CN104789688A - 与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用 - Google Patents
与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程及分子遗传学领域,涉及与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用。本发明的单核苷酸多态性标记物对中国人群先天性巨结肠具有特异性和敏感性,可用于制备婴幼儿(或儿童)先天性巨结肠诊断或筛查的试剂,有效避免侵入性检查,可在症状出现前进行早期筛查和诊断,并可通过检测患儿父母DNA判断疾病来源,评估再次生育的患病风险。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及分子遗传学领域,涉及与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物及其应用。
背景技术
先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HSCR,OMIM#142623),又称肠无神经节细胞症,是导致功能性肠梗阻的最常见的小儿消化道畸形,属典型肠神经系统先天发育异常性疾病。主要病理特征是病变肠段肌间神经丛和粘膜下神经丛神经节细胞缺如伴神经纤维增生,肠道神经调节紊乱,以致受累肠段持续异常收缩,近端结肠代偿性扩张、增厚,形成巨结肠。主要临床表现是胎粪排出延迟或无胎粪排出,继发腹胀及肠梗阻。现已明确HSCR是一种神经嵴细胞(Neural Crest Cell,NCC)源性疾病,发病与胚胎期NCC在肠道内的迁移、增殖、分化、成熟异常有关。根据受累肠段的范围,本病可分为短段型(最常见,约占全部HSCR的80%)、长段型(15%)及全结肠型(5%)三种。HSCR平均发病率为1/5,000,存在明显种族差异:亚洲人群最高,为1.4/5,000。我国属高发病率国家。目前我国统计活产儿发病率约为1/3,000,男性明显高于女性(约4∶1),即每年有近5500名新生儿会出现该种出生缺陷,仅次于先天性肛门直肠畸形。新生儿患者因临床表现多样、发病轻重程度不一、伴发症状各异,非常容易漏诊造成严重后果;虽然近年来外科治疗手段的不断改进使得本病死亡率大大降低,但仍有很多患儿在治疗后出现一系列并发症,造成进一步处理困难甚至是难以矫治的遗留问题,严重影响患儿健康,给社会和家庭带来了沉重的经济负担。
新生儿HSCR的诊断相当困难,需要先结合其临床表现:不排胎便或胎便排出延迟合并腹胀、肠梗阻、呕吐,直肠指检伴有气、便排出,才能考虑本病诊断。同时还需对患儿进行一系列辅助检查,如:下消化道造影,24小时钡剂灌肠检查,肛门直肠测压及活检病理检测等,这些辅助检查本身也存在一些缺陷,如检查价格昂贵、射线辐射危险、操作繁琐且有一定的创伤性及风险。这都给患儿带来极大的痛苦并且给家庭带来沉重的经济负担。更为重要的是,这类检查均基于不排胎便及胎便排出延迟等临床症状的发生,而出现此类症状往往已在患病后数日常常错过了最佳的早期手术时机,并给患儿带来了相当长时间的痛苦。另外一种临床常见情况是患儿病情严重凶险,为了及时缓解症状、挽救患儿生命,首诊医院只能进行急诊回肠造瘘手术,术中未行病理检查病因不明,术后远端结肠形态改变往往已不典型,给后续诊断和鉴别诊断带来很大困扰。综上所述,寻找一种简单、准确、微创的早期HSCR诊断方法意义重大。
目前虽然也有通过检测血浆中的miRNA标记物来对HSCR进行早期诊断和筛查的方法,但是这种标记物诊断是通过测量血浆中miRNA的数量变化进行的,而标记物数量的测量结果和精度很容易受到检测方法和结果判读人员的主观影响,客观真实性不强。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,即SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,鉴于其易于基因分型和适于快速、规模化筛查的特性,几十年来在遗传性疾病乃至正常人类性状的研究中都具有重要意义。并且,绝大多数单核苷酸多态性都是二等位多态性,非此即彼,对这些标记物的检测结果不会受标记物浓度的影响,更具准确性和敏感性。
虽然近年来陆续有学者在对SNP和先天性巨结肠发生的相关性进行研究,也发现了一些先天性巨结肠的相关基因。但是,由于SNP具有比较大的种族差异性,到目前为止,一直尚未有明确的专门针对中国人群HSCR疾病进行早期诊断筛查的SNP或SNP组合报道,尤其是尚未发现有稳定的、特异的、敏感的与中国人群HSCR发病相关的SNP标记物。
发明内容
本发明提供了一种与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物,其选自rs2435357、rs2506030或rs12707682中的一种。其中,
rs2435357的序列为SEQ ID No.1所示的序列:
GCCAAGGGGGCCAGTGACCCTTACACGGTCATCCACAGGCCACTTGGGTGG,
其中26位核苷酸为SNP位点,参考核苷酸为C,变异核苷酸为T。
rs2506030的序列为SEQ ID No.2所示的序列:
AAAATAGAATCGACACCAATGACCTATTCCAGTCTCCCCTCCCGACTGCAG,
其中26位核苷酸为SNP位点,参考核苷酸为A,变异核苷酸为G。
rs12707682的序列为SEQ ID No.3所示的序列:
AATTAGGAGAAACATTTCCATTGACCTAGTACCATCACTACCACTGTTGAT,
其中26位核苷酸为SNP位点,参考核苷酸为C,变异核苷酸为T。
优选的,本发明所述的与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物为rs2435357、rs2506030、rs12707682中任意二个的组合。
优选的,本发明所述的与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物为rs2435357、rs2506030和rs12707682的组合。
本发明还提供了一种上述单核苷酸多态性标记物的引物,其中rs2435357的上游引物为SEQ ID No.4,下游引物为SEQ ID No.5;rs2506030的上游引物为SEQ ID No.6,下游引物为SEQ ID No.7;rs12707682的上游引物为SEQ ID No.8,下游引物为SEQ ID No.9。
引物名称 | SEQ ID No. | 引物序列 |
rs2435357上游引物 | 4 | CCACCACCCACACTTCCATACC |
rs2435357下游引物 | 5 | CTGAGTCACTGCCTTGCTGAGT |
rs2506030上游引物 | 6 | AGGCTCACCGAGGACACAGA |
rs2506030下游引物 | 7 | AAGTACCTGGCAGTGCTCAACA |
rs12707682上游引物 | 8 | TCTCTCCCTGTCTCCCTCTC |
rs12707682下游引物 | 9 | CGTCTTTCAAGTCTGTGTATTTCTG |
本发明还提供了一种上述单核苷酸多态性标记物在制备中国人群先天性巨结肠的诊断筛查试剂中的应用。
本发明还提供了一种上述单核苷酸多态性标记物的引物在制备中国人群先天性巨结肠的诊断筛查试剂中的应用。
本发明还提供了一种用于对中国人群先天性巨结肠进行诊断筛查的试剂盒,其包含上述单核苷酸多态性标记物的引物。优选的,所述试剂盒中的引物选自SEQ ID No.4和SEQ ID No.5,SEQ ID No.6和SEQID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9中的一对或多对。试剂盒中还包含Taq DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等PCR常用试剂。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明所述的三个单核苷酸多态性标记物对中国人群HSCR的早期诊断筛查具有稳定性、特异性和敏感性,三个标记物组合进行诊断筛查,显著性差异更大。
2、HSCR相关SNP具有比较大的种族差异性,本发明的SNP是对中国人群先天性巨结肠患者最有针对性的,因此采用这种方法对中国儿童进行患病风险评估和筛查是最恰当的。
3、单核苷酸多态性是人类基因组固有的标记物,检测方法简便、可靠、稳定,重复性高,适于快速检测得到结果,是一种最为理想的可以应用于临床诊断、筛查的手段。这类标记物的成功组合开发将为出生缺陷的防治开创全新局面,并为其他人类复杂疾病的生物标记物研制提供借鉴。
4、绝大多数单核苷酸多态性都是二等位多态性,非此即彼,因此对于这些标记物的检测通过SNP位点有无变化就能进行诊断,相比之下,miRNA标记物、小分子标记物或其他以蛋白为主的传统生物标记物的检测都需要通过检测标记物的数量变化程度才能进行诊断,这样比较容易受到检测方法和结果判读人员的主观影响,客观真实性不强。
5、本发明提供的单核苷酸多态性标记物可用于中国人群先天性巨结肠诊断、筛查,可避免侵入性辅助检查,并可在早期症状出现前通过微创方式获得HSCR的患病风险评估,从而为临床医生进一步选择深入检查提供依据,为快速、准确地掌握患者的疾病状态和严重程度,及时采取更具针对性的、个性化的防治方案提供支持,延缓和阻止疾病进展,获得最佳预后。
6、单核苷酸多态性作为一种最常用的遗传学标记物,其应用价值还在于这类标记物自身的遗传特性,即,通过检测患儿父母DNA可以判断疾病来源,并对再次生育的患病风险做出评估、预测,这是其他生物标记物的检测都无法实现的,将有可能为降低中国人群先天性巨结肠的患儿出生率提供理论依据。
附图说明
图1:HSCR影像学鉴别诊断(24小时钡剂灌肠)。
A、B患者:钡灌肠示结肠细小,但24小时后大部分钡剂自主排出,仅直肠有少量残留,术中及术后病理除外巨结肠;C、D患者:钡灌肠示结肠细小,24小时后全部结肠均有钡剂残留,术中及术后病理证实为全结肠巨结肠。
图2:HSCR术中病理切片鉴别诊断(HE染色)。
A、B患者:乙状结肠术中冰冻切片普通HE染色×200(A),回肠术中冰冻切片普通HE染色×200(B),箭头所指为发育成熟的神经节细胞,可以除外先天性巨结肠;C、D患者:回肠末端术中冰冻切片普通HE染色×200(C),乙状结肠术中冰冻切片普通HE染色×200(D),两张切片均未找见神经节细胞,证实为全结肠巨结肠。
图3:以rs2435357、rs2506030、rs12707682三个SNP的组合作为标记物时,风险等位基因累计数的个数分布、相应样本百分比和拟合权重曲线。图中x轴显示3个SNP风险等位基因累计计数值,y轴显示携带相应数值风险等位基因的样本占总样本数的百分比。空白填充为正常对照组,黑色填充为HSCR组。权重曲线为对两组人群0至6个风险等位基因样本百分比的拟合4次方曲线,浅色为正常对照组,深色为HSCR组。
具体实施方式
以下通过实施案例对本发明作进一步阐述。
实施例1:研究对象的选择和分组依据
于2012年4月至2014年4月间从首都儿科研究所附属儿童医院普通外科收集符合影像学和病理学临床诊断标准的先天性巨结肠患儿及同期住院的正常非先天性巨结肠儿童血液和肠组织样品(其中图1为影像学临床诊断标准,图2为病理学临床诊断标准)各115例作为外周血单核苷酸多态性检测的实验对象(最终正常对照组有一例因样本质量原因被剔除,剩余114例),共229例研究对象。
具体的样品归类标准如下:
A组:先天性巨结肠组(n=115):
1.年龄在0至156月间(平均16.1月),其中男性82人,占总人数的71.3%;
2.经下消化道造影、24小时钡剂灌肠、术中及术后病理证实为先天性巨结肠;
3.无伴随其他器官或系统先天畸形;
4.无其他消化系统疾病;
5.无其他全身性重大疾病或染色体异常。
B组:正常对照组(同期住院儿童,n=114);
1.年龄在0至156月间(平均35.9月),其中男性79人,占总人数的69.3%;
2.无消化系统疾病;
3.无其他先天畸形;
4.无其他全身性重大疾病。
实施例2:研究对象病理诊断分型
在无胎便排出、胎便排出延迟、长期反复难治性便秘或通过灌肠等手段使大便排出的患儿使用放射学检查(下消化道造影、24小时钡剂灌肠)、肛管直肠测压、直肠壁组织学活检诊断先天性巨结肠。放射学检查包括24小时钡剂灌肠的特征表现如下:1.病变段与扩张段可见一“锥体”状移行分隔区;2.病变段有不规则收缩;3.钡剂潴留;4.直肠痉挛不扩张;5.肠壁僵直僵硬。肛管直肠测压法主要表现为肛门内括约肌松弛反射缺如,肛管节律性收缩明显减少,直肠内和内括约肌部静止压高于正常。直肠壁组织学活检主要观察粘膜下神经丛及肌间神经丛有无神经节细胞及细胞发育程度。正常的神经节细胞核大、染色深、居正中、核仁明显、周围胞浆嗜碱性。以上临床检查方法均存在其局限性,分述如下:(1)放射学方法对患儿有潜在的损伤,对新生儿巨结肠、急诊造瘘术后患儿、超短段型巨结肠与特发型巨结肠等表现不典型患儿诊断困难。(2)直肠肛管测压的诊断准确性在儿童组总体较高,可以达到95%以上,新生儿组也有60%-85%,但仍存在假阴性报告,可造成患儿漏诊。(3)直肠壁活检方法较为精确,但对患儿有明显创伤,且风险较大,有造成肠穿孔等严重后果的可能性,难以普遍开展。综上所述,实际临床工作中更为常用的患儿确诊方法是术中或术后对手术切除标本进行病理学检查(图2),术后组织标本狭窄段未见神经节细胞者可诊断为先天性巨结肠。
实施例3:制备实施例1研究对象的外周血DNA样品
a)取新鲜肝素抗凝血2ml;
b)加入4℃灭菌水至40ml,翻转混匀;
c)4℃冰箱内静置30min,3000RPM离心20min,弃上清;
d)向管底白细胞加入4℃灭菌水20ml,轻震数次后加入400μl 10%Triton,再加入4℃灭菌水至40ml,轻震数次;
e)3000RPM离心20min,弃上清;
f)加入2ml DNA提取液,剧烈震荡至团块基本溶解,其中DNA提取液(400ml)的组分为:0.5M EDTANa2(pH8.0)8ml,1M Tris盐酸(pH8.0)4ml,6M Nacl 0.66ml,去离子水387.34ml;
g)分别加入100μl 10%SDS和70μl蛋白酶K(10mg/ml),混匀后37℃恒温水浴箱过夜;
h)第二天向离心管内加入600μl 6M NaCl,轻微震荡混匀,3000RPM离心20min,将上清液倒入一个新的15ml离心管内;
i)加入2倍体积预冷无水乙醇,颠倒数次后静置;
j)挑出絮状DNA至1.5ml EP管,70%乙醇洗涤2次后将DNA置于管壁晾干;
k)加入适当体积的Tris-EDTA缓冲液,待DNA完全溶解后检测浓度,统一稀释至10ng/μl。
实施例4:SNP标记物的筛选
(1)初步筛选过程:在对实施例1的研究对象进行检测之前,先利用Affymetrix公司的500K芯片(SNP5.0Array),对之前已确诊的共649个先天性巨结肠核心家系(患儿及其未患病父母,共计1947份DNA样本。其中男性患儿467人,占总患儿的72.0%。病史、辅助检查除外其他先天畸形、已知综合征和染色体异常,术中及术后病理证实为先天性巨结肠)进行全基因组关联分析研究,最终达到质控标准的SNP共计356,308个。通过现有的数据分析和芯片研究结果,我们初步筛选出5个基因上的14个与先天性巨结肠发生有相关性的SNP,分别是:RET基因的rs2435357、rs2506030,SEMA3基因的rs12707682、rs11766001,NRGl基因的rs16879552、rs7835688,FZD3基因的rs3735725、rs12679661、rs17059206和CELSR3基因的rs9868809、rs2286652、rs2302295、rs6773261、rs3821875。
(2)SNP Genotyping Assay(SNP基因分型分析):
采用SNP基因分型分析法,对实施例1中229例研究对象的外周血DNA样品中的上述14个SNP逐一进行检测分析,所有试剂及SNP基因分型分析试剂盒均购自英潍捷基(上海)公司,并按照SNP基因分型分析手册(Part Number 4332856Rev.C)上的步骤进行:
将稀释好的DNA进行PCR扩增反应,反应体系包括:5μlMaster Mix、2μl外周血DNA模板、0.25μlSNP Genotyping Assay以及2.75μl无核酸酶水。反应步骤为:95℃孵育10分钟,循环反应40次:92℃15秒,60℃1分钟,最后60℃孵育10分钟。
扩增结束后将PCR产物放入ABI 7500Fast real-time PCR仪进行终末点荧光强度检测,并通过软件(Genotyper Software)对SNP检测结果进行分析,分别计算每个SNP的风险等位基因(risk allele)在先天性巨结肠组和正常对照组出现的数量以及频率。
所得数据采用SPSS19.0统计软件包进行统计分析。对于定量资料采用Mann-Whitney秩和检验;对于非参数分析,则采用χ2检验;以P<0.05为差异有统计学意义。相对危险度(Odds Ratio,OR)的计算公式为:OR=(先天性巨结肠患者携带风险等位基因例数/先天性巨结肠患者不携带风险等位基因例数)/(正常对照携带风险等位基因例数/正常对照不携带风险等位基因例数)。
通过计算,最终筛选出在中国人群先天性巨结肠患者中,以下3个SNP的风险等位基因(risk allele)的频率显著高于正常对照组:rs2435357、rs2506030以及rs12707682。这三个SNP的计算数值如下:
实施例5:对SNP筛选结果进行验证
随机选取先天性巨结肠组和正常对照组中各60例样品,送到上海生工北京分公司通过SangerSequencing(桑格测序法)对实施例4中筛选出的3个SNP进行序列测定结果验证。测序结果均与SNP基因分型分析法的结果100%吻合,说明SNP基因型分析结果稳定、可靠、重复性高,易于快速筛选。
实施例6:单个SNP作为标记物对中国人群先天性巨结肠的诊断筛查结果
分别单独应用实施例4筛选出的三个SNP对中国人群先天性巨结肠进行诊断筛查。对于单个SNP,每个样本可能有0、1、2个风险等位基因,累计数最高为2,最低为0。通过分析每个SNP在不同风险等位基因累计数的情况下的相对危险度,来对中国人群患有先天性巨结肠的风险度进行评估。实施例4的三个SNP的诊断筛查结果如下:
rs2435357:
从上表可以看出,先天性巨结肠组绝大部分(64%)风险等位基因累计数为2,而正常对照组绝大部分(52%+32%=84%)风险等位基因累计数为1或者0。表中相对危险度的结果说明,风险等位基因累计数为1或者0时,是明确的“保护性”因素,这类人群的患病风险显著低于一般人群(一般人群的患病风险以1计);反之,风险等位基因累计数达到2是明确的“危险性”因素,这类人群的患病风险显著高于一般人群(最高可达9倍)。因此,单独应用rs2435357作为SNP标记物,可以对中国人群先天性巨结肠进行明确诊断筛查:风险等位基因累计数为1或者0时,患病风险很小;风险等位基因累计数为2时,患病风险显著高于一般人群。
rs2506030:
从此表可以看出,先天性巨结肠组绝大部分(74%)风险等位基因累计数为2,而正常对照组中一半(40%+10%=50%)风险等位基因累计数为1或者0。表中相对危险度的结果说明,风险等位基因累计数为1或者0时,是明确的“保护性”因素,这类人群的患病风险显著低于一般人群(一般人群的患病风险以1计);反之,风险等位基因累计数达到2是明确的“危险性”因素,这类人群的患病风险显著高于一般人群(最高可达2.8倍)。因此,单独应用rs2506030作为SNP标记物,可以对中国人群先天性巨结肠进行明确诊断筛查:风险等位基因累计数为1或者0时,患病风险很小;风险等位基因累计数为2时,患病风险显著高于一般人群。
rs12707682:
从此表可以看出,先天性巨结肠组绝大部分(56%+33%=89%)风险等位基因累计数为1或者2,而正常对照组绝大部分(47%+31%=78%)风险等位基因累计数为1或者1以下。表中相对危险度的结果说明,风险等位基因累计数为0时,是明确的“保护性”因素,这类人群的患病风险显著低于一般人群(一般人群的患病风险以1计)。
通过上述三个表格可以看出,以rs2435357、rs2506030这两个SNP作为标记物,可以很好地将对照组和HSCR患儿分开,区别出高患病风险和低患病风险的人群,从而能够单独使用对中国人群先天性巨结肠进行明确诊断筛查。以rs12707682这个SNP作为标记物,也能够很好地区别出低患病风险的人群,从而能够单独使用对中国人群先天性巨结肠进行明确诊断筛查。
实施例7:SNP组合作为标记物对中国人群先天性巨结肠的诊断筛查结果
对实施例4筛选出的3个SNP进行组合作为标记物,对中国人群先天性巨结肠进行诊断筛查。每个样本在每个SNP可能有0、1、2个风险等位基因,以此类推,因此每个样本在任意2个SNP组合的风险等位基因累计数是0-4之间的一个确定的数字,最高为4,最低为0;在全部3个SNP的风险等位基因累计数是0-6之间的一个确定的数字,最高为6,最低为0。通过分析每种SNP组合在不同风险等位基因累计数的情况下的相对危险度,来对中国人群患有先天性巨结肠的风险度进行评估。诊断筛查结果见下表和图3:
从此表可以看出,rs2435357+rs2506030组合以及rs2506030+rs12707682组合时,风险等位基因累计数达到4时都会显著增加患病风险,其相对危险度分别可达7.53和3.38。而rs2435357+rs12707682的组合在风险等位基因累计数达到3时即开始增加患病风险,达到4时最高,相对危险度分别为5.3和7.32。
当3个SNP组合时,先天性巨结肠组绝大部分(43%+17%=60%)风险等位基因累计数为5或者6,而正常对照组绝大部分(30%+21%+11%=62%)风险等位基因累计数为3或者3以下,当风险等位基因累计数达到5时,其相对危险度为7.7,风险等位基因累计数达到6时,其相对危险度可达5.4。从图3中也可以看出,在正常对照组中,风险等位基因累计数分布的权重曲线近似于正态分布,但是在先天性巨结肠组,风险等位基因累计数分布的权重曲线明显向风险等位基因累计数高的方向偏移,变成了偏态分布曲线。
因此,应用rs2435357、rs2506030、rs12707682这三个SNP中的任意二者组合作为标记物,或者以这三个SNP的组合作为标记物,都可以对中国人群先天性巨结肠进行明确诊断筛查。举例来说,如有一个样本在3个SNP的风险等位基因累计数为1或者0(最低的分值组),则其不可能为先天性巨结肠病例,而应为正常对照。表中相对危险度的结果说明,风险等位基因累计数在3或者3以下时,是明确的“保护性”因素,这类人群的患病风险显著低于一般人群(一般人群的患病风险以1计);反之,风险等位基因累计数在5或者5以上是明确的“危险性”因素,这类人群的患病风险显著高于一般人群(最高可达7.7倍)。
实施例8:用于中国人群先天性巨结肠早期诊断和筛查的SNP的引物和试剂盒
通过Primer 5在线软件对实施例4的三个SNP设计引物为:rs2435357的上游引物为SEQ ID No.4,下游引物为SEQ ID No.5;rs2506030的上游引物为SEQ ID No.6,下游引物为SEQ ID No.7;rs12707682的上游引物为SEQ ID No.8,下游引物为SEQ ID No.9。
引物名称 | SEQ ID No. | 引物序列 |
rs2435357上游引物 | 4 | CCACCACCCACACTTCCATACC |
rs2435357下游引物 | 5 | CTGAGTCACTGCCTTGCTGAGT |
rs2506030上游引物 | 6 | AGGCTCACCGAGGACACAGA |
rs2506030下游引物 | 7 | AAGTACCTGGCAGTGCTCAACA |
rs12707682上游引物 | 8 | TCTCTCCCTGTCTCCCTCTC |
rs12707682下游引物 | 9 | CGTCTTTCAAGTCTGTGTATTTCTG |
本发明SNP试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于PCR技术。试剂盒包括:SNP引物,以及相关PCR技术的常用试剂,如Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液等试剂,这些试剂都可采用相应的市售产品。
下面以单个SNP为标记物、两个SNP组合为标记物、三个SNP组合为标记物举例说明试剂盒的组成,本领域技术人员知晓可根据实际需要调整试剂盒中的成分和比例:
单个SNP为标记物,例如,以rs2506030为SNP标记物:
引物1对:SEQ ID No.6和SEQ ID No.7,各20uM 1.5μl;0.5μl Taq DNA聚合酶,5μl 10×PCR缓冲液,5μl2.5mM dNTP混合液,21.5μl无核酸酶水。
两个SNP组合为标记物,例如,以rs2435357和rs12707682为SNP标记物:
引物2对:SEQ ID No.4和SEQ ID No.5,以及SEQ ID No.8和SEQ ID No.9,各20uM 1.5μl;1μlTaq DNA聚合酶,10μl 10×PCR缓冲液,10μl 2.5mM dNTP混合液,43μl无核酸酶水。
三个SNP为标记物,例如,以rs2435357、rs2506030和rs12707682的组合为SNP标记物:
引物3对:SEQ ID No.4和SEQ ID No.5,SEQ ID No.6和SEQ ID No.7以及SEQ ID No.8和SEQ IDNo.9,各20uM 1.5μl;1.5μl Taq DNA聚合酶,15μl10×PCR缓冲液,15μl 2.5mM dNTP混合液,64.5μl无核酸酶水。
本发明的试剂盒只需要一次性抽出少量血液(2ml),即可检测外周血DNA中的SNP标记物并根据检测分析结果预测先天性巨结肠发生可能性或对疾病进行早期症状前筛查。
Claims (9)
1.一种与中国人群先天性巨结肠发生相关的单核苷酸多态性标记物,其选自rs2435357、rs2506030或rs12707682中的一种;其中,
所述rs2435357的序列如SEQ ID No.1所示:
GCCAAGGGGGCCAGTGACCCTTACACGGTCATCCACAGGCCACTTGGGTGG;
所述rs2506030的序列如SEQ ID No.2所示:
AAAATAGAATCGACACCAATGACCTATTCCAGTCTCCCCTCCCGACTGCAG;
所述rs12707682的序列如SEQ ID No.3所示:
AATTAGGAGAAACATTTCCATTGACCTAGTACCATCACTACCACTGTTGAT。
2.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性标记物,其选自rs2435357、rs2506030、rs12707682中任意二个的组合。
3.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性标记物,其选自rs2435357、rs2506030、rs12707682的组合。
4.权利要求1-3中任一所述的单核苷酸多态性标记物的引物。
5.根据权利要求4所述的单核苷酸多态性标记物的引物,其中rs2435357的上游引物为SEQ ID No.4所示,下游引物为SEQ ID No.5所示;rs2506030的上游引物为SEQ ID No.6所示,下游引物为SEQ ID No.7所示;rs12707682的上游引物为SEQ ID No.8所示,下游引物为SEQ ID No.9所示。
6.权利要求1-3中任一所述的单核苷酸多态性标记物在制备中国人群先天性巨结肠的诊断筛查试剂中的应用。
7.权利要求4所述的单核苷酸多态性标记物的引物在制备中国人群先天性巨结肠的诊断筛查试剂中的应用。
8.一种用于对中国人群先天性巨结肠进行诊断筛查的试剂盒,其包含权利要求4所述的单核苷酸多态性标记物的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其中所述引物选自SEQ ID No.4和SEQ ID No.5,SEQ ID No.6和SEQID No.7,SEQ ID No.8和SEQ ID No.9中的一对或多对。
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