据。
3.数据分析
3.1 OTU注释和丰度分析
对原始数据(Raw reads)进行过滤，得到有效数据(Effective Tags)。然后进行物种注释并聚类成OTU(Operational Taxonomic Units)，然后通过OTU注释(基于包含的Reads的物种注释结果)完成物种分类。
3.2多样性分析
通过多种指数来评估样本的Alpha多样性。根据样本的OTU丰度信息计算Braycurtis、Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离来评估不同样品间的微生物群落结构差异。基于以上的距离矩阵，通过多变量统计学方法分析，进一步从结果中挖掘各样品间微生物群落结构的差异和不同分类对样品间的贡献差异，即Beta多样性(BetaDiversity)。
3.3特定OTU的差异性鉴定
获取各样本OTU在不同分类水平上的组成和绝对丰度分布表，通过Metastats统计学算法，对指定分类水平的各个分类单元在IgAN患者组和正常健康对照组的序列量差异进行比较检验；
获取各样本OTU在不同分类水平上的组成和相对分布表，通过LEfSe分析，结合Metastats结过，获得对应的肠道菌群标志物。结果如下表1所示，其中，HC和IgAN分别表示正常健康对照组和IgAN患者组。
表1.两组实验对象肠道微生物在不同分类水平下的Metastats和LEfSe分析结果
Figure BDA0002475386960000061
从表中可以看到，在属这一分类水平上，链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)这三个属的微生物的P值均小于0.05，同时LDA的绝对值均大于2，表明这三个属的肠道微生物在IgAN患者与正常健康对照组的人群内有显著差异。因此，这三个属的肠道微生物可以作为鉴别受试者是否患有IgAN这一疾病，或对IgAN患者的预后水平做出评估，或对IgAN药物实现一定的筛选功能。
实施例2
代谢物标志物筛选
本项目已通过医学伦理委员会审查，所有志愿者均已获得知情同意，签署同意书。
1.样本的获得
1.1样本收集
实验分为两组，肾活检确诊的IgAN患者30例，正常健康对照组30例。
所有入选的IgAN患者与正常健康对照组的志愿者性别年龄等基本条件相匹配，且均没有如系统性红斑狼疮、慢性肝脏疾病、恶性肿瘤、糖尿病、慢性肠胃疾病、神经系统疾病以及其他自身免疫性疾病。所有入选的志愿者至少三个月内未接受过糖皮质激素及免疫抑制剂的治疗，一个月内未接受过任何抗生素治疗，一个月内未食用过酸奶等益生菌食品。
早餐前通过真空EDTA采血管采集参与者的静脉血，并将这些血液样本在4℃，2200g条件下离心5min后，获取血浆样本，并储存在-80℃条件下备用。另外，同时采集两组人员的粪便样本，按照德国Sarstedt的粪便收集系统要求进行采样，使用无菌的抹刀将粪便混合均匀，取1g存储于无菌的冷冻管中，并存储到-80℃。
1.2血浆样本的前处理
移取100μL样本至EP管中，加入300μL甲醇，再加入10μL内标，涡旋混30秒，冰水浴超声10min；零下20℃静置1h；将样本于4℃，13000rpm离心15min；小心地取出200μL上清于高效液相色谱质谱专用的聚丙烯试管(自带内插管的进样瓶)中，每个样本各取20μL混合成质量控制(Quantility Control，QC)样本，再取200μL准备上机检测。
1.3质谱分析
使用ThermoFisherScientificUPLC-QE-MS质谱仪，采用ESI离子源，调节色谱质谱仪器参数，选择合适的样品进样量，获取血浆的非靶向代谢组学数据。
1.4数据处理
对下机质谱数据进行前处理。使用ProteoWizard软件将质谱原始数据转成mzML格式，再使用XCMS做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作。得到包含每一个峰的质荷比、保留时间和强度信息的强度信息表。
利用代谢物质谱数据库(HMDB，http://www.hmdb.ca；METLIN，http://metlin.scripps.edu/index.php；Massbank，http://www.massbank.jp/等)进行代谢物的二级质谱碎片的匹配，从而对代谢物进行鉴定。
建立由IgAN患者和正常健康对照组组成的年龄、性别相匹配的粪便样品和血清样品各自的训练集和测试集。采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)的方法观察IgAN患者代谢物的聚类情况，在训练集中采用PLS-DA模型筛选出IgAN患者和正常健康对照组之间的差异性代谢物，通过MetaboAnalyst3.0进行聚类分析，并完成差异性代谢物的通路分析，在测试集中对训练集中鉴定的差异性代谢物用ROC曲线进行验证。
结果如图1～图10所示。其中，图1和图2分别是IgAN患者/健康对照组的粪便代谢物和血清代谢物的聚类分析结果。MetaboAnalyst3.0聚类分析的结果以热图形式呈现，从图中可以看到，在粪便样本和血清样本中存在六种共同的显著性差异代谢物(胆红素、甲氧苄啶、硬脂酰胺、苯丙氨酸、顺-9,10-环氧硬脂酸、溶血磷脂酰乙醇胺17:0)，其中，IgAN患者的胆红素、苯丙氨酸水平在两类样本中均差异性上调，甲氧苄啶、硬脂酰胺、溶血磷脂酰乙醇胺17:0在两类样本中均差异性下调。
图3和图4是本发明的一个实施例的IgAN患者/健康对照组的粪便代谢物和血清代谢物的代谢通路分析结果。如图3和图4所示，横坐标影响(Impact)表示代谢通路的重要性，即差异性代谢物命中代谢通路的节点，Impact越大表示命中的节点数越多，纵坐标-lnP值表示代谢通路富集分析的显著性水平，-lnP值越大，显著性越高。从图中可以看出，IgAN患者的粪便样本主要涉及花生四烯酸代谢、氨酰基-tRNA的生物合成、苯丙氨酸代谢、赖氨酸的生物合成、赖氨酸降解，IgAN患者的血清样本主要涉及丙酮酸代谢、苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢。
图5～图10是本发明的一个实施例的胆红素、甲氧苄啶、硬脂酰胺、苯丙氨酸、顺-9,10-环氧硬脂酸、溶血磷脂酰乙醇胺17:0的ROC曲线。从图中可以看出，6种代谢物的AUC值分别为0.75、0.79、0.79、0.66、0.84、0.65，该结果表明这6种代谢物的诊断价值中度或高度可信，具有较高的应用价值。
实施例3
图11是本发明的又一实施例的用于评估受试者的IgAN风险的系统的组成示意图。参考图11，本实施例提供一种评估受试者的IgAN风险的系统，该系统包括：核酸分离装置100，用于从受试者的粪便样本中分离核酸样本；测序装置110，用于检测核酸样本中IgAN肠道菌群标志物：链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)和拟杆菌属(Bacteroides)的含量；比对装置120，用于将标志物的含量与预设阈值进行比较，根据其中三种标志物的检测含量与阈值的相对大小判断IgAN风险。
实施例4
本实施例提供一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，用于执行以下方法：
(1)获得受试者样本中IgAN肠道菌群标志物和/或IgAN代谢物标志物的含量；
(2)将含量与预设阈值进行比较，根据比较结果判断受试者是否患有IgAN、IgAN患者的预后情况，或者筛选药物。
其中，步骤2的判断方法为：
满足以下至少一种条件，可以判断受试者患有IgAN，或者IgAN患者的预后较差，或者药物不符合筛选条件：
(1)链球菌属(Streptococcus)的含量比阈值高；
(2)肠球菌属(Enterococcus)的含量比阈值低；
(3)拟杆菌属(Bacteroides)的含量比阈值高；
(4)胆红素(bilirubin)的含量比阈值高；
(5)甲氧苄啶(trimethoprim)的含量比阈值低；
(6)硬脂酰胺(stearamide)的含量比阈值低；
(7)苯丙氨酸(phenylalanine)的含量比阈值高；
(8)溶血磷脂酰乙醇胺17:0(PE lyso 17:0)的含量比阈值低。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> IgAN肠道菌群标志物、IgAN代谢物标志物及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctacgggng gcwgcag 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactachvg ggtatctaat 20

Claims (3)

1.检测IgAN代谢物标志物的水平的试剂在制备IgAN预后试剂中的应用，所述IgAN代谢物标志物包括甲氧苄啶、硬脂酰胺和顺-9,10-环氧硬脂酸。
2.一种计算机可读存储介质，其特征在于，存储有计算机可执行指令，所述计算机可执行指令用于执行以下方法：
（1）获得受试者样本中IgAN代谢物标志物的含量，所述IgAN代谢物标志物包括甲氧苄啶、硬脂酰胺和顺-9,10-环氧硬脂酸；
（2）将所述含量与预设阈值进行比较，根据比较结果判断IgAN预后风险。
3.一种评估受试者的IgAN预后风险的系统，其特征在于，包括：
检测装置，用于确定受试者样本中IgAN代谢物标志物的含量，所述IgAN代谢物标志物包括甲氧苄啶、硬脂酰胺和顺-9,10-环氧硬脂酸；
比对装置，用于将所述含量与预设阈值进行比较，根据比较结果判断IgAN预后风险。
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