CN114085886B - 儿童克罗恩标志微生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了儿童克罗恩标志微生物及其应用，该儿童克罗恩标志微生物包括第一微生物集，因此，进一步提出了一种试剂盒，包括适于检测第一微生物集中的至少一种菌种的试剂，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。本发明提出的微生物在健康人群和儿童克罗恩患者中的丰度具有显著差异，可以作为有效检测和/或治疗儿童克罗恩的标志物。

Description

儿童克罗恩标志微生物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及儿童克罗恩标志微生物及其用途，更具体的，本发明涉及一种试剂盒、试剂在制备试剂盒中的用途、用于预防或者治疗儿童克罗恩的药物组合物、确定个体是否患有儿童克罗恩方法、确定个体是否患有儿童克罗恩的装置、一种装置、一种筛选药物的方法。
背景技术
儿童克罗恩(Crohn’s disease,CD)又称阶段性肠炎或者阶段性大肠炎，是一种原因不明的肠道炎症性疾病。临床表现为腹痛、腹泻、肠梗阻，伴有发热、营养障碍等肠外表现，最多见的是出现肛周的一些病变，如瘘管、肛周脓肿，但它病变部位不止局限在结肠的病变，它在食管、胃，十二指肠、小肠都可以发生病变，是全胃肠道的病变。
克罗恩病发病可出现在任何年龄组，男女患病率近似，且病程多迁延，反复发作，不易根治。目前尚无根治的方法，并且许多病人会出现并发症，最常见的是肠梗阻，其次是腹腔内脓肿，偶可并发急性穿孔或大量便血，直肠或结肠受累者可发生癌变，需手术治疗，但术后复发率也很高。本病的复发率与病变范围、病症侵袭的强弱、病程的延长、年龄的增长等因素有关，死亡率也随之增高。
克罗恩病进展比较缓慢，起病大多隐匿、缓慢，从发病早期症状出现(如腹部隐痛或间歇性腹泻)到确诊一般需要数月至数年，病程呈慢性，长短不等的活动期与缓解期交替。少数急性起病，可表现为急腹症，酷似急性阑尾炎，因此可能会发生误判。此种慢性疾病的诊断，需要结合临床表现，X线检查、结肠镜检查或者活组织检查结果进行综合分析，但诊断过程较复杂，对于鉴别比较困难而又有手术指征者还需要手术探查才可获得病理诊断。
随着人体基因组测序完成及高通量测序技术的高速发展，基因筛查成为克罗恩病诊断的又一方向，通过此种方法有可能发现克罗恩病的潜在人群，越来越多的证据支持生态失调假说，即共生和致病性肠道微生物与宿主免疫系统相互作用的平衡发生了变化，导致了克罗恩病的发生。目前的研究结果表明微生物有助于了解克罗恩病的病因，许多克罗恩病的风险基因位点与调节宿主免疫系统的模式识别受体(PRRs)的细胞因子有关。由于全球年发病率的增加，特别是儿童发病率急剧升高，因此越来越需要了解克罗恩病的病因，结肠样本较结肠样本而言，能够更加准确的反映肠道内的真实情况。通过研究结肠样本的微生物，有助于克罗恩病的早期诊断，也有利于揭示克罗恩病微生物标志。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本申请的申请人通过前期大量研究，本发明意外地发现一种微生物组合可以作为检测儿童克罗恩的微生物物种标志物，合理有效地应用微生物物种标志物，扶持肠道有益菌的生长，抑制肠道潜在致病菌，可以治疗或减轻儿童克罗恩的临床症状。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，包括适于检测第一微生物集中的至少一种菌种的试剂，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。根据本发明具体实施例的试剂盒，可以准确的区分儿童克罗恩患者和健康个体。
在本发明的第二方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂适于检测第一微生物集中的至少一种菌种。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断儿童克罗恩或检测儿童克罗恩的治疗效果，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。根据本发明具体实施例的试剂制备的试剂盒，可以准确的检测所述第一微生物集中的至少一种菌种，极准确的区分儿童克罗恩患者和健康个体，由此，可以有效的在早期进行儿童克罗恩诊断，或用于检测治疗过程中儿童克罗恩的变化。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于预防或者治疗儿童克罗恩的药物组合物。根据本发明的实施例，含有第一微生物集中的至少一种菌种，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。根据本发明实施例的儿童克罗恩标志微生物中第一微生物集的菌种可以非侵入性的在早期发现或辅助检测儿童克罗恩，确定个体患有儿童克罗恩的概率高低或者个体处于健康状态的概率高低；同时，提高儿童克罗恩高风险人群或儿童克罗恩患者肠道内的所述第一微生物集中的各种菌种，可以降低患儿童克罗恩的概率或减缓、治愈儿童克罗恩，因此，所述包含所述第一微生物集中的至少一种菌种的药物组合物能够用于平衡肠道菌群，有效预防或治疗儿童克罗恩。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种确定个体是否患有儿童克罗恩的方法。根据本发明的实施例，包括：(1)确定所述个体的粪便样本中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和第二微生物集中的至少一种菌种；(2)将步骤(1)中得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有儿童克罗恩；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌
(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60；所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。根据本发明实施例的方法可以依据个体的粪便样本中的所述标志微生物的丰度确定个体是否患有儿童克罗恩，所述标志微生物是发明人对大量已知状态的粪便样本进行验证，通过差异比较分析各种肠道微生物在儿童克罗恩组和健康组粪便样本中的丰度，而确定下来的。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种确定个体是否患有儿童克罗恩的装置。根据本发明的实施例，包括：丰度确定单元，用于确定所述个体的粪便样本中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和第二微生物集中的至少一种菌种；比较单元，用于将所得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有儿童克罗恩；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60；所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。所述标志微生物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在儿童克罗恩患者和健康人群的粪便样本中的丰度并经过分析和大量已知状态的粪便样本的验证而确定下来的，根据本发明实施例的装置可以准确确定个体是否为儿童克罗恩的高风险人群或儿童克罗恩患者。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种装置。根据本发明的实施例，包括：计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于执行第四方面所述的方法；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。根据本发明实施例的装置可以准确确定个体是否为儿童克罗恩的高风险人群或儿童克罗恩患者。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防儿童克罗恩，所述方法包括：将候选药物施用于受试者，检测施用前后，所述受试者粪便中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和第二微生物集中的至少一种菌种，其中，满足下列条件至少之一的候选药物适于用于治疗或者预防儿童克罗恩：(1)进行所述施用后，所述第一微生物集中的至少一种菌种的所述丰度升高；和(2)进行所述施用后，所述第二微生物集中的至少一种菌种的所述丰度降低；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60；所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。根据本发明实施例的方法可以生产或筛选出促进所述标志微生物中第一微生物集中各种菌种生长，和/或抑制肠道标志微生物中第二微生物集中的各种菌种生长的药物，对于辅助减轻儿童克罗恩的临床症状具有重要意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的筛选儿童克罗恩标志微生物的实验分析流程示意图；以及
图2是根据本发明实施例的标志微生物综合指标AUC评价结果示意图，Specificity表示特异度，即预测为阳性且实际为阳性，真阳性，纵坐标Sensitivity表示敏感度，即真阴性，其中：
2-A为第一期26个样品数据ROC曲线下AUC值和置信区间结果图；
2-B为第二期14个样品数据ROC曲线下AUC值和置信区间结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
术语“任选地”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。由此，限定有“任选地”的特征可以明示或者隐含地包括或不包括该特征。
生物学标志物是从生物学介质中可以检测到的细胞/生物化学或分子改变。生物学介质包括各种体液、组织、细胞、结肠、头发、呼气等。
微生物的丰度是指在某一微生物群体中该种微生物的丰富程度，例如在肠道微生物群体中的该种微生物程度，可表示为该种微生物在该群体中的含量。
根据本发明的一个实施方式提供的一种试剂盒，包括适于检测第一微生物集中的至少一种菌种的试剂，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。
根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒进一步包括适于检测第二微生物集中的至少一种菌种的试剂，所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。
根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒包括适于检测所述第一微生物集中全部所述菌种的试剂。
根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒包括适于检测所述第二微生物集中全部所述菌种的试剂。
根据本发明的具体实施方案，所述标志微生物是发明人通过对大量患儿童克罗恩个体和大量健康对照个体的粪便样本中的微生物的丰度的差异比较分析、以及验证，而确定下来的，明确了肠道微生物中儿童克罗恩相关的标志微生物。利用包含检测所述标志微生物的试剂的试剂盒能够确定个体处于患有儿童克罗恩状态的概率高低或者处于健康状态的概率高低，能够用于非侵入性的早期发现或辅助检测儿童克罗恩。
根据本发明的具体实施方案，所述适于检测所述第一微生物集或第二微生物集的试剂不受特别限制，任何可以检测所述微生物菌种的试剂均包含在本发明的范围内，如通过形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性、分子生物学等方面检测所述微生物菌种的试剂，具体的，如抗体、酶、核酸分子等。
本文中，所述微生物形态学特征指：在显微镜下观察微生物外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
本文中，所述微生物生理生化反应特征指：微生物利用物质的能力、代谢产物的特殊性，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等、生长环境(温度、湿度、氧气及二氧化碳等气体的浓度、PH、是否耐高渗、是否有嗜盐性等)、与其它生物间的关系(如：共生、寄生、宿主范围及致病情况)等。
本文中，所述微生物血清学反应指：利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型，如用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的所述微生物是否发生特异性的血清学反应来鉴定微生物。
本文中，分子生物学方法检测微生物主要包括：利用PCR技术、高通量测序等方法。
根据本发明提供的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂适于检测第一微生物集中的至少一种菌种，所述试剂盒用于诊断儿童克罗恩或者检测儿童克罗恩的治疗效果，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。
根据本发明的具体实施方案，所述标志微生物是发明人通过对大量患儿童克罗恩个体和大量健康对照个体的粪便样本中的微生物的丰度的差异比较分析、以及验证，而确定下来的，明确了肠道微生物中儿童克罗恩相关的微生物标志物。利用检测所述标志微生物的试剂能够确定个体患有儿童克罗恩的概率高低或者处于健康状态的概率高低，能够用于非侵入性的早期发现或辅助检测儿童克罗恩。
根据本发明一些具体的实施方案，所述试剂进一步适于检测第二微生物集中的至少一种菌种，所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。
根据本发明的具体实施方案，所述适于检测所述第一微生物集或第二微生物集的试剂不受特别限制，可以检测所述微生物菌种的试剂均包含在本发明的范围内，如通过形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性、分子生物学等方面检测所述微生物菌种的试剂等，具体的，如抗体、酶、核酸分子。
本文中，所述微生物形态学特征指：在显微镜下观察微生物外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
本文中，所述微生物生理生化反应特征指：微生物利用物质的能力、代谢产物的特殊性，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等、生长环境(适宜生长的温度、湿度、氧气及二氧化碳等气体的浓度、PH、是否耐高渗、是否有嗜盐性等)、与其它生物间的关系(如：共生、寄生、宿主范围及致病情况)等。
本文中，所述微生物血清学反应指：利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型，如用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的所述微生物是否发生特异性的血清学反应来鉴定微生物。
本文中，分子生物学方法检测微生物主要包括：利用PCR技术、高通量测序等方法。
根据本发明提供的一种用于预防或者治疗儿童克罗恩的药物组合物，含有第一微生物集中的至少一种菌种，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60。
上述标志微生物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在儿童克罗恩疾病组和健康组的粪便样本中的丰度，以及经过大量已知状态的粪便样本的验证，而确定下来的。所述标志微生物中的菌种相较于儿童克罗恩患者群体，在健康群体组中显著富集，所述显著富集是指与在儿童克罗恩患者组中的丰度相比，上述菌种在健康组中的丰度均具有统计意义地高于或者明显地、实质性地高于在儿童克罗恩患者组中的丰度；能够使该部分菌种丰度提高的物质能够用于治疗儿童克罗恩或者益于儿童克罗恩患者服用，能够使其丰度提高的物质不限于治疗儿童克罗恩的药物。该实施方式提供的标志微生物能够用于制备治疗儿童克罗恩的药物等，所述药物可有效治疗或缓解儿童克罗恩。
根据本发明提供的一种确定个体是否患有儿童克罗恩的方法，包括步骤(1)和(2)。
(1)确定所述个体的粪便样本中的标志微生物的丰度。
所述标志微生物包括第一微生物集和第二微生物集中的至少一种菌种。其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60；所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。
根据本发明的一些具体的实施方案，步骤(1)进一步包括：获得所述个体的粪便样本中的核酸测序数据；将所述测序数据与参考基因组进行比对；基于所述比对的结果，确定所述标志微生物的丰度。
根据本发明的具体实施例，在步骤(1)中，按照下列公式确定所述标志微生物的丰度：
Ab(S)＝Ab(US)+Ab(MS)，其中，S表示所述标志微生物的编号，Ab(S)表示所述标志微生物S的丰度，Ab(US)＝US/lS，US为所述测序数据中与所述标志微生物S的参考基因组唯一比对的读段数目，lS为所述标志微生物S的参考基因组的总长度，MS为所述测序数据中与所述标志微生物S的参考基因组非唯一比对的读段的数目，i表示所述非唯一比对读段的编号，Coi为所述第i读段对应的丰度系数，/>Coi,s表示针对所述标志微生物S，所述非唯一比对的读段i的丰度系数，N为所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的总数，j表示所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的编号。
比对可以利用已知比对软件进行，例如SOAP、BWA和TeraMap等，在比对过程中，一般对比对参数进行设置，设置一个或者一对读段(reads)最多允许有s个碱基错配(mismatch)，例如设置s≤2，若reads中有超过s个碱基发生错配，则视为该reads无法比对到(比对上)该组装片段上。所述的获得的比对结果包含各条读段与各物种的参考基因组的比对情况，包括读段是否能够比对上某个或某些物种的参考基因组、只唯一比对到一种物种还是比对到多种物种的参考基因组、比对到物种的参考基因组的位置、比对到物种参考基因组的唯一位置还是多个位置等信息。
所述菌种/微生物的参考基因组指预先确定的该微生物物种的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择NCBI数据库中的各种微生物的参考基因组和/或HMP、MetaHIT项目公开的DACC肠道参考基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，各种微生物的参考基因组从公开的数据库中获得，通常的，一种微生物的参考基因组有多个版本，即一种微生物有多个公开的参考基因组。
reads与物种的参考基因组比对，比对上的可以被分为两部分：a)Unique reads(U)：唯一比对上一个物种的参考基因组；称这些reads为unique reads。即，如果reads比对上的参考基因组均来自同一物种，定义这些reads为unique reads；b)Multiple reads(M)：比对上一个以上物种的参考基因组，定义为multiple reads。即，如果reads比对上的参考基因组来自至少两种物种，定义这些reads为multiple reads。
(2)丰度比较，以确定个体是否患有儿童克罗恩。
根据本发明的一个实施例，将步骤(1)中得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有儿童克罗恩。
根据本发明的一些具体实施例，所述阈值为预先设定的。将标志微生物在待测个体样本中的丰度与所述的阈值比较，进行待测个体的状态的确定。所述阈值可以为一数值或者数值范围，阈值设定方式不受特别限制，能够对所述个体的是否患炎症性肠病进行判断的阈值均可使用，例如，基于已知患病或健康状态个体中的标志微生物的丰度均值，该微生物对应的阈值可以设为该丰度均值的95％的置信区间。
所述的置信区间是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，一个概率样本的置信区间(Confidence interval)是对这个样本的某个总体参数的区间估计。置信区间展现的是这个参数的真实值有一定概率落在测量结果的周围的程度。置信区间给出的是被测量参数的测量值的可信程度，即前面所要求的“一定概率”，这个概率被称为置信水平。
根据本发明的一些具体实施例，当步骤(1)中确定的标志微生物的丰度达到所述患儿童克罗恩丰度阈值，未达到所述不患儿童克罗恩丰度阈值时，确定所述个体患有儿童克罗恩，当(1)中确定的标志微生物的丰度达到不患儿童克罗恩丰度阈值，未达到患儿童克罗恩丰度阈值时，确定所述个体不患儿童克罗恩。
需要说明的是，根据目的或要求不同，可能对确定个体状态结果的可信程度、目的有不同的要求，本领域技术人员可以选择不同的显著性水平或阈值。
该方法基于检测个体的粪便样本中的标志微生物中的各种菌种的丰度，分别将检测确定的各种菌种的丰度与其阈值进行比较，依据获得的比较结果能够确定个体为儿童克罗恩个体或者为健康个体的概率。为早期发现儿童克罗恩提供一种非侵入性的辅助检测或者辅助干预治疗的方法。
以上任一实施例中的利用标志微生物确定个体是否患有儿童克罗恩的方法的全部或部分步骤，可以利用包含可拆分的相应单元功能模块的装置/系统来施行，或者将方法程序化、存储于机器可读介质，利用机器运行该可读介质来实现。
根据本发明提供的一种确定个体是否患有儿童克罗恩的装置，该装置包括：丰度确定单元，用于确定所述个体的粪便样本中标志微生物的丰度；比较单元，用于将所得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有儿童克罗恩；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60；所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。上述对本发明任一实施例的利用标志微生物确定个体是否患有儿童克罗恩的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的装置，在此不再赘述。
根据本发明的实施方案，所述丰度确定单元适于通过下列步骤确定所述丰度：获得所述个体的粪便样本中的核酸测序数据；将所述测序数据与参考基因组进行比对；基于所述比对的结果，确定所述标志微生物的丰度。
比对可以利用已知比对软件进行，例如SOAP、BWA和TeraMap等，在比对过程中，一般对比对参数进行设置，设置一个或者一对读段(reads)最多允许有s个碱基错配(mismatch)，例如设置s≤2，若reads中有超过s个碱基发生错配，则视为该reads无法比对到(比对上)该组装片段上。所述的获得的比对结果包含各条读段与各物种的参考基因组的比对情况，包括读段是否能够比对上某个或某些物种的参考基因组、只唯一比对到一种物种还是比对到多种物种的参考基因组、比对到物种的参考基因组的位置、比对到物种参考基因组的唯一位置还是多个位置等信息。根据本发明的一个实施例，利用SOAPalign 2.21进行比对，设置参数为-r 2-m 100-x 1000。
所述微生物的参考基因组指预先确定的该微生物物种的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择NCBI数据库中的各种微生物的参考基因组和/或HMP、MetaHIT项目公开的DACC肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，各种微生物的参考基因组从公开的数据库中获得，通常的，一种微生物的参考基因组有多个版本，即一种微生物有多个公开的参考基因组。
reads与物种的参考基因组比对，比对上的可以被分为两部分：a)Unique reads(U)：唯一比对上一个物种的基因组；称这些reads为unique reads。即，如果reads比对上的参考基因组均来自同一物种，定义这些reads为unique reads。b)Multiple reads(M)：比对上一个以上物种的参考基因组，定义为multiple reads。即，如果reads比对上的参考基因组来自至少两种物种，定义这些reads为multiple reads。
根据本发明的一个实施例，按照下列公式确定所述标志微生物的丰度：
Ab(S)＝Ab(US)+Ab(MS)，其中其中，S表示所述标志微生物的编号，Ab(S)表示所述标志微生物S的丰度，Ab(US)＝US/lS，US为所述测序数据中与所述标志微生物S的参考基因组唯一比对的读段数目，lS为所述标志微生物S的参考基因组的总长度，MS为所述测序数据中与所述标志微生物S的参考基因组非唯一比对的读段的数目，i表示所述非唯一比对读段的编号，Coi为所述第i读段对应的丰度系数，/>Coi,s表示针对所述标志微生物S，所述非唯一比对的读段i的丰度系数，N为所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的总数，j表示所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的编号。上述对本发明任一实施例的利用标志微生物确定个体是否患有儿童克罗恩的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的装置，在此不再赘述。
根据本发明的又一个实施方式提供的一种装置，包括：计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于执行前面所述的一种确定个体是否患有儿童克罗恩方法；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。
根据本发明的又一个实施方式提供的一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防儿童克罗恩，所述方法包括：将候选药物施用于受试者，检测施用前后，所述受试者粪便中标志微生物的丰度，所述标志微生物包括第一微生物集和第二微生物集中的至少一种菌种，其中，满足下列条件至少之一的候选药物适于用于治疗或者预防儿童克罗恩：(1)进行所述施用后，所述第一微生物集中的至少一种菌种的所述丰度升高；和(2)进行所述施用后，所述第二微生物集中的至少一种菌种的所述丰度降低；其中，所述第一微生物集由以下菌种组成：腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis)、腐烂别样杆菌
(Alistipes_putredinis)CAG_67、另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium)H1和瘤胃球菌(Ruminococcus_sp)CAG_60；所述第二微生物集由以下菌种组成：伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)和变形菌(Ferrovum_sp)Z_31。
利用本发明这一方面的生产或筛选治疗儿童克罗恩的药物的方法，通过合理有效地应用确定的儿童克罗恩生物标志物进行筛选，能够获得能扶持肠道有益菌的生长和/或抑制肠道潜在致病菌的药物，对于辅助减轻儿童克罗恩的临床症状具有重要意义。
下面将对实施例作具体介绍。以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列、软件及仪器，都是常规市售产品。
实施例1生物标志物的鉴定
本实施例中，发明人通过对13个儿童克罗恩患者和13个健康儿童对照的结肠样品进行研究，从而获得肠道菌群微生物微生物群落及功能成分特征。总的来说，发明人通过实验测序得到约24.2Gb高质量健康人数据以及15.3Gb高质量克罗恩患者测序数据构建了克罗恩病参照基因集，并和IGC基因集构建一个更加完整的基因集。宏基因组分析显示，43个微生物物种与克罗恩病密切相关，其中36个菌在健康人的肠道微生物中富集，7个菌在克罗恩病患者的肠道微生物中富集。
1、测序数据的获取：
所有样本测序数据从文献(PMID:29335008)中下载，采集样本前3个月未使用抗生素或固醇类物质，患者年龄在17岁以下，平均年龄为12.7岁。
参照图1所示的实验流程，鉴定儿童克罗恩的相关生物标志物，其中省略的步骤或者细节为本领域技术人员所熟知，几个重要步骤介绍如下面所述。
2、微生物物种丰度分析
2.1序列优化统计
1)首先进行第一期测序，本期测序采集26个样品的数据，获得第一期的26个样品的测序数据以后，对其进行过滤，质控按以下标准进行：a)移除大于5个N碱基的reads；b)去除低质量碱基(Q20)大于50％的reads；c)移除尾部低质量(Q20)和N碱基。
2)采用1)所述方法同样处理下载的第二期14个样品数据。
3)从//ftp.cngb.org/pub/SciRAID/Microbiome/humanGut_9.9M/GeneCatalog/IGC.fa.gz下载得到IGC基因集。
2.2物种丰度分析
SOAPalign 2.21用于匹配针对冗余基因组的paired-end clean reads，这里，所称的冗余基因组来自各数据库中公开的的细菌的参考基因组，比对参数为-r 2-m 200-x1000。Reads与冗余基因组的比对结果，可分为两部分：a)Unique reads(U)：reads只比对上一个物种的基因组；这些reads被定义为unique reads。即，如果这些基因组来自同一物种，发明人将这些reads定义为unique reads。b)Multiple reads(M)：如果reads比对上两个及两个以上物种的基因组，定义为multiple reads。即，如果比对上的基因组来自不同物种，发明人定义这些reads为multiple reads。
对于物种S，其丰度为Ab(S)，与特有的U reads和共享的M reads相关，丰度的计算方式如下：
Ab(S)＝Ab(US)+Ab(MS)，
其中，S表示所述标志微生物的编号，
Ab(S)表示所述标志微生物S的丰度，
Ab(US)＝US/lS，
US为所述测序数据中与所述标志微生物S的参考基因组唯一比对的读段数目，
lS为所述标志微生物S的参考基因组的总长度，
MS为所述测序数据中与所述标志微生物S的参考基因组非唯一比对的读段的数目，
Coi为所述第i读段对应的丰度系数，
i表示所述非唯一比对读段的编号，
Coi,s表示针对所述标志微生物S，
所述非唯一比对的读段i的丰度系数，
N为所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的总数，
j表示所述非唯一比对的读段i能够比对的微生物的编号。
每个样品中计算得到的物种丰度值，全部除以每个样品的丰度总数后，得到归一化后的物种丰度表。
2.3筛选微生物物种标记物
为了获得与儿童克罗恩疾病密切相关的肠道微生物物种标记物，发明人利用一期数据26个样本包括儿童克罗恩患者(CD)组(13例)与正常人(HC)组(13例)两组肠道微生物物种丰度数据，在物种级别做了一个与疾病相关性的研究。基于步骤2.2所得到的物种丰度表，发明人设置标准如下：(1)儿童克罗恩患者组或健康人组物种丰度的中位数必须大于0.00000001；(2)通过结合Benjamini Hochberg的多重检验的Wilcoxon秩和检验进行检验，得到每个物种和儿童克罗恩疾病的的相关性p值；(3)使用一个严格的阈值p_values<0.05，利用上述参数进行筛选。发明人得到43个与儿童克罗恩疾病密切相关的肠道微生物物种，其中，在儿童克罗恩患者肠道内中富集的微生物有7个物种，在健康人中富集的有36个物种，这43个微生物物种标记物如表1所示。
表1：
实施例2微生物物种标记物的验证
为了验证实施例1中的发现，发明人进一步分析验证群体中的二期数据14个样本包括7个健康人及7个儿童克罗恩患者的结肠样本中的所述43种菌属的丰度，并根据各物种在健康组及疾病组的富集情况对所述43个微生物物种标记物做出删选，验证群体的DNA提取、测序以及物种丰度的分析参照实施例1进行。
验证结果如下：上述富集在健康人群中的36个物种，5个在验证集中得到高质量的验证(p_values<0.04)，健康人富集的微生物物种标志物验证的均值和P值结果如表2所示，其中，Alistipes_putredinis是与健康相关的厌氧菌，为耐胆汁细菌，在健康人群中居多。
表2：
物种(Taxonomy) P值(p_values) 富集人群(enrich)
腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis) 2.62E-02 HC
腐烂别样杆菌(Alistipes_putredinis_CAG_67) 1.39E-02 HC
另支菌(Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus) 3.38E-02 HC
紫单胞菌科(Porphyromonadaceae_bacterium_H1) 7.04E-03 HC
瘤胃球菌(Ruminococcus_sp_CAG_60) 3.65E-02 HC
对于上述富集在儿童克罗恩患者中的7个物种中，其中4个在验证集中得到高质量的验证(p值<0.04)，验证富集在儿童克罗恩患者中的4个微生物标志物验证的p值和q值情况在验证集数据中的情况如表3所示。
伯克霍尔德菌，是革兰氏阳性菌，与另一种重要的机会病原体(Burkholderiacontaminans)共同组成了洋葱伯克氏菌群的K组，可以在土壤、水、受感染的植物、动物和人类中发现，与机会性感染相关，为疑似病原体。紫色色杆菌为革兰氏阴性菌，可导致败血症、菌血症、脑膜炎、肺炎、伤口感染、肝脓肿、腹膜炎、尿路感染、坏死性筋膜炎等疾病。
表3：
物种(Taxonomy) P值(p_values) 富集人群(enrich)
伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata) 2.62E-02 CD
伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp_LK4) 6.99E-03 CD
紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum) 6.99E-03 CD
变形菌(Ferrovum_sp_Z_31) 2.62E-02 CD
发明人认为，可以将从健康人富集的5个微生物物种标记物，作为儿童克罗恩疾病患病的反向指标，或作为治疗儿童克罗恩进行研发的微生物制剂药物菌群成分，或作为检测儿童克罗恩、监测儿童克罗恩治疗进程的恢复指标；将儿童克罗恩患者富集的4个微生物物种标记物，作为儿童克罗恩疾病患病的正向指标，特别用于儿童克罗恩疾病非创伤式的检测和诊断。
发明人利用这9个微生物物种标记物，构建一个综合指标，估计ROC(Receiver-operating characteristic)曲线下面积AUC，AUC越大，表示诊断能力越高，评价综合得分对应其对儿童克罗恩的诊断能力。通过对一期(第一阶段)的26个样品和二期(第二阶段)的14个样品进行评测，具体情况如图2所示，都表现出了很好的诊断能力，在一期得到AUC＝87％，如图2a所示，置信区间为73.5％-100％；二期得到AUC＝93.9％，如图2b所示，置信区间为82.1％-100％。
实施例3个体状态的检测
本实施例中，发明人利用10个结肠样本进行样本来源的个体状态的检测。
参照实施例2的方法确定各结肠样本中表3所示的伯克霍尔德菌(Burkholderia_lata)、伯克霍尔德菌(Burkholderia_sp)LK4、紫色色杆菌(Chromobacterium_violaceum)、变形菌(Ferrovum_sp)Z_31的丰度，判断各样本中的这4种菌株丰度是否落入各自在疾病对照组或者健康对照组的丰度的95％的置信区间，判定这4种菌种的丰度均落入疾病组的对应区间的样本所对应的个体的状态为儿童克罗恩患者，判定4种菌种的丰度均落入健康组的对应区间的样本所对应的个体的状态为非儿童克罗恩患者。
结果显示，利用本实施例所述方法能够对其中的10个样本进行个体状态判断，而且对这10个样本中的7个样本对应个体的状态的判断，与记录的该样本来源个体的状态一致。
另外，发明人发现对表2和表3中的物种联合检测，例如检测表3中的物种标志物被富集，同时表2中物种标记物不被富集，能够更准确的判断发现儿童克罗恩患者或易感人群。
在利用标志物治疗儿童克罗恩的方案中，发明人发现使3中的物种标志物生长得到抑制或者清除，同时使表2中物种标记物被富集，治疗效果极佳。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂适于检测第一微生物集和第二微生物集中的菌种和菌株，所述试剂盒用于诊断儿童克罗恩或者检测儿童克罗恩的治疗效果，所述第一微生物集由以下菌种和菌株组成：腐烂别样杆菌Alistipes_putredinis、腐烂别样杆菌Alistipes_putredinis CAG_67、另支菌Candidatus_Alistipes_marseilloanorexicus、紫单胞菌科Porphyromonadaceae_bacterium H1和瘤胃球菌Ruminococcus_sp CAG_60；
所述第二微生物集由以下菌种和菌株组成：伯克霍尔德菌Burkholderia_lata、伯克霍尔德菌Burkholderia_sp LK4、紫色色杆菌Chromobacterium_violaceum和变形菌Ferrovum_sp Z_31。
2.一种装置，其特征在于，包括：
计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于执行一种确定个体是否患有儿童克罗恩的方法，包括：
（1）确定所述个体的粪便样本中标志微生物的丰度，所述标志微生物为第一微生物集和第二微生物集中的菌种和菌株；
（2）将步骤（1）中得到的所述丰度与预定的阈值进行比较，以便确定所述个体是否患有儿童克罗恩；
其中，所述第一微生物集由以下菌种和菌株组成：腐烂别样杆菌Alistipes_ putredinis、腐烂别样杆菌Alistipes_putredinis CAG_67、另支菌Candidatus_ Alistipes_marseilloanorexicus、紫单胞菌科Porphyromonadaceae_bacterium H1和瘤胃球菌Ruminococcus_sp CAG_60；
所述第二微生物集由以下菌种和菌株组成：伯克霍尔德菌Burkholderia_lata、伯克霍尔德菌Burkholderia_sp LK4、紫色色杆菌Chromobacterium_violaceum和变形菌Ferrovum_sp Z_31；
以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，步骤（1）包括：
获得所述个体的粪便样本中的核酸测序数据；
将所述测序数据与参考基因组进行比对；
基于所述比对的结果，确定所述标志微生物的丰度。
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