CN110408699A - 肠癌肠道菌群标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肠癌肠道菌群标志物及其应用,属于微生物和基因工程技术领域。所述的肠道菌群标志物包括巨球型菌属、韦荣氏球菌属、链球菌属、嗜胆菌属、嗜血杆菌、棒状杆菌或Escherichia‑Shigella。通过肠道菌群标志物的检测,可以评估个体患肠癌的风险,为疾病的诊断及预后监测提供辅助参考。
Description
技术领域
本发明属于微生物和基因工程技术领域,具体涉及一种肠道菌群标志物,及其在肠癌肠道菌群检测、肠癌患病风险预测、肠癌预后监测中的应用。
背景技术
肠癌是一种常见的消化系统恶性疾病,严重威胁着人类健康。肠癌目前已成为影响中国人健康的最常见的恶性肿瘤。肠癌如此多见,但是大部分患者发现时已是晚期,失去了最佳的治疗时机,导致肠癌患者确诊后5年生存率很低;在我国每5分钟就有1人死于大肠癌。有研究表明,肠癌的发生是一个多因素的过程,受饮食、环境和微生物暴露以及宿主免疫的影响,一系列不同的体细胞分子发生改变。其中肠道微生物是近来研究的热门,越来越多的研究显示,肠道微生物群可以通过多种方式影响肠癌的发生,并且在肠癌发生、发展过程中起重要作用。
在人类的肠道中,存在着大量微生物。这些肠道微生物除了传统意义上的肠道细菌群,还包括古细菌、病毒和原生动物,其中98%以上是细菌,统称为肠道菌群。正常肠道菌群有500~1500种不同细菌种类,其中绝大多数为厌氧菌。从基因层面上看,人体自身的基因组大约携带了2.5万个基因,而人体肠道微生物编码的基因总数约是人自身基因总数的150倍,被视作人类“第二基因组”。
因此,研究肠道微生物与肠癌的关系,建立基于肠道微生物的肠癌诊断模型,预期可以提高肠癌诊断的准确性,发现早期癌症,做到早发现、早诊断、早治疗,并且可以通过调整肠道菌群,提高肠癌治疗的效果。
发明内容
本发明的目的在于从肠道菌群角度提供一种肠癌的检测方法,为肠癌的辅助诊断与疗效监测提供参考。
本发明技术方案如下:
肠癌肠道菌群标志物,包括巨球型菌属、韦荣氏球菌属、链球菌属、嗜胆菌属、嗜血杆菌、棒状杆菌或Escherichia-Shigella中的一种或一种以上。
所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用。
进一步的,所述的检测试剂盒包括肠道菌群DNA提取试剂,肠道菌群16SrRNA基因可变区扩增的特异性引物,文库构建试剂和测序试剂。
所述的应用方法包括肠道菌群16S rRNA基因的测序,测序数据的分析,风险预测值的计算,患病风险的判断。
其中,所述的肠道菌群16S rRNA基因的测序方法包括粪便DNA的提取,肠道菌群16S rRNA基因文库的构建,文库的高通量测序。
所述的测序数据的分析方法包括对文库测序后得到的数据进行拼接,过滤除去引物和嵌合体序列,进行OTU聚类和物种注释,得到肠道菌群样本中的物种多样性和物种丰度。
所述的风险预测值的计算方法为,根据回归模型y=α+β1×x1+β2×x2+…+β16×x16,得出风险预测值y,式中α为常数,β为回归系数,x为致病菌属的相对丰度。
进一步的,所述的肠癌肠道菌群标志物在制备肠癌预后监测检测试剂盒中的应用。
进一步的,所述的肠癌肠道菌群标志物在筛选治疗或预防结直肠癌的药物中的应用。
区别于现有技术,上述技术方案的有益效果如下:
(1)本发明从肠道菌群的角度,辅助肠癌的诊断,也为肠癌的疗效监测提供参考。
(2)本发明的肠癌风险预测模型预测效果好,得到AUC曲线可达到0.9以上。
附图说明
图1为具体实施方式所述的文库质检结果。
图2为具体实施方式所述的物种相对丰度柱形图。
图3为具体实施方式所述的Alpha多样性指数组间差异箱型图。
图4为具体实施方式所述的AUC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明的技术方案进行详细说明,需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明,实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行,所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法,所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者,均在首次出现时标明,其后所用相同试剂如无特殊说明,均以首次标明的内容相同。
实施例1肠道菌群16S rRNA基因的建库
1样本来源
健康人的新鲜粪便样本101例、肠癌患者的新鲜粪便样本65例。
2粪便样本DNA的提取
采用离心柱法提取粪便样本DNA。
(1)柱平衡:向吸附柱MP1中(吸附柱放入收集管中)加入500uL的平衡缓冲液EQ(Buffer EQ),12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
(2)称取粪便样本180-220mg至2ml离心管中,并将管子置于冰上。
(3)向样本中加入1.2ml缓冲液GSL,间歇振荡1min至样本混匀。
(4)70℃孵育10min。
(5)涡旋15sec,12,000rpm(~13,400×g)离心10min。转移上清液700ul至新的2ml离心管。
(6)加入700ul HTR试剂,颠倒混匀15-30次。
(7)室温下,12,000rpm(~13,400×g)离心5min,转移500ul上清液至2.0ml离心管中。
(8)加入20ul Proteinase K和500ul Buffer GB至上清液中,颠倒混匀10次。
(9)70℃孵育10min。
(10)加入500ul无水乙醇,颠倒混匀10次。
(11)将上一步所得溶液的一半加入到吸附柱MP1中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱MP1放入收集管中;把余下的混合液转移至柱子中并离心。
(12)向吸附柱MP1中加入500ul缓冲液GD,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱MP1放入收集管中。
(13)向吸附柱MP1中加入600ul漂洗液SPW,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱MP1放入收集管中。
(14)重复操作步骤13。
(15)将吸附柱MP1放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(16)将吸附柱MP1置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50ul洗脱缓冲液TB,室温放置2-5min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。
3文库构建
3.1引物设计
针对16S rRNA基因的V3-V4区设计特异性引物并加上overhang序列,具体序列如下:
上游引物F:
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG(SEQ ID NO:1)
下游引物R:
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC(SEQ ID NO:2)
3.2PCR扩增和标记靶点
a)从-20℃冰箱中取出PCR Amplification Mix(购自南京诺唯赞生物科技有限公司),Primer Mix1(含有上述引物的TE Buffer)和肠道菌群基因组DNA,并在冰上进行化冻;
b)在0.2mL PCR tube中配制反应体系
c)将配置好的Mixure轻柔吹打10次,混匀,置于PCR仪中,执行以下程序:
d)反应结束后,取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,PCR产物约在500bp。电泳条件:1%Agarose,D2000 ladder,120V,20min。
3.3 PCR产物纯化
a)预先将AMPure XP磁珠从4℃冰箱中取出,室温平衡30min,使用前振荡混匀。新鲜配置80%乙醇;
b)取新的1.5mL EP管,标记后加入18.4μL磁珠,然后加入上一步的PCR产物,(R1=0.8:1)吹打10次混匀,注意不要产生气泡,室温静置5min;
c)离心后,将离心管置于磁力架上10min至液体澄清;
d)小心去除上清,注意尽量不要吸到磁珠;
e)保持EP管在磁力架上,贴壁缓慢加入200μL 80%的乙醇,吸打后静置30sec,去上清;
f)重复洗涤一次,去上清时尽可能除去任何残留的乙醇;
g)保持EP管在磁力架上,室温静置4min干燥磁珠;
h)加入32μL Resuspension Buffer,用枪吹打混匀磁珠,然后室温静置2min。
i)瞬时离心后,将离心管放到磁力架上至液体澄清。
j)移取30μL上清至新的标记的1.5mL离心管中。
3.4为靶点建立index标签
a)从-20℃冰箱中取出PCR Amplification Mix(2X),10μM/μLIndexed PCRprimer i5和Indexed PCR primer i7,并在冰上进行化冻;
以下仅列出一组Index序列,其余序列见Nextera Index Kit–PCR Primers试剂盒。
i5:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO:3)
i7:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG(SEQ ID NO:4)
b)在0.2mL离心管中按以下方法配制反应体系:
c)将配置好的Mix轻柔吹打10次混匀,然后置于PCR仪中,反应程序如下:
3.5文库纯化
a)取新的1.5mL离心管,标记后加入50μL室温平衡后的磁珠,然后加入上一步的PCR产物,吹打10次混匀,室温静置5min;
b)瞬时离心后,将离心管放到磁力架上至液体澄清。
c)小心去除上清,注意尽量不要吸到磁珠。
d)保持PCR管在磁力架上,加入200μL 80%的乙醇,吸打后静置30sec,去上清。
e)重复洗涤一次,去上清时尽可能除去任何残留的乙醇。
f)保持离心管在磁力架上,室温静置4min干燥磁珠。
g)加入27μL Resuspension Buffer,用枪吹打混匀磁珠,然后室温静置2min。
h)瞬时离心后,将离心管放到磁力架上至液体澄清。
i)移取25μL上清至新的标记的1.5mL离心管中。
3.6文库质检
a)取1μL使用Qubit3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行浓度检测,并记录浓度。
b)使用Agilent 2200High Sensitivity D1000kit对文库进行条带分布检测。
4实验结果
4.1PCR扩增结果
第一轮和第二轮PCR结果扩增出500-750bp之间的目标片段,以及120bp左右的引物二聚体。
4.2文库纯化及质检结果
文库经磁珠法纯化后,引物二聚体可被去除。构建好文库用Agilent2200Bioanalyzer进行质检,结果如图1所示,文库大小为500-700bp,基本上没有引物二聚体。
实施例2文库的测序
1测序步骤
1.1文库混合
将需要测序的文库,根据需要测的3-5万tags数要求混合;
1.2文库质检
将混合后的样本,进行Qubit3.0和Agilent 2200Bioanalyzer质检;
1.3文库稀释
用Hyb Buffer对文库进行稀释到上机浓度;
1.4文库变性
用0.2N NaOH对文库进行变性5分钟,变性后可选0.2M的Tris-HCl pH 7.0进行文库变性后中和;
1.5变性稀释
用Hyb Buffer对变性文库进行稀释;
1.6上机稀释
最后,再用Hyb Buffer对变性稀释文库进行最后上机稀释;
1.7上机测序
将上机稀释文库,放进试剂槽中,和芯片等一同放进Miseq测序仪,导入Samplesheet,设置reads和index的读长等,最后仪器开始测序。
2测序结果
采用Miseq PE250进行测序,测序结果Q30>75%,碱基质量较好。
实施例3测序数据的分析
1测序数据拼接
根据Barcode序列从下机数据中拆分出各样品数据,截去Barcode后使用FLASH对每个样品的reads进行拼接,得到的拼接序列为原始Tags数据(RawTags);拼接得到的RawTags,需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照QIIME的Tags质量控制流程,进行如下操作:a)Tags截取:将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为<=19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断;b)Tags长度过滤:Tags经过截取后得到的Tags数据集,进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。经过以上处理后得到的Tags去除引物以及嵌合体。
2测序数据处理
使用Mothur过滤处理得到高质量的reads,之后进一步去除嵌合体序列,至此完成测序数据的处理。
3 OTU聚类和物种注释
利用Mothur软件对数据处理过的样品进行聚类,默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units),同时会选取OTUs的代表性序列,依据其算法原则,筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释,用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1),获得分类学信息并分别在各个分类水平:kingdom(界),phylum(门),class(纲),order(目),family(科),genus(属),species(种)统计各样本的群落组成。
根据物种注释结果,选取每个样品或分组在各分类水平上最大丰度排名前10的物种,生成物种相对丰度柱形累加图,以便直观查看各样品在不同分类水平上,相对丰度较高的物种及其比例。
4物种多样性及组间差异分析
根据物种注释结果,进行Alpha多样性指数组间差异分析,并通过T-test检验分析组间物种多样性差异是否显著。
采用LEfSe(LDA Effect Size)方法,在组与组之间寻找具有统计学差异的Biomarker,即组间差异显著的物种。
5分析结果
根据物种注释结果,得到属水平上的物种相对丰度柱形图,如图2所示。与健康人相比,肠癌患者肠道菌群多样性增多,肠癌患者肠道菌群中巨球型菌属(Megasphaera),Escherichia-Shigella增多,粪杆菌属(Faecalibacterium)减少。根据Alpha多样性分析,也能得出肠癌组物种多样性增多,如图3所示。
根据LEfSe分析结果,并结合T-test检验结果,分析得出巨球型菌属(Megasphaera)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Escherichia-Shigella、链球菌属(Streptococcus)、嗜胆菌属(Bilophila)、嗜血杆菌(Haemophilus)、棒状杆菌(Corynebacterium)等16个属是肠癌主要致病菌属,可以作为肠癌相关的生物标志物,其中巨球型菌属为最主要的致病菌。
基于此,可以构建个体患病风险检测试剂盒,用于肠癌患病风险的评估。试剂盒由肠道菌群DNA提取试剂,肠道菌群16S rRNA基因可变区扩增的特异性引物,文库构建试剂和测序试剂组成。还可以构建用于肠癌预后监测的检测试剂盒。
实施例4回归模型
根据实施例3分析得到的菌群数据和肠癌生物标志物作逻辑回归分析。建立回归模型:y=α+β1×x1+β2×x2+…+β16×x16,式中α为常数,β为回归系数,x为致病菌属的相对丰度,y为预测值。
根据pROC包画图找到最优临界点为0.111。也就是说,当预测值大于0.111被分类为肠癌低风险,预测值小于0.111被分类为肠癌高风险时,预测效果最好。计算得到精度(Accurancy)为0.85,说明这个模型拟合效果不错。
通过画ROC曲线,并计算其AUC面积,作为评估二类分类效果的一个典型测量。计算后得到AUC为0.963,如图4所示。说明本模型预测效果较好,可以根据该模型对肠癌的患病风险进行预测。
综上,首先,物种多样性、相对丰度以及肠癌相关致病菌属,可以作为肠癌辅助诊断的指标;其次,还可以结合诊断模型,对肠癌进行进一步诊断,或者对肠癌患病风险进行评估,或者用于肠癌预后的监测;再次,肠癌患者可以通过补充缺失的有益菌,调节肠道菌群平衡,辅助肠癌的治疗。另外,肠癌肠道菌群标志物还可以应用于筛选治疗或预防结直肠癌的药物。
需要说明的是,尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述,但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此,基于本发明的创新理念,对本文所述实施例进行的变更和修改,或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域,均包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 福建卫生职业技术学院
<120> 肠癌肠道菌群标志物及其应用
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 细菌(Bacteria)
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 细菌(Bacteria)
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 细菌(Bacteria)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctattcg tcggcagcgt c 51
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 细菌(Bacteria)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agattcgcct tagtctcgtg ggctcgg 47
Claims (9)
1.肠癌肠道菌群标志物,其特征在于:所述的肠道菌群标志物包括巨球型菌属、韦荣氏球菌属、链球菌属、嗜胆菌属、嗜血杆菌、棒状杆菌或Escherichia-Shigella中的一种或一种以上。
2.一种如权利要求1所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的检测试剂盒包括肠道菌群DNA提取试剂,肠道菌群16S rRNA基因可变区扩增的特异性引物,文库构建试剂和测序试剂。
4.根据权利要求2所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的应用方法包括肠道菌群16S rRNA基因的测序,测序数据的分析,风险预测值的计算,患病风险的判断。
5.根据权利要求4所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的肠道菌群16S rRNA基因的测序方法包括粪便DNA的提取,肠道菌群16S rRNA基因文库的构建,文库的高通量测序。
6.根据权利要求4所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的测序数据的分析方法包括对文库测序后得到的数据进行拼接,过滤除去引物和嵌合体序列,进行OTU聚类和物种注释,得到肠道菌群样本中的物种多样性和物种丰度。
7.根据权利要求4所述的肠癌肠道菌群标志物在制备个体患病风险检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的风险预测值的计算方法为,根据回归模型y=α+β1×x1+β2×x2+…+β16×x16,得出风险预测值y,式中α为常数,β为回归系数,x为致病菌属的相对丰度。
8.一种如权利要求1所述的肠癌肠道菌群标志物在制备肠癌预后监测检测试剂盒中的应用。
9.一种如权利要求1所述的肠癌肠道菌群标志物在筛选治疗或预防结直肠癌的药物中的应用。
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