CN112410449A - 一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用 - Google Patents

一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用，其中所述微生物标志物包括：微生物标志物1）口炎消化链球菌（Peptostreptococcus stomatis）；微生物标志物2）不解糖卟啉单胞菌（Porphyromonas asaccharolytica）；微生物标志物3）麻疹孪生球菌（Gemella morbillorum）。上述三中细菌的相对丰度在结直肠癌患者中丰度显著升高。本发明还提供了根据所述的生物标志物作为检测目标在制备检测试剂或试剂盒中的应用和在预测结直肠癌风险中的应用。本发明的微生物标志物具有作为结直肠癌标志物的潜能，精准率高，特异性好，具有非侵入性辅助诊断结直肠癌的作用。

Description

一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体为一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用。
背景技术
结直肠癌（Colorectal cancer）是我国发病率仅次于肺癌和胃癌的第三大高发癌症，根据2018年《中国结直肠肿瘤早诊筛查策略专家共识》的统计数据显示，结直肠癌每年新发病例42.92万人，死亡病例28.1万人，防控形势严峻。结直肠癌的发病与年龄、环境等因素相关。约90%左右的患者发病年龄在40岁以上，但近年来发生结直肠癌的年轻患者比例逐渐升高，有年轻化趋势。结直肠癌的发生与经济发展在统计学上呈正相关，表明人类经济文明环境下的某些原因可能导致了结直肠癌的发生，包括饮食、运动等因素。有统计显示，约6%的结直肠癌发生与长期食用红肉相关，可能的解释是红肉中的金属离子会促进细胞增殖；约5%的结直肠癌的发生与长期饮酒相关，可能的解释是乙醇代谢物会直接结合DNA，造成不可逆转的突变。
美国联合癌症委员会（AJCC）根据结直肠癌肿瘤的发生阶段将结直肠癌分为5个时段：0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。0/Ⅰ期结直肠癌的5年存活率高达90%以上，而Ⅳ期的5年成活率仅为5%-7%，因此早期筛查可以大幅降低结直肠癌死亡率。结直肠腺瘤的癌变通常耗时十年左右，所以即使结直肠癌的发病率和死亡率较高，患者也有足够的时间通过筛查和腺瘤摘除手术等阻断结直肠腺瘤的癌变过程，因此结直肠癌的早期筛查对于后续的治疗和预后都有重要意义。
随着结直肠癌早筛技术不断发展，目前主要有三种筛查技术：结肠镜检查、FOBT/FIT检测技术、基于血液或粪便DNA的筛查技术。1985年，世界上出现首个肠癌筛查技术：刚性乙状结肠镜，经过数十年的发展，结肠镜技术不断进步，虽然这项技术作为肠癌检查的金标准，是一种较为准确的筛查手段，但是该技术的侵入性和肠道准备可能对受检者造成一定程度痛苦，令许多结直肠癌风险人群难以忍受或拒绝筛查。第一种非侵入性筛查技术粪便潜血试验（FOBT）于1967年提出，20世纪80年代粪便免疫化学试验（FIT）技术问世，这两项技术虽然具有无创、快速、非侵入性等优点，但敏感性较低，假阳性较高。20世纪90年代，基于DNA的肠癌筛查技术出现，同时兼具非侵入性和高敏感性的优点，但是该检测技术价格高昂，性价比低。
近年来越来越多的证据表明人体肠道微生物在结直肠癌的发展过程中占据重要地位。结直肠癌患者和健康人群肠道中的微生物群落分布特征存在极大差异，结直肠癌患者肠道中的厚壁菌和梭杆菌被过度表达，而变形菌含量较少，此外，癌症组织与癌旁组织相比，乳球菌和梭杆菌表现更高的丰度，而假单胞菌和埃希志贺菌则丰度减小，与此同时，在近端和远端结直肠癌组织中，微生物群落的整体分布相似，但是某些潜在的致病基因病原体却有所不同。另有研究指出腔体相关的微生物群主要通过代谢或与宿主间的代谢交换从而导致结直肠癌的发生，而黏膜相关的微生物群则通过与宿主的直接作用影响结直肠癌的发病风险。
随着精准健康领域的发展，临床上需要一种能够兼具准确性、非侵入性且高性价比的结直肠癌早筛方法。同时肠道中的微生物菌群含有巨大的作为分子标志物的潜能，可作为无创结直肠癌检测分子标志物。因此，提出一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用。
发明内容
针对上述背景技术中的不足，本发明提供一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用，本发明的微生物标志物预测结直肠癌风险精度高，灵敏性好，操作难度低，性价比高，可用作辅助诊断结直肠癌，指导肠道微生物环境的调整。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种与结直肠癌相关的微生物标志物，所述微生物标志物包括以下3种：
微生物标志物1）Peptostreptococcus_stomatis；
微生物标志物2）Porphyromonas_asaccharolytica；
微生物标志物3）Gemella_morbillorum。
其中，微生物标志物1）Peptostreptococcus_stomatis检测试剂的探针引物组合为：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQID NO.3所示。
其中，微生物标志物2）Porphyromonas_asaccharolytica检测试剂的探针引物组合为：正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。
其中，述微生物标志物3）Gemella_morbillorum检测试剂的探针引物组合为：正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示。
上述所述微生物标志物在结直肠癌患者组中丰度均升高，且显著，在大样本量的相关性分析结果中，三个微生物标志物对结直肠癌的重要性系数分别为17.35、14.50和10.95。
本发明的结直肠癌微生物标志物灵明度高，特异性好，三个标志物的配合即可有助于辅助诊断或预测结直肠癌的患病风险，可用于肠癌的早期筛查，具有良好的应用前景和现实意义。
所述微生物标志物的丰度是基于对其基因序列片段的计算所提供的。
第二方面，本发明提供一种检测如第一方面所述的与结直肠癌相关的微生物标志物的试剂。
所述试剂可以是针对如第一方面所述与结直肠癌相关的微生物标志物的引物探针组合或其他试剂，用来测定所述微生物标志物的丰度。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的与结直肠癌相关的微生物标志物或如第二方面所述试剂的用途，所述用途包括用于制备结直肠癌诊断试剂，或制备结直肠癌诊断试剂盒。
第四方面，本发明提供一种结直肠癌风险评估模型，包括以下步骤：
步骤1）从357例健康样本和354例结直肠癌样本中提取DNA片段；
步骤2）使用TaqMan探针法进行定量qPCR，检测所有样本中的如第一方面所述微生物标志物目的基因片段含量和内部参照16S rDNA的基因含量；
步骤3）根据步骤2）所述的微生物标志物目的基因片段的含量和内部参照16S rDNA的基因含量，计算得到对应微生物标志物的丰度；
步骤4）使用步骤3）得到的所有样本的微生物标志物的丰度和分组信息及随机森林算法，训练结直肠癌风险评估模型，并进行内部数据验证。
第五方面，本发明提供一种个体结直肠癌风险预测的方法，包括以下步骤：
步骤1）从所述个体粪便样本中提取DNA片段；
步骤2）使用TaqMan探针法进行定量qPCR，检测样本中的微生物标志物目的基因片段含量和内部参照16S rDNA的基因含量；
步骤3）根据步骤2）所述的微生物标志物目的基因片段的含量和内部参照16S rDNA的基因含量，计算得到对应微生物标志物的丰度；
步骤4）将步骤3）得到的微生物标志物的丰度分别与健康个体和结直肠癌患者粪便样本的微生物标志物丰度进行对比，确定个体是否患有结直肠癌。
本发明中，利用如第五方面所述的个体结直肠癌预测的方法为早期诊断结直肠癌提供了一种非侵入性的辅助检测方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1. 本发明提供一种与结直肠癌相关的微生物标志物，具有作为结直肠癌诊断标志物的潜能，可用于结直肠癌的辅助诊断和风险预测，特异性好，灵敏度高，性价比高，揭示肠道微生物菌群状况，指导微生物环境的调整，降低结直肠癌发生的可能性；
2. 本发明提供一种与结直肠癌相关的微生物标志物和微生物标志物的检测试剂，可用于制备结直肠癌诊断试剂或试剂盒，具有良好的应用前景和现实意义；
3. 本发明提供一种结直肠癌风险评估模型，参数典型、计算量大、精准率高，可用于评估结直肠癌风险；
4. 本发明提供一种个体结直肠癌风险预测的方法，使用粪便样本便于运输且取样无创，可增加患者依从性。同时，使用粪便样本具有准确性和安全性。
附图说明
图1为结直肠癌风险评估模型预测的结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不受具体的实施方式所限制，以权利要求书为准，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例都属于本发明保护的范围。
本发明所用数据具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
“生物标志物”，指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生化指标，可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药新疗法在目标人群中的安全性和有效性。在本发明中，“生物标志物”指肠道微生物标志物，也可用“肠道微生物”、“肠道菌群”表示，因为本发明中使用的与结直肠癌相关的微生物标志物均来自经受试者肠道代谢后的粪便样本。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1，DNA样本的提取。
（1）采集个体的粪便样本，立刻进行冷冻处理，实验前置于冰上；
（2）称取200mg固定粪便于2mL离心管中，加入800μL粪便DNA提取缓冲液，充分震荡混匀5min，1800g离心1min；
（3）从中取出50μL悬液于1.5mL离心管中，加入800μL裂解液旋涡震荡混匀，70℃裂解5min，离心5min后转移上清至干净的1.5mL离心管中；
（4）加入20μL混匀的磁珠，旋涡震荡20s，室温静置4min，置于磁架上，静置20s，吸取上清；
（5）加入500μL洗涤液Ⅰ，旋涡震荡20s，混匀磁珠，置于磁架上，静置20s，弃上清；
（6）加入750μL洗涤液Ⅱ，旋涡震荡20s，混匀磁珠，置于磁架上，静置20s，弃上清；
（7）重复（6）一次，尽量除去所有液体；
（8）置于磁力架上开盖干燥7-8min尽量除去所有液体；
（9）加入50μL缓冲液或双蒸水，旋涡震荡15s，混匀磁珠，65℃下加热7min（期间旋涡震荡10s），旋涡震荡15s，置于磁架上，静置2min，吸上清于收集管中，得到所述DNA。
实施例2，微生物标志物的定量检测
微生物标志物的定量检测采用Taqman qPCR方法，其中使用的探针和引物如SEQ IDNO.01~09所示。
下面以苏州新海生物科技股份有限公司TaqMan Master Mix试剂盒产品为例，描述本实施例的具体步骤。
（1）按照表1所示的qPCR反应体系进行反应配制PCR反应液。
表1. qPCR反应体系
试剂 用量 浓度
Taqman Master Mix (2×) 12.5μL 1×
PCR正向引物（10μM） 1μL 400nM
PCR反向引物（10μM） 1μL 400nM
探针（0.2uM） 1μL 400nM
待测样本DNA 1μL 1-100ng
灭菌水 8.5μL /
（2）PCR反应液配置完成后，上下颠倒混匀并离心，分装至96孔PCR反应板中，2000g离心2min，封口后置于PCR仪中进行反应。
（3）使用两步PCR反应法进行qPCR反应，设定程序为表2所示。
表2. 两步PCR反应法程序
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（4）根据仪器输出的Ct值，以16S rDNA作为内参，对样本中的微生物标志物的目的片段含量进行相对定量计算，结果即为所述微生物标志物的丰度。
实施例3，结直肠癌风险评估模型。
结直肠癌风险评估模型使用随机森林算法，使用357例健康样本和354例结直肠癌患者样本的三个微生物标志物丰度进行模型的训练和测试，最终建立结直肠癌风险评估模型，具体步骤如下：
步骤1）使用如实施例1中所述方法从357例健康样本和354例结直肠癌样本中提取DNA片段；
步骤2）使用如实施2中所述检测所有样本中的三个微生物标志物目的基因片段含量和内部参照16S rDNA的基因含量；
步骤3）根据步骤2）所述的微生物标志物目的基因片段的含量和内部参照16S rDNA的基因含量，计算得到对应微生物标志物的丰度；
步骤4）使用步骤3）得到的所有样本的微生物标志物的丰度和分组信息及随机森林算法，训练结直肠癌风险评估模型，并进行内部数据验证。
其中，模型的验证使用十次十倍交叉验证，避免一次验证造成的误差。
模型的预测效果请参阅图1，第i行第j列的方块内的数字表示第i行分组对应的样本有多少个被预测为第j列表示的分组。CTR表示健康样本，CRC表示结直肠癌患者样本。其中，精准率（Precision=正确阳性分组数量/(正确阳性分组数量+错误阳性分组数量)）达到0.83，特异性（True negative rate=正确阴性分组数量/(正确阴性分组数量+错误阳性分组数量)）达到0.89，可用于评估结直肠癌风险。
实施例4，结直肠癌风险确定。
利用平行试验确定所述的三种与结直肠癌相关的微生物标志物的相对含量后，分别与表3中的数值进行对比，并判断个体患病风险。其中表3中不同人群的菌群微生物标志物丰度为利用上述方法对357例健康样本和354例结直肠癌患者样本进行所述的三个与结直肠癌相关的微生物标志物的丰度测定后得到的数值，并据此评估待测样本的个体患结直肠癌的风险。
其中评估方法具体为使用实施例3中的结直肠癌风险评估模型来评估待测样本的个体患结直肠癌的风险，具体步骤如下：
步骤1）利用如实施例1和实施例2中所述方法提取粪便DNA并确定所述的三种与结直肠癌相关的微生物标志物的相对丰度；
步骤2）将所述的三种与结直肠癌相关的微生物标志物的相对丰度输入结直肠癌风险评估模型；
步骤3）模型计算的结果即为个体结直肠癌风险。
评估结果将以百分比的形式展示，如：“健康0.862；癌症0.138”。判断结果以0.5为分界，比例高于0.5的结果将作为结直肠癌风险评估模型的结果。在“健康”和“癌症”的打分接近时，建议将所测样本的三种微生物标志物的相对丰度与表3中的丰度进行对比，必要时建议医院就诊确认。
表3. 结直肠癌微生物标志物的丰度和富集人群
微生物名称 健康人群 结直肠癌患者 富集人群
Peptostreptococcus stomatis 0 0.0516 结直肠癌患者
Porphyromonas asaccharolytica 0 0.7436 结直肠癌患者
Gemella morbillorum 0 0.2389 结直肠癌患者
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津奇云诺德生物医学有限公司
<120> 一种与结直肠癌相关的微生物标志物及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgttataa tctcaggctt gatg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtattctg gtagctccat tacg 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actaagcagt tcgcaggaga tccagcac 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gactaccgct atacgagaca atatgatc 28
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcgagtct accgccgtgt a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaatccggc caacccagcc t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtttcggga cttgtgctta tt 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctccacgat cttcaaagca ctt 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccagcttg tgcatcatgg gatca 25

Claims (6)

1.一种与结直肠癌相关的微生物标志物，其特征在于，所述微生物标志物包括以下3种：
微生物标志物1）Peptostreptococcus_stomatis；
微生物标志物2）Porphyromonas_asaccharolytica；
微生物标志物3）Gemella_morbillorum；
优选地，所述微生物标志物1）Peptostreptococcus_stomatis检测试剂的探针引物组合为：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述微生物标志物2）Porphyromonas_asaccharolytica检测试剂的探针引物组合为：正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述微生物标志物3）Gemella_morbillorum检测试剂的探针引物组合为：正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的微生物标志物，其特征在于，所述微生物标志物的丰度是基于对其基因序列片段的计算所提供的。
3.一种检测与结直肠癌相关的微生物标志物的试剂，其特征在于，所述试剂可以是针对如权利要求1所述与结直肠癌相关的微生物标志物的引物探针组合或其他试剂，用来测定所述微生物标志物的丰度。
4.一种如权利要求1所述与结直肠癌相关的微生物标志物或如权利要求2所述与结直肠癌相关微生物标志物的试剂的用途，其特征在于，所述用途包括用于制备结直肠癌诊断试剂，或制备结直肠癌诊断试剂盒。
5.一种结直肠癌风险评估模型，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）从357例健康样本和354例结直肠癌样本中提取DNA片段；
步骤2）使用TaqMan探针法进行定量qPCR，检测所有样本中的如权利要求1所述微生物标志物目的基因片段含量和内部参照16S rDNA的基因含量；
步骤3）根据步骤2）所述的微生物标志物目的基因片段的含量和内部参照16S rDNA的基因含量，计算得到对应微生物标志物的丰度；
步骤4）使用步骤3）得到的所有样本的微生物标志物的丰度和分组信息及随机森林算法，训练结直肠癌风险评估模型，并进行内部数据验证。
6.一种个体结直肠癌风险预测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）从所述个体粪便样本中提取DNA片段；
步骤2）使用TaqMan探针法进行定量qPCR，检测样本中的如权利要求1所述微生物标志物目的基因片段含量和内部参照16S rDNA的基因含量；
步骤3）根据步骤2）所述的微生物标志物目的基因片段的含量和内部参照16S rDNA的基因含量，计算得到对应微生物标志物的丰度；
步骤4）将步骤3）得到的微生物标志物的丰度输入如权利要求6所述的结直肠癌风险评估模型中，进行结直肠癌风险的评估。
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