WO2010010951A1 - 子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法およびそれに用いるプローブ - Google Patents

子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法およびそれに用いるプローブ Download PDF

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WO2010010951A1
WO2010010951A1 PCT/JP2009/063282 JP2009063282W WO2010010951A1 WO 2010010951 A1 WO2010010951 A1 WO 2010010951A1 JP 2009063282 W JP2009063282 W JP 2009063282W WO 2010010951 A1 WO2010010951 A1 WO 2010010951A1
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WO
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mrna
probe
base sequence
seq
detection
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PCT/JP2009/063282
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French (fr)
Inventor
雅彦 黒田
好紀 小杉
恒輔 及川
正視 田中
正勝 高梨
聖子 飯塚
Original Assignee
Kuroda Masahiko
Kosugi Yoshinori
Oikawa Kosuke
Tanaka Masami
Takanashi Masakatsu
Iizuka Seiko
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Publication date
Application filed by Kuroda Masahiko, Kosugi Yoshinori, Oikawa Kosuke, Tanaka Masami, Takanashi Masakatsu, Iizuka Seiko filed Critical Kuroda Masahiko
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the expression of mRNA that is an indicator of endometriosis-related diseases and a probe used therefor, and in particular, histamine-releasing factor (HRF) mRNA that is an indicator of endometriosis-related diseases
  • HRF histamine-releasing factor
  • the present invention relates to a method for detecting the expression of aromatase mRNA.
  • Endometriosis is a disease in which an endometrial tissue that is originally present only in the uterine lumen or a similar tissue occurs and proliferates at a site other than the uterine lumen (external position of the uterus).
  • Sites that are likely to occur are generally in the lower abdomen surrounded by the pelvis, particularly in the ovary, dalascus fossa, sigmoid colon, rectum, sacral uterine ligament, heel, vulva, bladder, abdominal wall, navel, etc. It is.
  • the endometrial tissue that occurs outside the uterus also exfoliates and bleeds, just like the uterine lumen.
  • the endometriosis diagnosis method depends on age and symptoms, but in general, in addition to internal examination, rectal examination, ultrasonography, CT examination, MRI examination, abdominal cavity that directly observes the abdominal cavity Mirror inspection etc. are adopted.
  • these diagnostic methods involve physical and mental pain for the patient, and the diagnosis itself is very laborious and costly. For this reason, there exists a problem that it is difficult to receive a diagnosis regularly, for example.
  • Patent Document 1 histamine releasing factor (HRF) has been reported by the present inventors (Patent Document 2 and Patent Document 3). Specifically, the present inventors have found that the expression level of HRF protein and the expression level of HRF mRNA correlate with endometriosis. Then, by measuring the amount of HRF protein or the expression level of HRF mRNA in the biological sample of the subject, it was possible to indirectly determine the presence or absence of endometriosis and its extent.
  • HRF histamine releasing factor
  • HRF derived from endometrial cells that shows a significant correlation with endometriosis, and includes endometrial cells.
  • biological samples such as menstrual blood
  • HRF endometrial cells
  • the reliability of the correlation between HRF and endometriosis is reduced. This is because the mRNA in the collected sample is degraded or denatured by the RNase contained in the sample during the period from collection of the sample to use for analysis. It is considered that this is because the measured value cannot be obtained.
  • aromatase is derived from endometrial cells that shows a significant correlation with endometriosis, and includes endometrial cells.
  • ⁇ -actin mRNA serving as an index, ie, HRF mRNA or aromatase mRNA.
  • ⁇ -actin mRNA is constitutively present in endometrial cells.
  • HRF mRNA and aromatase mRNA it is considered that it is degraded or denatured by RNase contained in the sample during the period from collection of the sample to use for analysis. Therefore, by detecting ⁇ -actin mRNA as a control, for example, it is possible to measure HRF mRNA and aromatase mRNA without the influence of degradation or denaturation by RNase as described above.
  • ⁇ -actin mRNA when ⁇ -actin mRNA was measured, the following problems were revealed.
  • the expression of mRNA is usually performed by synthesizing cDNA from mRNA by reverse transcription (RT) -polymerase chain reaction (PCR) method, amplifying the synthesized cDNA, and applying a probe for the target sequence to be detected to the obtained nucleic acid amplification product. Detection is performed by hybridization.
  • An object is to provide a detection method capable of detection.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting the expression of mRNA that is an indicator of endometriosis-related disease in a biological sample containing endometrial cells,
  • the indicator mRNA is at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA
  • the probe specific to ⁇ -actin mRNA is at least one of a probe capable of hybridizing within the region from 808 to 910 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a probe comprising a base sequence complementary to the probe. It is characterized by being.
  • the control detection probe of the present invention is a probe for detecting control mRNA used in the method for detecting the expression of indicator mRNA for endometriosis-related diseases of the present invention.
  • the 910th region at least one of a base sequence capable of hybridizing and a base sequence complementary thereto is included.
  • the production method of the present invention is a method for producing a nucleic acid amplification product used in the method for detecting the expression of indicator mRNA, wherein the detection method is the method for detecting the expression of indicator mRNA for endometriosis-related diseases according to the present invention.
  • the indicator mRNA is at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA;
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA;
  • the primer for synthesizing nucleic acid amplification of ⁇ -actin mRNA is at least one of a primer containing the following oligonucleotide (X1F) and a primer containing the following oligonucleotide (X1R).
  • X1F Oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • X1R Oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • the primer reagent of the present invention is a primer reagent used in the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention, It includes at least one of a primer containing the oligonucleotide (X1F) and a primer containing the oligonucleotide (X1R).
  • the detection reagent of the present invention comprises a probe specific for an indicator mRNA of endometriosis-related disease and a probe specific for a control mRNA,
  • the indicator mRNA is at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA;
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA;
  • the probe specific for ⁇ -actin mRNA is the control detection probe of the present invention.
  • control detection probe ⁇ -actin detection probe
  • HRF mRNA or aromatase mRNA that is an indicator mRNA and ⁇ - that is a control mRNA.
  • Actin mRNA can be detected with excellent reliability.
  • the present invention can detect both the indicator mRNA and the control mRNA in the same reaction system, the operation is simple, and the time and cost for detecting one specimen can be reduced.
  • the onset of endometriosis-related diseases can be indirectly diagnosed easily and accurately without much effort on the patient or doctor, such as laparoscopic examination. it can. For this reason, it can be said that the present invention is very useful, for example, in the clinical field.
  • FIG. 1 is a graph showing the ratio of expression levels of indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 1 (A) shows a group of non-endometriosis patients, dysmenorrhea patients
  • FIG. 5B is a graph showing the average of “HRF / ⁇ -actin” in the endometriosis patient group and “CYP19A1” in the non-endometriosis patient group, the dysmenorrhea patient group and the endometriosis patient group.
  • 3 is a graph showing the average of “/ ⁇ -actin”.
  • Example 2 shows the ratio “HRF / ⁇ -actin” of the expression levels of HRF mRNA and ⁇ -actin mRNA in the non-endometriosis patient group, dysmenorrhea patient group, and endometriosis patient group in Example 2 of the present invention. It is a graph which shows the average of.
  • the “endometriosis-related disease” includes, for example, in addition to so-called endometriosis, diseases associated with adenomyosis and endometriosis (for example, dysmenorrhea and infertility). .
  • the indicator mRNA for endometriosis-related diseases is HRF mRNA and aromatase mRNA as described above.
  • HRF mRNA and aromatase mRNA as described above.
  • HRF mRNA is expressed in various cells such as blood cells, lymphocytes, fibroblasts, and ovaries, for example.
  • the HRF mRNA targeted for detection by the present invention is HRF mRNA expressed in endometrial cells.
  • HRF mRNA is generally expressed in both stromal cells and glandular epithelial cells within the endometrium.
  • the nucleotide sequences of HRF gene cDNA and mRNA are described in, for example, GenBank, Accession No. It is registered with NM_003295. This sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • Aromatase is also called, for example, CYP19.
  • the aromatase mRNA is also referred to as CYP19 mRNA.
  • the aromatase mRNA is contained in various cells such as blood cells, stomach and ovary, and the aromatase mRNA targeted by the present invention is aromatase mRNA expressed in endometrial cells.
  • the aromatase mRNA is generally considered to be localized in layer IV basal cells (basal endometrial cells) among endometrial cells.
  • the nucleotide sequences of CYP19A1 cDNA and mRNA are described in, for example, GenBank accession no. It is registered with NM_031226. This sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA as described above.
  • the ⁇ -actin mRNA is mRNA that is constitutively expressed in endometrial cells and serves as a control for detecting the expression of indicator mRNA. That is, in the present invention, whether or not the mRNA expression function of the biological sample is normal can be confirmed by detecting the expression of ⁇ -actin mRNA. For this reason, as in the case of the indicator mRNA described above, the expression of ⁇ -actin mRNA as a control is detected, and for example, the detection result of the indicator mRNA is corrected using this detection result, so that the indicator mRNA can be more accurately detected. Detection (for example, measurement of expression level) can be performed.
  • the expression level of the indicator mRNA can be corrected by the expression level of the ⁇ -actin mRNA, for example, as will be described later, the ⁇ -actin mRNA can be said to be a correction mRNA for correction.
  • the base sequences of the ⁇ -actin cDNA and mRNA are described in, for example, GenBank in Accession No. Registered as X00351, J00074, M10278.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting the expression of mRNA that is an indicator of endometriosis-related disease in a biological sample containing endometrial cells, In the same reaction system, including the detection step of detecting the indicator mRNA and the control mRNA with a probe specific to each,
  • the indicator mRNA is at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA;
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA;
  • a probe specific to the ⁇ -actin mRNA probe for detecting ⁇ -actin
  • the biological sample may be a biological sample containing endometrial cells, and is not particularly limited. However, the present invention further includes cells other than endometrial cells, for example, in addition to endometrial cells. It can be applied to potential biological samples.
  • the biological sample include a blood sample such as menstrual blood, a sample from the endometrium (biopsy sample), a sample of an endometriotic lesion in the abdominal cavity, and particularly menstrual blood. preferable.
  • the menstrual blood sample can be collected easily, so that the mental and physical burden on the patient can be reduced and frequent measurement can be performed.
  • the biological sample to be measured may be collected from any organism, and examples thereof include humans and animals such as mammals excluding humans.
  • ⁇ -actin detection probe a probe specific to ⁇ -actin mRNA
  • control detection probe a probe specific to an indicator mRNA for endometriosis-related diseases
  • a probe specific to HRF mRNA is an “probe for HRF detection”
  • a probe specific to an aromatase mRNA is “ It is called a probe for detecting aromatase or a probe for detecting CYP19.
  • these probes may be any probe specific to mRNA.
  • a probe capable of directly detecting mRNA or indirectly detecting mRNA can be used. It may be a probe.
  • the former includes, for example, a probe that can hybridize to mRNA.
  • examples of the latter include probes that can hybridize to nucleic acid amplification products (eg, cDNA) using the mRNA as a template.
  • the former and the latter may be hybridizable to both the nucleic acid amplification product using the mRNA as a template and the mRNA, respectively.
  • the present invention is characterized in that, in detecting the indicator mRNA and the control mRNA in the same reaction system, the above-mentioned ⁇ -actin detection probe is used in the detection step.
  • the indicator mRNA for example, only one of HRF mRNA and aromatase mRNA may be detected in the same reaction system, but it is preferable to detect both.
  • An example of the reaction system is a reaction solution.
  • the detection of the indicator mRNA and the control mRNA in the same reaction system means, for example, that both the indicator mRNA and the control mRNA are detected using one reaction system.
  • the ⁇ -actin detection probe comprises, as described above, a probe capable of hybridizing within the 808th to 910th region in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the probe. It is a probe.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a cDNA sequence of ⁇ -actin, and as described above, for example, Gene Bank has accession no. Registered as X00351, J00074, M10278.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be a sequence in which “t” is replaced with “u”, and this sequence is the sequence of ⁇ -actin mRNA.
  • the former that is, the probe that can hybridize in the region from the 808th to the 910th in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, can be hybridized with, for example, the sense strand of ⁇ -actin cDNA.
  • a strand detection probe This may for example be hybridizable to ⁇ -actin mRNA.
  • the sense strand detection probe may have a sequence in which “t” is replaced with “u”. In this case, for example, since it can hybridize to ⁇ -actin mRNA, it can also be referred to as an mRNA detection probe, which can also hybridize to the sense strand, for example.
  • the latter that is, a probe having a base sequence complementary to the sense strand detection probe can be hybridized with, for example, the antisense strand of ⁇ -actin cDNA, and is also referred to as an antisense strand detection probe hereinafter.
  • the antisense strand detection probe may be a sequence in which “t” is replaced with “u”.
  • the ⁇ -actin detection probe for example, either one of the sense strand detection probe and the antisense strand detection probe may be used, or both may be used. .
  • ⁇ -actin detection is performed on a nucleic acid amplification product using mRNA as a template. When hybridizing the probe for use, either one may be used, but it is preferable to use both.
  • the “inside area” may be, for example, the entire 808th to 910th area, or a partial area in the 808th to 910th area.
  • the length of the probe is generally, for example, 10 to 100 bases (mer), preferably 10 to 40 bases, more preferably 15 to 40 bases, and further preferably 15 to 25 bases.
  • a base particularly preferably 15 to 20 bases.
  • the ⁇ -actin detection probe is preferably, for example, a probe capable of hybridizing to a partial region in the region and a probe comprising a base sequence complementary to the probe. The probe may hybridize to, for example, the entire region and its adjacent region, or the partial region and its adjacent region.
  • the length of the probe for detecting ⁇ -actin is not particularly limited, and examples thereof include the lengths described above. Specific examples include, for example, 15 to 35 bases, and preferably 18 to 30. A base, more preferably 20 to 28 bases.
  • the ⁇ -actin detection probe include, for example, a probe comprising the base sequence shown in any one of the following SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 19 to 23, or a probe comprising the base sequence.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a sequence complementary to the 829th to 853rd base sequences in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 below is the 808th to 828th base sequences in SEQ ID NO: 1.
  • the complementary sequence, the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 below, is the sequence complementary to the 829th to 849th base sequences in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 below is from the 850th in SEQ ID NO.
  • These probes are, for example, sense strand detection probes that can hybridize within the 808th to 910th regions in SEQ ID NO: 1. In the following arrangement, each “t” may be “u”.
  • Examples of the ⁇ -actin detection probe include a probe comprising the base sequence shown in any one of the following SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NOs: 14 to 18, or a probe comprising the above base sequence.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a sequence consisting of the 829th to 853rd base sequences in SEQ ID NO: 1
  • the base sequence shown in the following SEQ ID NO: 14 is consisting of the 808th to 828th base sequences in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 is a sequence consisting of the 829th to 849th nucleotide sequences in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 is the 850th to 870th nucleotide sequence in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 is a sequence consisting of the 871st to 891th base sequences in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 is the 892nd to 910th sequences in SEQ ID NO: 1.
  • each “t” may be “u”.
  • Antisense strand detection probe 5'-agccttccttcctgggcatggagtc-3 '(SEQ ID NO: 2) 5′-gctgccctgaggcactcttcc-3 ′ (SEQ ID NO: 14) 5′-agccttccttcctgggcatgg-3 ′ (SEQ ID NO: 15) 5′-agtcctgtggcatccacgaaa-3 ′ (SEQ ID NO: 16) 5′-ctaccttcaactccatcatga-3 ′ (SEQ ID NO: 17) 5′-agtgtgacgtggacatccg-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
  • the ⁇ -actin detection probe is, for example, a probe capable of hybridizing within a region containing 100 bases around the 808th to 910th positions (for example, the 708th to 1010th positions) in SEQ ID NO: 1 and complementary to the probe.
  • a probe having a simple base sequence may be used.
  • the ⁇ -actin detection probe is, for example, a probe capable of hybridizing within a region of about 100 bases including part or all of the 808th to 910th regions in SEQ ID NO: 1, and complementary to the probe.
  • a probe having a simple base sequence may be used.
  • Specific examples include, for example, 100 bases before and after the region to which at least one of the probes shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NOs: 19 to 23, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NOs: 14 to 18 hybridizes in SEQ ID NO: 1. It may be a probe that can hybridize to a region and a probe that consists of a base sequence complementary to the probe, and can hybridize within a region of about 100 bases including the region to which any of the probes hybridizes. A probe comprising a probe and a base sequence complementary to the probe may be used.
  • the constituent components of the ⁇ -actin detection probe are not particularly limited, and may be composed of general nucleotides such as deoxyribonucleotides and ribonucleotides.
  • nucleotides such as deoxyribonucleotides and ribonucleotides.
  • artificial nucleic acids modified nucleic acids, peptides such as PNA, etc.
  • Nucleic acids may be included.
  • examples of the index detection probe include an HRF detection probe and an aromatase detection probe as described above.
  • only one of the indicator detection probes may be used, but as described above, it is preferable to detect both HRF mRNA and aromatase mRNA in the same reaction system, It is preferred to use both an HRF detection probe and an aromatase detection probe.
  • the present invention is characterized by using the aforementioned ⁇ -actin detection probe, the index detection probe for detecting the index mRNA, that is, the HRF detection probe and the aromatase detection probe,
  • the indicator detection probe include a sense strand detection probe and an antisense strand detection probe, as in the above-described ⁇ -actin detection probe, and either one of them may be used, Both may be used.
  • the HRF detection probe and the aromatase detection probe are not particularly limited, but are preferably complementary to the sequence between the amplification primers, for example.
  • the HRF detection probe, the aromatase detection probe, and the ⁇ -actin detection probe preferably have sequences that do not interfere with each other. It is preferable that the HRF detection probe, the aromatase detection probe, and the ⁇ -actin detection probe have, for example, a sequence that does not form a dimer between the probes.
  • the HRF detection probe is not particularly limited.
  • a probe capable of hybridizing within the 94th to 612th region and complementary to the probe is used.
  • a probe consisting of a base sequence is preferred.
  • Specific examples of the HRF detection probe are shown below, but the present invention is not limited thereto.
  • Antisense strand detection probe 5'-cctcatcagccacgatgagatgttctcc-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Sense strand detection probe 5'-ggagaacatctcatcgtggctgatgagg-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • the aromatase probe is not particularly limited as described above.
  • a probe capable of hybridizing within the 252nd to 1762rd region and a base complementary to the probe A probe consisting of a sequence is preferred.
  • Specific examples of the aromatase detection probe are shown below, but the present invention is not limited thereto.
  • Antisense strand detection probe 5'-ctttgggccccgtggctgtgc-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Sense strand detection probe 5'-gcacagccacggggcccaaag-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • detection of the indicator mRNA and the control mRNA may be performed directly or indirectly using the various probes described above.
  • each mRNA can be directly detected by hybridizing each probe to each mRNA in a biological sample.
  • An example of such a method is Northern blotting.
  • a reaction system including the biological sample containing the indicator mRNA and the ⁇ -actin mRNA and the probes described above may be prepared.
  • MRNA can be detected.
  • methods include PCR methods such as reverse transcription-real time PCR method, RNase protection method, method using DNA chip or DNA array, and the like.
  • a reaction comprising a nucleic acid amplification product using the indicator mRNA in the biological sample as a template, a nucleic acid amplification product using ⁇ -actin mRNA in the biological sample as a template, and the probes described above.
  • the latter method using a nucleic acid amplification product is particularly preferable.
  • the “nucleic acid amplification product” is not particularly limited, but is, for example, a nucleic acid synthesized according to the base information of mRNA as a template, and generally includes cDNA.
  • the nucleic acid amplification product is, for example, either a nucleic acid having a base sequence complementary to mRNA (base sequence of the antisense strand) or a nucleic acid having the same base sequence (base sequence of the sense strand) as mRNA. However, it is preferable to include both.
  • the constituents of the nucleic acid amplification product are not particularly limited, and may be composed of general nucleotides such as deoxyribonucleotides and ribonucleotides. For example, artificial nucleic acids, modified nucleic acids, peptide nucleic acids such as PNA Etc. may be included.
  • the present invention further includes, for example, the indicator mRNA and ⁇ in the biological sample.
  • a synthesis step of synthesizing each nucleic acid amplification product using actin mRNA as a template may be included.
  • the nucleic acid amplification product using the indicator mRNA as a template and the nucleic acid amplification product using ⁇ -actin mRNA as a template may be synthesized, for example, and then mixed in the same reaction system. In the same reaction system, it is preferable to simultaneously synthesize nucleic acid amplification products using the indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA as templates. This makes the process even easier.
  • each nucleic acid amplification product is synthesized using the indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA as a template in the same reaction system in the presence of the indicator detection probe and the ⁇ -actin detection probe. May be.
  • the detection step can be continuously performed using the same reaction system without adding the various probes to the reaction system.
  • the synthesis step and the detection step may be performed separately as described above, or may be performed in parallel at the same time.
  • the detection step can be performed using the reaction system.
  • the synthesized various nucleic acid amplification products may be detected with specific probes.
  • each nucleic acid amplification product is synthesized using the indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA as a template in the same reaction system in the presence of the indicator detection probe and the ⁇ -actin detection probe. It is preferable to do.
  • the detection can be performed, for example, with time, and may be continuous or discontinuous (intermittent), and may be constant or inconstant.
  • the detection may be performed only at a detection start time and a predetermined end time, for example.
  • the nucleic acid amplification product synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include a method of synthesizing cDNA using mRNA as a template, and further amplifying a desired region in the cDNA using this cDNA as a template.
  • “synthesize nucleic acid amplification using mRNA as a template” includes, for example, synthesizing cDNA using mRNA as a template, and further amplifying a desired region using this cDNA as a template.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and includes PCR method, RT-PCR method, NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transcription-mediated amplification) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, etc. Of these, the PCR method and the RT-PCR method are preferable.
  • the nucleic acid amplification product can be synthesized, for example, using various primers.
  • cDNA is first synthesized from mRNA using a random primer, and a desired region may be amplified using various primers as a template.
  • a primer used for synthesis of a nucleic acid amplification product using ⁇ -actin mRNA as a template is referred to as “primer for ⁇ -actin”
  • a primer used for synthesis of a nucleic acid amplification product using index mRNA as a template is referred to as “index primer”
  • Primers used for synthesis of nucleic acid amplification products using HRF mRNA as a template are also referred to as “HRF primers”
  • primers used for synthesis of nucleic acid amplification products using aromatase mRNA as a template are also referred to as “aromatase primers” or “CYP19 primers”. .
  • sequences of these primers are not particularly limited, but are preferably designed so as to amplify a desired region containing a sequence capable of hybridizing with the aforementioned ⁇ -actin detection probe or indicator detection probe.
  • each of the primers for example, either a primer for amplifying a sense strand (forward primer) or a primer for amplifying an antisense strand (reverse primer) may be used, and both are preferably used in combination.
  • the primer conditions such as length, sequence, and the like, can be appropriately designed according to, for example, the various detection probes described above.
  • the various primers can be chemically synthesized using, for example, a general-purpose DNA synthesizer (for example, Applied Biosystems, product name: Model 394). Moreover, you may synthesize
  • the length of the primer is not particularly limited, but is, for example, 2 to 100 bases, preferably 2 to 60 bases.
  • the target region (amplification region) to be amplified by the ⁇ -actin primer is not particularly limited.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes a region capable of hybridizing with the ⁇ -actin detection probe. Is preferred.
  • the amplification region preferably includes, for example, the 808th to 910th regions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the 5 ′ end of the amplification region may be, for example, 5 ′ from the 808th position in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, about 50 to about 100 bases from the 808th position. You may shift to the side.
  • the 5 ′ end of the amplification region may be located, for example, at positions 708 to 808, 708 to 758, or 758 to 808 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the 3 ′ end of the amplification region may be, for example, 3 ′ from the 910th position in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, about 50 to about 100 bases from the 910th position. 'You may shift to the side.
  • the 3 ′ end of the amplification region may be located, for example, at the 910th to 1010th, 910th to 960th, or 960th to 1010th positions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the primer for ⁇ -actin can be appropriately determined according to, for example, such an amplification region.
  • examples of the ⁇ -actin primer include the 829th to 853rd positions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, And a primer that amplifies a region having a length of about 50 to 200 bases.
  • examples of the primer (forward primer) for amplifying the sense strand include a primer containing the following oligonucleotide (X1F) and a primer comprising the oligonucleotide.
  • primer (reverse primer) for amplifying the antisense strand examples include a primer containing the following oligonucleotide (X1R) and a primer comprising the oligonucleotide.
  • X1R oligonucleotide
  • primer set in which both are paired.
  • the base sequences of (X1F) and (X1R) are, for example, 1 or several in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the base sequence may be a substitution, deletion, insertion or addition.
  • the number of bases to be substituted, deleted, inserted or added is, for example, in the range of 1 to 5, preferably in the range of 1 to 3, more preferably 1 or 2, particularly preferably One.
  • the HRF primer is not particularly limited, and can be appropriately designed according to the HRF detection probe as described above.
  • examples of the primer (forward primer) for amplifying the sense strand include a primer containing the following oligonucleotide (Y1F) and a primer comprising the oligonucleotide.
  • examples of the primer (reverse primer) for amplifying the antisense strand include a primer containing the following oligonucleotide (Y1R) and a primer comprising the oligonucleotide.
  • Y1F oligonucleotide
  • Y1R oligonucleotide
  • a primer comprising the oligonucleotide a primer comprising the oligonucleotide.
  • either one of the forward primer and the reverse primer may be used, but it is preferable to use the primer set as a pair.
  • the various primers are only required to be able to amplify the target region.
  • the base sequences of the (Y1F) and (Y1R) are, for example, 1 or several in SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively.
  • the number of bases may be a base sequence substituted, deleted, inserted or added.
  • the number of bases to be substituted, deleted, inserted or added is, for example, in the range of 1 to 5, preferably in the range of 1 to 3, more preferably 1 or 2, particularly preferably One.
  • the target amplification region to be amplified with the HRF primer is not particularly limited. For example, the entire HRF coding region or a part thereof may be used.
  • the aromatase primer is not particularly limited, and can be appropriately designed according to the aromatase detection probe as described above.
  • examples of the primer (forward primer) for amplifying the sense strand include a primer containing the following oligonucleotide (Z1F) and a primer comprising the oligonucleotide.
  • examples of the primer (reverse primer) for amplifying the antisense strand include a primer containing the following oligonucleotide (Z1R) and a primer comprising the oligonucleotide.
  • either one of the forward primer and the reverse primer may be used, but it is preferable to use the primer set as a pair.
  • the base sequences of (Z1F) and (Z1R) are, for example, 1 or several bases in SEQ ID NOS: 12 and 13, respectively. May be a base sequence substituted, deleted, inserted or added.
  • the number of bases to be substituted, deleted, inserted or added is, for example, in the range of 1 to 5, preferably in the range of 1 to 3, more preferably 1 or 2, particularly preferably One.
  • the target amplification region to be amplified with the aromatase primer is not particularly limited. For example, the entire aromatase coding region or a part thereof may be used.
  • HRF mRNA and aromatase mRNA that are indicator mRNAs and ⁇ -actin mRNA that is a control mRNA are obtained by RT-PCR using a menstrual blood sample and the same reaction solution.
  • a method of synthesizing each nucleic acid amplification product as a template and detecting each nucleic acid amplification product using various probes by real-time PCR will be described.
  • the present invention is not limited to this, and the indicator mRNA to be detected may be either one of HRF mRNA and aromatase mRNA.
  • menstrual blood is collected as a sample containing endometrial cells.
  • Menstrual blood is generally a red blood cell-containing body fluid that can be recovered by vaginal bleeding during menstruation.
  • the method for collecting menstrual blood is not particularly limited.
  • the menstrual blood may be collected directly from the vaginal vault, or may be collected using an absorbent such as gauze, sanitary napkin, or tampon.
  • Each nucleic acid amplification product is synthesized in the same reaction system using HRF mRNA, aromatase mRNA and ⁇ -actin mRNA in the menstrual blood sample as templates.
  • Various processing conditions and the like in the synthesis of the nucleic acid amplification product are not limited at all.
  • RNA extraction method is not particularly limited, and conventionally known methods such as guanidine-isothiocyanate and phenol / chloroform extraction can be employed, and a commercially available RNA extraction reagent may be used.
  • primer reverse transcriptase, dNTP, etc.
  • complementary cDNA (1st strand cDNA) is synthesized by reverse transcription reaction (RT reaction) using mRNA contained in the extracted total RNA as a template.
  • the primer is not particularly limited, and examples thereof include a random primer and an oligo dT primer. Those skilled in the art can design primer conditions such as length, sequence and the like based on common general technical knowledge, and commercially available primers can also be used.
  • This reverse transcription reaction is usually performed prior to PCR.
  • PCR can be performed by further adding the components of the PCR reaction solution to the reaction solution.
  • a necessary reagent can be added in one reaction system, and reverse transcription reaction and PCR can be performed continuously (so-called one-step). RT-PCR method).
  • PCR is performed using the synthesized cDNA (1st strand cDNA) as a template.
  • PCR can be performed using, for example, the aforementioned HRF primer, aromatase primer and ⁇ -actin primer, polymerase, dNTP and the like.
  • cDNA complementary to the target region in the 1st strand cDNA (2nd strand cDNA) is amplified.
  • a cDNA amplification product of the target region can be obtained for HRF mRNA, aromatase mRNA and ⁇ -actin mRNA.
  • a primer set including a forward primer and a reverse primer double-stranded cDNA of the target region can be obtained as a nucleic acid amplification product.
  • the amount of HRF cDNA, aromatase cDNA, and ⁇ -actin cDNA is detected by detecting each nucleic acid amplification product obtained using each detection probe and counting the number of cycles when the nucleic acid amplification product reaches a certain amount.
  • the real-time PCR method is usually a method of monitoring the production process of nucleic acid amplification products over time in PCR, and PCR and detection of nucleic acid amplification products are performed in parallel.
  • the probe for detecting ⁇ -actin is as described above.
  • the HRF detection probe and the aromatase detection probe are not particularly limited, and examples thereof include the probes described above.
  • the method for detecting the nucleic acid amplification product is not particularly limited, and examples thereof include a conventionally known method using fluorescence intensity measurement. Examples of such a method include a conventionally known TaqMan (trademark) probe method, a hybridization method, and a cycling probe method. In addition, the fluorescent substance, quencher, etc. which are used for these various methods are not restrict
  • the TaqMan (trademark) probe method is a method using a probe (oligonucleotide: for example, about 20 to 30 mer) having a partial sequence complementary to a PCR template and having a fluorescent substance and a quencher.
  • the probe include those in which the ends of oligonucleotides that specifically anneal to the target sequence of the template are labeled with a fluorescent substance (5 'end) and a quencher (3' end), respectively.
  • the probe is added to a PCR reaction solution in advance, and the reaction solution (fluorescent substance in the reaction solution) is irradiated with excitation light to generate fluorescence generated from the fluorescent material. Can be measured. This method is based on the following principle.
  • the probe when the probe is only annealed to the template, the fluorescence of the fluorescent substance is suppressed by the quencher even when irradiated with excitation light.
  • the DNA polymerase 5 ′ when DNA elongation occurs in the elongation step, the DNA polymerase 5 ′ ⁇
  • the principle is that the probe is decomposed by the 3 ′ exonuclease activity, and the fluorescent substance emits fluorescence when it leaves the quencher.
  • the hybridization method is a method using two adjacent probes (oligonucleotides) which are partial sequences complementary to a PCR template.
  • the two types of probes for example, a probe annealed to the 3 ′ side of the template and labeled with an acceptor fluorescent substance at the 3 ′ end, and annealed to the 5 ′ side of the template, and the 5 ′ end to donor fluorescence
  • a combination with a probe labeled with a substance can be exemplified.
  • the two types of probes are added to a PCR reaction solution in advance, and the reaction solution (acceptor fluorescent substance in the reaction solution) is irradiated with excitation light, so that the acceptor fluorescence is emitted.
  • the cycling probe method is a sequence complementary to a PCR template, the ends are labeled with a fluorescent substance (5 ′ end) and a quencher (3 ′ end), respectively, and only the center is an RNA sequence (ribosome).
  • This method uses a probe having a nucleotide sequence.
  • the probe and RNase H are added to the PCR reaction solution in advance, and the reaction solution (fluorescent substance in the reaction solution) is irradiated with excitation light. What is necessary is just to measure the emitted fluorescence. This method is based on the following principle.
  • the fluorescence of the fluorescent substance is suppressed by the quencher even when irradiated with excitation light only by annealing the probe to the template, but the RNA portion forming the chimera duplex is RNaseH. Is cleaved by RNaseH because the fluorescent substance at both ends is separated from the quencher and thus emits fluorescence. If there is a mismatch in the RNA region, the cleavage by RNaseH does not occur.
  • each of the detection probes since at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA, which are indicator mRNAs, and ⁇ -actin mRNA are detected in the same reaction system, each of the detection probes has detection conditions such as excitation as described above. It is preferable to use fluorescent materials having different wavelengths and / or measurement wavelengths. As a result, even when nucleic acid amplification products are synthesized simultaneously in the same reaction system, each detection can be performed by the excitation wavelength and / or measurement wavelength.
  • Fluorescence intensity can be detected, for example, with a fluorometer.
  • a fluorometer In general, an apparatus including both a PCR reaction unit (for example, a thermal cycler) and an optical system unit (for example, a fluorometer) is used, and a commercially available Smart Cycler (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.), a light cycler. (Trade name, manufactured by Roche Diagnostics), ABI PRISM 7000 (trade name, manufactured by Applied Biosystems) and the like.
  • the detection conditions for the fluorescence intensity are not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of fluorescent substance in each detection probe, for example.
  • nucleic acid amplification product can be quantified.
  • an amplification curve in which the fluorescence intensity for each cycle is plotted is usually created, and the number of cycles (Ct value: Threshold Cycle) at which the nucleic acid amplification product becomes a set value (threshold value: for example, the amount at which amplification stops). ).
  • Ct value Threshold Cycle
  • threshold value for example, the amount at which amplification stops.
  • nucleic acid amplification products can be quantified.
  • the ⁇ -actin detection probe as described above is used, for example, the ⁇ -actin detection probe hybridizes to a nucleic acid amplification product of HRF mRNA and a nucleic acid amplification product of aromatase mRNA. Problems can be prevented. Therefore, it is possible to detect the indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA with high reliability.
  • the present invention further includes the expression level of the indicator mRNA derived from endometrial cells in the biological sample from the detection result of the indicator mRNA and the detection result of ⁇ -actin mRNA in the detection step.
  • the expression level serves as a control (evaluation standard) when detecting the expression of the target mRNA (index mRNA). Therefore, by comparing the detection result of the indicator mRNA and the detection result of ⁇ -actin mRNA in the detection step, it is possible to determine the expression level of the indicator mRNA derived from endometrial cells in the biological sample. is there.
  • the determination step may further include, for example, a correction value determination step for determining a correction value for the indicator mRNA.
  • this correction value determination step for example, the ratio of the detection result of the indicator mRNA to the detection result of ⁇ -actin mRNA obtained in the detection step is calculated, and this is used as the correction value of the indicator mRNA.
  • This correction value means, for example, the expression level of the indicator mRNA derived from endometrial cells in the biological sample.
  • the menstrual blood sample contains RNase as described above. For this reason, for example, as described above, mRNA in the collected sample is degraded or denatured by the RNase between the collection of the sample and use for analysis. It is difficult to obtain the measured value.
  • the value obtained in the correction value determining step is the correction of the indicator mRNA expression amount excluding the effects of degradation or denaturation by RNase as described above. Value. Therefore, for example, by using the indicator mRNA correction value calculated by the correction value determination step instead of the indicator mRNA expression amount detected in the detection step as an alternative value indicating the endometrial cell-derived indicator mRNA expression amount. As will be described later, it becomes possible to determine an endometriosis-related disease with higher accuracy than before.
  • the detection results of ⁇ -actin mRNA and indicator mRNA are values indicating the expression levels of indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA in biological samples, for example.
  • the value indicating the expression level may be, for example, a measurement value itself obtained from a measuring instrument, a fluorescence intensity, or an amount of mRNA (eg, weight, mass, concentration, etc.) obtained from the measurement value or fluorescence intensity. ).
  • the ratio of the HRF mRNA expression level (Y) to the ⁇ -actin mRNA expression level (X) is not particularly limited, and is expressed by, for example, X: Y, X / Y, Y / X, and their 100 fractions (%). be able to.
  • the ratio of the aromatase mRNA expression level (Z) to the ⁇ -actin mRNA expression level (X) is not limited, and is expressed by, for example, X: Z, X / Z, Z / X, and their 100 fractions (%). be able to.
  • the present invention may further include a step of comparing the correction value of the indicator mRNA derived from endometrial cells for each biological sample.
  • the index mRNA correction value is a value excluding the influence of degradation or denaturation by RNase as described above. For this reason, for example, a specific patient is relatively compared with time-dependent changes in the index mRNA derived from endometrial cells, or the index mRNA derived from endometrial cells between different patients is relatively compared. It becomes possible.
  • ⁇ Diagnosis method for endometriosis-related diseases By detecting the expression of an indicator mRNA for endometriosis-related diseases by the detection method of the present invention, for example, by the following method, the presence or absence of endometriosis-related disease, its degree, risk or treatment result can be determined. It is possible to judge.
  • Examples of the method for diagnosing endometriosis-related diseases of the present invention include methods including the following steps (1) to (3).
  • a step of detecting index mRNA and ⁇ -actin mRNA in a biological sample containing endometrial cells of a subject by the method for detecting expression of index mRNA of endometriosis-related disease of the present invention (2) Step (3) of calculating a ratio (index mRNA correction value) of the detection result of the indicator mRNA to the detection result of ⁇ -actin mRNA from the detection result of the indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA obtained in the step (1)
  • the reference value is at least one of the ratio of the expression level of the indicator mRNA to the
  • endometriosis-related disease refers to diseases caused by endometriosis, such as dysmenorrhea, infertility, adenomyosis, etc. in addition to so-called endometriosis as described above. (Related diseases).
  • the term “healthy person” means that the subject is healthy with respect to endometriosis-related diseases, and does not mean that other diseases are healthy.
  • the steps (1) and (2) can be performed in the same manner as the detection method of the present invention described above.
  • the ratio of the index mRNA expression level to the ⁇ -actin mRNA expression level for patients with endometriosis-related diseases and healthy subjects is, for example, the detection method of the present invention in the same manner as described above. Can be measured.
  • the indicator mRNA may be either one of HRF mRNA or aromatase mRNA, or both, as described above.
  • the step (3) by comparing the reference value and the index mRNA correction value calculated in the step (2), it is possible to determine whether or not the subject has developed an endometriosis-related disease. it can.
  • the step (3) is a step of determining whether or not the subject has developed an endometriosis-related disease by comparing the reference value with the index mRNA correction value calculated in the step (2). Also good.
  • step (3) Next, an example of the step (3) will be described. Note that the present invention is not limited to this.
  • the presence / absence of endometriosis-related disease in the subject can be determined, for example, as follows.
  • at least one of an index mRNA correction value in a biological sample of a patient with endometriosis-related disease (hereinafter referred to as “patient”) and an index mRNA correction value in a biological sample of a healthy person in advance. prepare.
  • These correction values can be determined by the detection method of the present invention as described above.
  • reference value can be determined each time by the detection method of the present invention, but it is preferable to use a previously determined index mRNA correction value as the reference value.
  • Examples of the determination method using HRF mRNA correction values are shown below, but the present invention is not limited thereto.
  • the following judgment exemplifies a case where the ratio of the HRF mRNA expression level (Y) to the ⁇ -actin mRNA expression level (X) is expressed by Y / X or its 100 fraction (%).
  • the HRF mRNA correction value of the subject shows a high value compared with the “normal reference value”, particularly when the subject shows a significantly high value, for example, the subject develops an endometriosis-related disease. It is possible to determine that the person has a high risk of developing or is at high risk (high risk of developing).
  • the HRF mRNA correction value of the subject is equal to or less than the “reference value for healthy subjects”, for example, the subject is a healthy subject, has a low possibility of developing, or has a low risk of developing I can judge.
  • the “significantly high value” is not particularly limited, but means that the HRF mRNA correction value of the subject is, for example, 10% or more higher than the reference value of a healthy person, preferably 30% or more, Preferably it is 70% or more, Most preferably, it is 100% or more.
  • the HRF mRNA correction value of the subject is relatively higher than the “normal reference value (particularly the upper limit value)”, for example, it is more likely that the subject has developed.
  • the reference value in the biological sample of the healthy subject is, for example, 1 or less, preferably 0.8 or less when expressed by the ratio (Y / X) of the HRF mRNA expression level and ⁇ -actin mRNA expression level (X). More preferably, it is 0.5 or less.
  • the HRF mRNA correction value of the subject overlaps with the “patient reference value”, for example, the subject has developed an endometriosis-related disease.
  • the HRF mRNA correction value of the subject shows a low value compared to the “patient reference value”, especially when the value is significantly low
  • the “significantly lower value” is not particularly limited, but means that the HRF mRNA correction value of the subject is, for example, 20% or less, preferably 10% or less with respect to the “patient reference value”.
  • the HRF mRNA correction value of the subject is relatively higher than the “patient reference value (especially lower limit value)”, for example, the risk of relative onset is relatively high It can be determined that the symptoms are relatively high and the symptoms are relatively severe.
  • the lower the relative risk for example, the lower the possibility of developing relatively, or the lower the risk of developing relatively Judgment can be made.
  • the reference value in the patient biological sample is, for example, 2 or more, preferably 1 or more, more preferably 0.3 or more.
  • Still other determination methods include, for example, a determination method based on a branch point between the patient reference value and the healthy subject reference value. According to this method, when the HRF mRNA correction value of the subject is higher than the bifurcation point, for example, the endometriosis-related disease is developed, the possibility of developing is high, and the risk of developing It is possible to determine that the symptom is higher, and it is possible to determine that the symptom is relatively heavier, for example, as it is relatively higher than the bifurcation.
  • the HRF mRNA correction value of the subject is lower than the branch point, for example, it can be determined that the subject is a healthy person, has a low possibility of developing, or has a low risk of developing, and the branch It can be determined that the lower the score is, for example, the lower the possibility of developing relatively, or the lower the risk of developing.
  • the HRF mRNA correction value is represented by the ratio (Y / X) of the HRF mRNA expression level (Y) and ⁇ -actin mRNA expression level
  • the branch point (reference value) is, for example, 0.3 to 3, preferably Is 0.5-2.
  • This branching point is set, for example, as a boundary point between an onset group (patient group) and a non-onset group (healthy person group), so that the subject can be It can also be determined whether it belongs to. Furthermore, for example, it is possible to make a more detailed judgment about a disease by considering the state of a biological sample provider (patient / healthy person) used for determining the reference value. That is, the biological sample provider is classified by, for example, not only the presence or absence of onset, but also, for example, the degree of symptoms, the high risk of developing in the future (preliminary onset), the low possibility of developing in the future, etc. Each HRF correction value (reference value) is determined.
  • each reference value of the plurality of classified groups with the HRF correction value of the subject, not only the presence or absence of onset, for example, the severity of symptoms, high risk of onset, It is possible to judge in more detail also about the low possibility.
  • the determination may be made in reverse. That is, for example, when the index mRNA correction value of the subject shows a low value compared to the “reference value of healthy subjects”, particularly when it shows a significantly low value, for example, the subject has endometriosis-related diseases.
  • the subject has an onset, is likely to be onset, or can be determined to be a high-risk person, and the subject's index mRNA correction value is greater than or equal to the “normal reference value for healthy subjects”, the subject It can be determined that the subject is healthy, has a low possibility of developing, or has a low risk of developing.
  • this invention is not restrict
  • the risk of developing endometriosis-related diseases can be determined by the following method. .
  • Examples of the method for determining the risk of developing an endometriosis-related disease according to the present invention include a method including the following steps (1 ′) to (3 ′).
  • (1 ′) a step of detecting index mRNA and ⁇ -actin mRNA in a biological sample containing endometrial cells of a subject by the method for detecting expression of index mRNA of endometriosis-related disease of the present invention
  • (2 ') A step of calculating a ratio (index mRNA correction value) of the detection result of the indicator mRNA to the detection result of ⁇ -actin mRNA from the detection result of the indicator mRNA and ⁇ -actin mRNA obtained in the step (1').
  • the reference value is at least one of the ratio of the expression level of the indicator mRNA to the expression level of the mRNA (index mRNA correction value)
  • the step (3 ′) by comparing the reference value with the correction value of the subject, whether or not the subject has a risk of developing endometriosis-related disease, the risk It is possible to determine the height, the low risk, etc.
  • the step (3 ′) determines the risk of developing endometriosis-related disease in the subject by comparing the reference value and the index mRNA correction value calculated in the step (2 ′). It may be a process.
  • the steps (1 ′) to (3 ′) correspond to the steps (1) to (3) in the diagnostic method, respectively, and are determined in the same manner as described above except that the risk of onset is determined. it can.
  • the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention is a method for producing a nucleic acid amplification product used in a method for detecting the expression of indicator mRNA, wherein the detection method comprises the expression of the indicator mRNA for the endometriosis-related disease of the present invention.
  • the method comprising the step of synthesizing a nucleic acid amplification product using a marker mRNA and a control mRNA as templates using primers in the same reaction system, wherein the marker mRNA is at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA.
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA
  • the primer for synthesizing nucleic acid amplification of the ⁇ -actin mRNA includes a primer containing the oligonucleotide (X1F) and the oligonucleotide (X1R) It is characterized by being at least one of the primers.
  • the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention can be carried out in the same manner as the synthesis step described above in the detection method of the present invention.
  • the primer to be used is the same as that described above, for example.
  • the primer reagent of the present invention is a primer reagent used in the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention, and includes a primer containing the oligonucleotide (X1F) and a primer containing the following oligonucleotide (X1R). It is characterized by including at least one of these. If the primer reagent of this invention is used, the manufacturing method and detection method of this invention can be performed more simply, for example.
  • the primers are the ⁇ -actin primers, and specific examples are as described above.
  • the primer reagent of the present invention may contain, for example, either the forward primer or the reverse primer described above as the primer for ⁇ -actin, but preferably contains a primer set in which both are paired.
  • the primer reagent of the present invention may further contain at least one of the HRF primer and the aromatase primer, for example.
  • the HRF primer and the aromatase primer are not particularly limited, and specific examples are as described above.
  • the primer reagent of the present invention may include any one of the aforementioned forward primer and reverse primer as the HRF primer, but preferably includes a primer set in which both are paired.
  • the primer reagent of the present invention may contain any one of the aforementioned forward primer and reverse primer as the aromatase primer, but preferably contains a primer set in which both are paired.
  • the detection reagent of the present invention includes a probe specific to an indicator mRNA for endometriosis-related diseases and a probe specific to a control mRNA, and the indicator mRNA is at least one of HRF mRNA and aromatase mRNA.
  • the control mRNA is ⁇ -actin mRNA
  • the probe specific for ⁇ -actin mRNA is the control detection probe of the present invention.
  • the detection reagent of the present invention may contain the control detection probe of the present invention ( ⁇ -actin detection probe) for detection of ⁇ -actin mRNA, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the HRF detection probe and the aromatase detection probe are not particularly limited.
  • the detection probes described above can be used.
  • the detection reagent of the present invention may further include, for example, a reagent used for synthesis of a nucleic acid amplification product.
  • a reagent used for synthesis of a nucleic acid amplification product As described above, ⁇ -actin primer, HRF primer, aromatase primer, dNTP, polymerase, etc. May be included.
  • the detection reagent of the present invention may be a detection kit, and in this case, for example, an instruction manual may be included.
  • the detection reagent of the present invention can be used, for example, as a diagnostic reagent or diagnostic kit for endometriosis-related diseases.
  • the reference value of the healthy group for example, the reference value of the patient group of endometriosis-related disease, the reference value of the patient group grouped by the severity of endometriosis-related disease, etc. as information It is preferable that it is attached.
  • ⁇ -actin mRNA amplified with the following primers is ⁇ -actin mRNA expressed in endometrial cells (for example, epithelial cells) (GenBank / X00351; J00074; M10278).
  • Probe for detecting ⁇ -actin 5′-CF560-agccttccttcctgggcatggagtc-BHQ1-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
  • Probe for HRF detection 5'-FAM-cctcatcagccacgatgagatgttctcc-BHQ1-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • CYP19A1 detection probe 5'-Quasar 670-ctttgggccccgtggctgtgc-BHQ2-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Probe label CF560 CAL Fluor Orange 560 (registered trademark) BHQ: Black Hole Quencher (registered trademark) Quasar 670: registered trademark
  • PCR was carried out using a commercially available apparatus STRATAGENE Mx3005P Real-Time PCR System (registered trademark) (manufactured by STRATAGENE). The PCR was carried out at 95 ° C. for 10 minutes for 1 cycle, followed by 50 cycles of 95 ° C. for 30 seconds and 60 ° C. for 60 seconds.
  • the obtained PCR amplification product was detected with a fluorescent dye bound to the 5 'end of each probe.
  • the detection wavelength was set based on the instructions for each fluorescent dye.
  • the commercially available software (STRATAGENE (registered trademark) MxPro (trademark) Software) manufactured by STRATAGENE, the obtained measurement data is corrected with the reference ROX data, and the threshold value (threshold value) is automatically set. It was determined.
  • the expression level of the target mRNA (HRF mRNA, CYP19A1 mRNA and ⁇ -actin mRNA) in each PCR amplification product was measured.
  • HRF mRNA / ⁇ -actin mRNA The obtained measured value of HRF mRNA expression level and the measured value of CYP19A1 mRNA expression level were divided by the measured value of ⁇ -actin mRNA expression level to obtain “HRF mRNA / ⁇ -actin mRNA” (hereinafter referred to as HRF / ⁇ -actin) and “ “CYP19A1 mRNA / ⁇ -actin mRNA” (hereinafter, CYP19A1 / ⁇ -actin) was calculated.
  • HRF / ⁇ -actin mRNA HRF / ⁇ -actin
  • CYP19A1 mRNA / ⁇ -actin mRNA CYP19A1 / ⁇ -actin
  • (A) is a graph showing the average of “HRF / ⁇ -actin” in the non-endometriosis patient group, the dysmenorrhea patient group and the endometriosis patient group
  • (B) in FIG. It is a graph which shows the average of "CYP19A1 / ⁇ -actin" in a patient with a membranous patient group, a patient with dysmenorrhea and a patient group with endometriosis.
  • the P value of the dysmenorrhea group for the non-endometriosis group is 0.012, and the P value of the endometriosis group for the non-endometriosis group The value was 0.035.
  • the P value of the dysmenorrhea group for the non-endometriosis group is 0.69, and the endometriosis group for the non-endometriosis group The P value of was 0.45.
  • the ratio of HRF mRNA serving as an index to ⁇ -actin mRNA serving as a control is obtained, so that even a biological sample containing cells other than endometrial cells can be more accurately detected than in the prior art. It is now possible to determine whether the patient is a symptomatic group, a dysmenorrhea group or an endometriosis group.
  • HRF mRNA and aromatase mRNA which are indicator mRNAs and ⁇ -actin mRNA which is a control mRNA can be obtained even in the same reaction system. , Each can be detected with excellent reliability.
  • both the indicator mRNA and the control mRNA can be detected in the same reaction system, the operation is simplified, and the time and cost for detecting one specimen can be reduced.
  • the onset of endometriosis-related diseases can be indirectly diagnosed easily and accurately without much effort on the patient or doctor, such as laparoscopic examination. it can. For this reason, it can be said that the present invention is very useful, for example, in the clinical field.

Abstract

　同一反応系において、子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡを検出する場合でも、優れた信頼性で両者を検出できる検出方法を提供する。子宮内膜細胞を含有する生体試料について、前記指標ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物と、前記生体試料のβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物とを含む反応系を調製する。そして、この反応系を用いて、同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡの核酸増幅物と、前記β－アクチンｍＲＮＡの核酸増幅物とを、それぞれに特異的なプローブによって検出する。前記β－アクチンｍＲＮＡの核酸増幅物を検出するプローブとして、配列番号１における８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブまたはその相補的配列からなるプローブを使用する。このように、指標ｍＲＮＡにあわせてβ－アクチンｍＲＮＡを検出することで、前記指標ｍＲＮＡを優れた信頼性で検出可能となる。

Description

子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法およびそれに用いるプローブ
　本発明は、子宮内膜症関連疾患の指標となるｍＲＮＡの発現を検出する方法、および、それに用いるプローブに関し、詳細には、子宮内膜症関連疾患の指標であるヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）ｍＲＮＡまたはアロマターゼｍＲＮＡの発現の検出方法に関する。
　子宮内膜症とは、本来、子宮内腔のみに存在する子宮内膜組織またはそれに類似する組織が、子宮内腔以外の部位（子宮外部位）で発生・増殖する疾患である。発生し易い部位は、一般に、骨盤に囲まれている下腹部内部であり、特に、卵巣、ダクラス窩、Ｓ状結腸、直腸、仙骨子宮靱帯、腟、外陰部、膀胱、腹壁、へそ等において顕著である。このような子宮外部位に発生した子宮内膜組織も、子宮内腔と同様に、剥離し出血するが、子宮外部位においては、通常の月経のように、血液および剥離した子宮内膜組織が排出されず、体内に留まってしまう。このため、周辺組織との癒着が生じたり、チョコレート嚢胞が形成され、結果的に、月経痛、過多月経、不正出血、性交疼痛症、月経時の腹痛、腰痛および骨盤痛、月経時の血尿等の症状を示すようになる。また、子宮内膜症の進行は、不妊と関係することも指摘されている。
　子宮内膜症の診断方法としては、年齢や症状等にもよるが、一般的に、内診の他に、直腸診、超音波断層法検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、腹腔内を直接観察する腹腔鏡検査等が採用されている。しかしながら、これらの診断方法は、患者にとって肉体的および精神的な苦痛を伴うものであり、また、診断自体に非常に手間やコストがかかってしまう。このため、例えば、定期的に診断を受けることが困難という問題がある。
　そこで、近年、子宮内膜症に特異的なタンパク質や遺伝子を指標として検出することによって、容易に診断を行う方法の確立が試みられている（特許文献１）。このような指標として、ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）が本発明者らによって報告されている（特許文献２および特許文献３）。具体的には、ＨＲＦタンパク質の発現量およびＨＲＦｍＲＮＡの発現量が、子宮内膜症と相関関係を示すことを見出した。そして、被検体の生体試料におけるＨＲＦタンパク質の量またはＨＲＦｍＲＮＡの発現量を測定することにより、子宮内膜症の発症の有無、および、その程度を、間接的に判断することを可能とした。この方法によれば、例えば、腹腔鏡検査等のように腹部に数個の穴を開けたりすることなく、容易に子宮内膜症を診断することが可能である。また、この他に、アロマターゼも子宮内膜症と相関関係を示すことが報告されている（特許文献１）。
特開２００３－２０７５０９号公報 ＷＯ２００５／００５９８３号国際公開パンフレット 特開２００５－４９３４３号公報
　しかしながら、本発明者らがさらに検討を重ねた結果、子宮内膜症との間で顕著な相関性を示すのは、子宮内膜細胞由来のＨＲＦであること、また、子宮内膜細胞を含む月経血等の生体試料の場合、ＨＲＦと子宮内膜症との相関性に関する信頼性が低下することを見出した。これは、試料を採取してから分析に供するまでの間に、採取した前記試料中のｍＲＮＡが、前記試料に含まれるＲＮａｓｅによって分解されたり、変性するため、子宮内膜細胞由来のＨＲＦの真の測定値を得ることができないことに起因すると考えられる。これは、アロマターゼに関しても同様である。
　そこで、指標となるｍＲＮＡ、すなわち、ＨＲＦｍＲＮＡまたはアロマターゼｍＲＮＡの検出とあわせて、β－アクチンｍＲＮＡを検出する方法を見出した。β－アクチンｍＲＮＡは、子宮内膜細胞に恒常的に存在する。そして、前述のＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡと同様に、試料の採取から分析に供するまでの間に、前記試料に含まれるＲＮａｓｅによって分解されたり、変性すると考えられる。このため、β－アクチンｍＲＮＡをコントロールとして検出することで、例えば、前述のような、ＲＮａｓｅによる分解や変性の影響を除いて、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡを測定することが可能となる。しかしながら、β－アクチンｍＲＮＡを測定する場合、以下の問題が明らかとなった。ｍＲＮＡの発現は、通常、逆転写（ＲＴ）－ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法により、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを増幅させ、得られた核酸増幅物に、検出目的配列に対するプローブをハイブリダイズさせることで検出が行われる。しかしながら、１つの反応系において、ＨＲＦｍＲＮＡまたはアロマターゼｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅と、β－アクチンｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅とを行い、さらに、それぞれに特異的なプローブによって検出を行うと、β-アクチンｍＲＮＡを検出するためのプローブが、ＨＲＦｍＲＮＡまたはアロマターゼｍＲＮＡからの核酸増幅物にもハイブリダイズするため、検出精度が低下するという問題が明らかとなった。
　そこで、本発明は、子宮内膜症関連疾患の指標となるｍＲＮＡの発現を検出するにあたって、同一反応系において、あわせてコントロールのβ－アクチンｍＲＮＡを検出する場合でも、優れた信頼性で両者を検出できる検出方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の検出方法は、子宮内膜細胞を含有する生体試料における、子宮内膜症関連疾患の指標となるｍＲＮＡの発現を検出する方法であって、
同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡとを、それぞれに特異的なプローブにより検出する検出工程を含み、
前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号１に示す塩基配列において８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブの少なくも一方であることを特徴とする。
　本発明のコントロール検出用プローブは、本発明の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法に用いるコントロールｍＲＮＡを検出するためのプローブであり、配列番号１に示す塩基配列における８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能な塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むことを特徴とする。
　本発明の製造方法は、指標ｍＲＮＡの発現の検出方法に用いる核酸増幅物の製造方法であって、前記検出方法が、前記本発明の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法であり、
同一反応系内で、プライマーを用いて、指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡをそれぞれ鋳型とする核酸増幅物を合成する工程を含み、
前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
前記β－アクチンｍＲＮＡの核酸増幅を合成するためのプライマーが、下記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方であることを特徴とする。
（Ｘ１Ｆ）配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｘ１Ｒ）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　本発明のプライマー試薬は、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するプライマー試薬であって、
前記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を含むことを特徴とする。
　本発明の検出試薬は、子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡに特異的なプローブおよびコントロールｍＲＮＡに特異的なプローブを含み、
前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、本発明のコントロール検出用プローブであることを特徴とする。
　本発明によれば、前述の本発明のコントロール検出用プローブ（β－アクチン検出用プローブ）を使用することによって、同一反応系においても、指標ｍＲＮＡであるＨＲＦｍＲＮＡまたはアロマターゼｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡであるβ－アクチンｍＲＮＡとを、それぞれ優れた信頼性で検出できる。このように、本発明は、同一反応系において、前記指標ｍＲＮＡおよび前記コントロールｍＲＮＡの両方を検出できるため、操作が簡便であり、一検体の検出にかかる時間やコストを低減できる。また、このような方法によれば、例えば、腹腔鏡検査等のように、患者・医師に多大な労力をかけることなく、容易且つ正確に、子宮内膜症関連疾患の発症を間接的に診断できる。このため、本発明は、例えば、臨床分野において非常に有用といえる。
図１は、本発明の実施例１において、指標ｍＲＮＡとβ－アクチンｍＲＮＡとの発現量の比を示すグラフであり、同図（Ａ）は、非内膜症患者群、月経困難症患者群および内膜症患者群の「ＨＲＦ／β－アクチン」の平均を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、非内膜症患者群、月経困難症患者群および内膜症患者群の「ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン」の平均を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例２において、非内膜症患者群、月経困難症患者群、内膜症患者群のＨＲＦｍＲＮＡとβ－アクチンｍＲＮＡとの発現量の比「ＨＲＦ／β－アクチン」の平均を示すグラフである。
　本発明において「子宮内膜症関連疾患」とは、例えば、いわゆる子宮内膜症の他に、腺筋症、子宮内膜症に関連する疾患（例えば、月経困難症、不妊症等）も含む。
　本発明において、子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡは、前述のように、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡである。前記指標ｍＲＮＡを検出する際には、いずれか一方のみを検出してもよいし、両方を検出してもよい。
　ＨＲＦｍＲＮＡは、例えば、血球細胞、リンパ球、線維芽細胞および卵巣等の様々な細胞で発現するが、本発明が検出目的としているＨＲＦｍＲＮＡは、子宮内膜細胞で発現するＨＲＦｍＲＮＡである。ＨＲＦｍＲＮＡは、一般に、子宮内膜内の間質細胞および腺上皮細胞の両者に発現している。ＨＲＦ遺伝子のｃＤＮＡおよびｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３２９５で登録されている。この配列を配列番号２４に示す。この他にも各種変異体、例えば、ＸＭ＿２９４０４５、ＸＭ＿０３８３９１、ＸＭ＿２９３２９１、ＸＭ＿２０９７４１、ＸＭ＿２１０５６６、ＸＭ＿０６６７０６、ＸＭ＿０６６６７５、ＸＭ＿０７１３２１等が知られている。
　アロマターゼは、例えば、ＣＹＰ１９とも呼ばれる。以下、アロマターゼｍＲＮＡは、ＣＹＰ１９ｍＲＮＡともいう。前記アロマターゼｍＲＮＡは、例えば、血球細胞、胃および卵巣等の様々な細胞に含まれるが、本発明が検出目的としているアロマターゼｍＲＮＡは、子宮内膜細胞内で発現するアロマターゼｍＲＮＡである。前記アロマターゼｍＲＮＡは、一般に、子宮内膜細胞の中でも第IV層基底細胞（基底子宮内膜細胞）に局在していると考えられる。アロマターゼ遺伝子（ＣＹＰ１９遺伝子）の中でも、ＣＹＰ１９Ａ１のｃＤＮＡおよびｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３１２２６で登録されている。この配列を配列番号２５に示す。
　本発明において、前記コントロールｍＲＮＡは、前述のようにβ－アクチンｍＲＮＡである。前記β－アクチンｍＲＮＡは、子宮内膜細胞内で恒常的に発現するｍＲＮＡであり、指標ｍＲＮＡの発現を検出するためのコントロールとなる。すなわち、本発明においては、β－アクチンｍＲＮＡの発現を検出することで、生体試料のｍＲＮＡ発現機能が正常であるか否か、また、その程度を確認することができる。このため、前述の指標ｍＲＮＡと同様に、コントロールであるβ－アクチンｍＲＮＡの発現を検出し、例えば、この検出結果を用いて、指標ｍＲＮＡの検出結果を補正することで、より正確に指標ｍＲＮＡの検出（例えば、発現量の測定）を行うことができる。前記β－アクチンｍＲＮＡの発現量によって、例えば、後述するように、前記指標ｍＲＮＡの発現量を補正できることから、前記β－アクチンｍＲＮＡは、補正を行うための補正ｍＲＮＡともいえる。前記β－アクチンのｃＤＮＡおよびｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに、アクセッションＮｏ．Ｘ００３５１、Ｊ０００７４、Ｍ１０２７８で登録されている。
＜子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの検出方法＞
　本発明の検出方法は、前述のように、子宮内膜細胞を含有する生体試料における、子宮内膜症関連疾患の指標となるｍＲＮＡの発現を検出する方法であって、
同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡとを、それぞれに特異的なプローブにより検出する検出工程を含み、
前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブ（β－アクチン検出用プローブ）が、配列番号１に示す塩基配列において８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブの少なくも一方であることを特徴とする。
　本発明において、前記生体試料は、子宮内膜細胞を含む生体試料であればよく、特に制限されないが、本発明は、例えば、子宮内膜細胞の他にさらに子宮内膜細胞以外の細胞を含む可能性がある生体試料に適用できる。前記生体試料の具体例としては、例えば、月経血等の血液試料、子宮内膜からの試料（生検試料）、腹腔内の内膜症病変の試料等があげられ、中でも、特に月経血が好ましい。前記月経血試料は、例えば、採取が簡便であることから、患者の精神的・肉体的な負担を軽減でき、頻繁な測定も可能である。また、測定対象の生体試料は、いずれの生物から採取してもよいが、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類等の動物があげられる。
　以下、β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブを、「β－アクチン検出用プローブ」または「コントロール検出用プローブ」という。また、子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡに特異的なプローブを、「指標検出用プローブ」といい、ＨＲＦｍＲＮＡに特異的なプローブを「ＨＲＦ検出用プローブ」、アロマターゼｍＲＮＡに特異的なプローブを「アロマターゼ検出用プローブ」または「ＣＹＰ１９検出用プローブ」という。なお、本発明において、これらのプローブは、ｍＲＮＡに特異的なプローブであればよく、例えば、後述するように、直接的にｍＲＮＡを検出可能なプローブでもよいし、間接的にｍＲＮＡを検出可能なプローブであってもよい。具体的に、前者としては、例えば、ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なプローブがあげられる。後者としては、例えば、前記ｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅物（例えば、ｃＤＮＡ等）にハイブリダイズ可能なプローブがあげられる。なお、前者および後者は、それぞれ、前記ｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅物およびｍＲＮＡの両方に対してハイブリダイズ可能であってもよい。
　本発明は、同一反応系において、前記指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡを検出するにあたって、前記検出工程において、前述のβ－アクチン検出用プローブを使用することが特徴であり、例えば、その他の工程や条件は、何ら制限されない。また、本発明においては、前記指標ｍＲＮＡとして、例えば、同一反応系において、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡのいずれか一方のみを検出してもよいが、両者を検出することが好ましい。前記反応系とは、例えば、反応液があげられる。また、同一反応系において、前記指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡを検出するとは、例えば、一つの反応系を用いて、前記指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡの両方を検出することをいう。
　本発明において、前記β－アクチン検出用プローブは、前述のように、配列番号１に示す塩基配列において８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブである。前記配列番号１に示す塩基配列は、β－アクチンのｃＤＮＡ配列であり、この配列は、前述のように、例えば、Ｇｅｎｅ　ＢａｎｋにアクセッションＮｏ．Ｘ００３５１、Ｊ０００７４、Ｍ１０２７８で登録されている。また、本発明において、前記配列番号１に示す塩基配列は、「ｔ」を「ｕ」に置き換えた配列であってもよく、この配列は、β－アクチンｍＲＮＡの配列である。
　前者、すなわち、前記配列番号１に示す塩基配列において８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブは、例えば、β-アクチンｃＤＮＡのセンス鎖にハイブリダイズ可能であることから、以下、センス鎖検出用プローブともいう。これは、例えば、β－アクチンｍＲＮＡにもハイブリダイズ可能であってもよい。また、前記センス鎖検出用プローブは、「ｔ」を「ｕ」に置き換えた配列であってもよい。この場合、例えば、β－アクチンｍＲＮＡにハイブリダイズ可能であることから、ｍＲＮＡ検出用プローブということもでき、これは、例えば、前記センス鎖にもハイブリダイズ可能であってもよい。後者、すなわち、前記センス鎖検出用プローブに相補的な塩基配列からなるプローブは、例えば、β－アクチンｃＤＮＡのアンチセンス鎖にハイブリダイズ可能であることから、以下、アンチセンス鎖検出用プローブともいう。また、前記アンチセンス鎖検出用プローブは、「ｔ」を「ｕ」に置き換えた配列であってもよい。本発明においては、前記β－アクチン検出用プローブとして、例えば、センス鎖検出用プローブおよびアンチセンス鎖検出用プローブのうち、いずれか一方のみを使用してもよいし、両方を使用してもよい。具体的には、ｍＲＮＡに前記β－アクチン検出用プローブをハイブリダイズさせる際には、センス鎖検出用プローブを使用することが好ましく、また、ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物に前記β－アクチン検出用プローブをハイブリダイズさせる際には、いずれか一方でもよいが、両方を使用することが好ましい。
　本発明において、前記「領域内」とは、例えば、８０８番目～９１０番目の領域全体でもよいし、８０８番目～９１０番目の領域における部分領域であってもよい。プローブの長さは、一般的に、例えば、１０～１００塩基（ｍｅｒ）であり、好ましくは、１０～４０塩基であり、より好ましくは、１５～４０塩基であり、さらに好ましくは、１５～２５塩基であり、特に好ましくは、１５～２０塩基である。このため、本発明において、前記β－アクチン検出用プローブは、例えば、前記領域における部分領域にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブであることが好ましい。なお、前記プローブは、例えば、前記領域全体とその隣接領域、または前記部分領域とその隣接領域とにハイブリダイズしてもよい。
　前記β－アクチン検出用プローブの長さは、特に制限されず、例えば、前述のような長さがあげられるが、具体例としては、例えば、１５～３５塩基であり、好ましくは、１８～３０塩基であり、より好ましくは２０～２８塩基である。
　前記β－アクチン検出用プローブの具体例としては、例えば、下記配列番号３および配列番号１９～２３のいずれかに示す塩基配列を含むプローブ、または、前記塩基配列からなるプローブがあげられる。配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１における８２９番目～８５３番目の塩基配列に相補的な配列、下記配列番号１９に示す塩基配列は、配列番号１における８０８番目～８２８番目の塩基配列に相補的な配列、下記配列番号２０に示す塩基配列は、配列番号１における８２９番目～８４９番目の塩基配列に相補的な配列、下記配列番号２１に示す塩基配列は、配列番号１における８５０番目～８７０番目の塩基配列に相補的な配列、下記配列番号２２に示す塩基配列は、配列番号１における８７１番目～８９１番目の塩基配列に相補的な配列、下記配列番号２３に示す塩基配列は、配列番号１における８９２番目～９１０番目の塩基配列に相補的な配列である。これらのプローブは、例えば、配列番号１における８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能な、センス鎖検出用プローブである。なお、下記配列において、各「ｔ」は、それぞれ「ｕ」であってもよい。
センス鎖検出用プローブ
　　５’－gactccatgcccaggaaggaaggct－３’（配列番号３）
　　５’－ggaagagtgcctcagggcagc－３’（配列番号１９）
　　５’－ccatgcccaggaaggaaggct－３’（配列番号２０）
　　５’－tttcgtggatgccacaggact－３’（配列番号２１）
　　５’－tcatgatggagttgaaggtag－３’（配列番号２２）
　　５’－cggatgtccacgtcacact－３’（配列番号２３）
　また、前記β－アクチン検出用プローブとしては、例えば、下記配列番号２および配列番号１４～１８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブ、または、前記塩基配列からなるプローブがあげられる。下記配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１における８２９番目～８５３番目の塩基配列からなる配列、下記配列番号１４に示す塩基配列は、配列番号１における８０８番目～８２８番目の塩基配列からなる配列、下記配列番号１５に示す塩基配列は、配列番号１における８２９番目～８４９番目の塩基配列からなる配列、下記配列番号１６に示す塩基配列は、配列番号１における８５０番目～８７０番目の塩基配列からなる配列、下記配列番号１７に示す塩基配列は、配列番号１における８７１番目～８９１番目の塩基配列からなる配列、下記配列番号１８に示す塩基配列は、配列番号１における８９２番目～９１０番目の塩基配列からなる配列である。これらのプローブは、前述のセンス鎖検出用プローブに相補的な配列であって、配列番号１における８０８番目～９１０番目の相補的配列の領域内にハイブリダイズ可能な、アンチセンス鎖検出用プローブである。なお、下記配列において、各「ｔ」は、それぞれ「ｕ」であってもよい。
アンチセンス鎖検出用プローブ
　　５’－agccttccttcctgggcatggagtc－３’（配列番号２）
　　５’－gctgccctgaggcactcttcc－３’（配列番号１４）
　　５’－agccttccttcctgggcatgg－３’（配列番号１５）
　　５’－agtcctgtggcatccacgaaa－３’（配列番号１６）
　　５’－ctaccttcaactccatcatga－３’（配列番号１７）
　　５’－agtgtgacgtggacatccg－３’（配列番号１８）
　前記β－アクチン検出用プローブは、例えば、配列番号１において、８０８番目～９１０番目の前後１００塩基を含む領域（例えば、７０８番目～１０１０番目）内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブであってもよい。また、前記β－アクチン検出用プローブは、例えば、配列番号１において、８０８番目～９１０番目の領域の一部または全部を含む１００塩基程度の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブであってもよい。具体例としては、例えば、配列番号１において、前記配列番号３、配列番号１９～２３、配列番号２および配列番号１４～１８に示す少なくともいずれかのプローブがハイブリダイズする領域の前後１００塩基を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブであってもよく、また、前記いずれかのプローブがハイブリダイズする領域を含む１００塩基程度の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブであってもよい。
　前記β－アクチン検出用プローブの構成成分は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド等の一般的なヌクレオチドから構成されてもよいが、例えば、人工核酸、修飾核酸、ＰＮＡ等のペプチド核酸等を含んでもよい。
　本発明において、前記指標検出用プローブは、前述のように、ＨＲＦ検出用プローブおよびアロマターゼ検出用プローブがあげられる。本発明において、前記指標検出用プローブとしては、例えば、いずれか一方のみを使用してもよいが、前述のように、同一反応系において、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの両方を検出することが好ましく、前記ＨＲＦ検出用プローブおよびアロマターゼ検出用プローブの両方を使用することが好ましい。
　また、本発明は、前述のβ－アクチン検出用プローブを使用することが特徴であって、前記指標ｍＲＮＡを検出するための指標検出用プローブ、すなわち、ＨＲＦ検出用プローブおよびアロマターゼ検出用プローブは、何ら制限されない。前記指標検出用プローブとしては、前述のβ－アクチン検出用プローブと同様に、例えば、センス鎖検出用プローブおよびアンチセンス鎖検出用プローブがあげられ、いずれか一方のみを使用してもよいし、両方を使用してもよい。
　前記ＨＲＦ検出用プローブおよび前記アロマターゼ検出用プローブは、特に制限されないが、例えば、増幅用のプライマー間の配列に相補的なものが好ましい。前記ＨＲＦ検出用プローブ、前記アロマターゼ検出用プローブおよびβ－アクチン検出用プローブは、相互に干渉しない配列であることが好ましい。前記ＨＲＦ検出用プローブ、前記アロマターゼ検出用プローブおよびβ－アクチン検出用プローブは、例えば、各プローブ間でダイマーを形成しない配列とすることが好ましい。
　前記ＨＲＦ検出用プローブとしては、前述のように、特に制限されないが、例えば、配列番号２４に示す塩基配列において、９４番目～６１２番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブが好ましい。以下に、前記ＨＲＦ検出用プローブの具体例を示すが、本発明は、これらには制限されない。
アンチセンス鎖検出用プローブ
　　　　５’－cctcatcagccacgatgagatgttctcc－３’　（配列番号４）
センス鎖検出用プローブ
　　　　５’－ggagaacatctcatcgtggctgatgagg－３’　（配列番号５）
　前記アロマターゼ用プローブとしては、前述のように、特に制限されないが、例えば、配列番号２５に示す塩基配列において、２５２番目～１７６３番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブが好ましい。以下に、前記アロマターゼ検出用プローブの具体例を示すが、本発明は、これらには制限されない。
アンチセンス鎖検出用プローブ
　　　　５’－ctttgggccccgtggctgtgc－３’　（配列番号６）
センス鎖検出用プローブ
　　　　５’－gcacagccacggggcccaaag－３’　（配列番号７）
　本発明において、前記指標ｍＲＮＡおよび前記コントロールｍＲＮＡ（β－アクチンｍＲＮＡ）の検出は、前述の各種プローブを用いて、直接的に行ってもよいし、間接的に行ってもよい。前者の場合、例えば、生体試料中の各ｍＲＮＡに、前記各プローブをハイブリダイズさせることで、直接、各ｍＲＮＡを検出できる。このような方法としては、例えば、ノーザンブロッティング法があげられる。また、前者の場合、例えば、前記指標ｍＲＮＡおよび前記β－アクチンｍＲＮＡを含む前記生体試料と、前述の各プローブとを含む反応系を準備すればよい。他方、後者の場合、例えば、生体試料中の前記指標ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物および前記β－アクチンｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物に、前記各プローブをハイブリダイズさせることで、間接的に、ｍＲＮＡを検出できる。このような方法としては、例えば、逆転写－リアルタイムＰＣＲ法等のＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイを用いる方法等があげられる。また、後者の場合、例えば、前記生体試料中の指標ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物と、前記生体試料中のβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物と、前述の各プローブとを含む反応系を準備すればよい。本発明においては、例えば、検出感度を向上できることから、特に、核酸増幅物を用いる後者の方法が好ましい。
　本発明において、「核酸増幅物」は、特に制限されないが、例えば、鋳型であるｍＲＮＡの塩基情報にしたがって合成された核酸であり、一般的に、ｃＤＮＡがあげられる。前記核酸増幅物は、例えば、ｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列（アンチセンス鎖の塩基配列）を有する核酸、および、ｍＲＮＡと同じ塩基配列（センス鎖の塩基配列）を有する核酸のいずれであってもよいが、両方を含むことが好ましい。また、前記核酸増幅物の構成成分は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド等の一般的なヌクレオチドから構成されてもよいが、例えば、人工核酸、修飾核酸、ＰＮＡ等のペプチド核酸等を含んでもよい。
　前記指標ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物およびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物について、前記プローブをハイブリダイズさせる場合、本発明は、例えば、さらに、前記生体試料中の前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成する合成工程を含んでもよい。前記指標ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物およびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物は、例えば、それぞれを合成してから、同一の反応系内で混合してもよいが、前記合成工程において、同一の反応系内で、前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を同時に合成することが好ましい。これによって、処理がより一層簡便になる。
　前記合成工程は、例えば、前記指標検出用プローブおよび前記β－アクチン検出用プローブの存在下、同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成してもよい。これにより、前記合成工程の後、例えば、前記各種プローブを反応系に添加することなく、同一の反応系内を用いて、連続的に、前記検出工程を行うことができる。
　また、前記合成工程と前記検出工程とは、例えば、前述のように別々に行ってもよいし、同時に並行して行ってもよい。前者の場合、例えば、前記合成工程で、前記核酸増幅物を含む前記反応系を準備した後に、前記反応系を用いて、前記検出工程を行うことができる。後者の場合、例えば、同一反応系内で、各種核酸増幅物の合成を行いながら、合成された各種核酸増幅物を、それぞれに特異的なプローブで検出してもよい。この場合、前述のように、前記指標検出用プローブおよび前記β－アクチン検出用プローブの存在下、同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成することが好ましい。後者の方法としては、例えば、いわゆるリアルタイムＰＣＲ法等があげられる。前記検出は、例えば、経時的に行うことができ、また、連続的であっても非連続的（断続的）であってもよく、コンスタントでもインコンスタントであってもよい。また、前記検出は、例えば、検出開始時点と所定の終了時点のみに行ってもよい。
　前記核酸増幅物の合成方法（製造方法）は、特に制限されないが、例えば、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型として、さらに前記ｃＤＮＡにおける所望の領域を増幅させる方法があげられる。なお、本発明において、「ｍＲＮＡを鋳型として核酸増幅を合成する」とは、例えば、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、さらに、このｃＤＮＡを鋳型として所望の領域を増幅させることを含む。核酸増幅方法としては、特に制限されず、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic　acid　sequence　based　amplification）法、ＴＭＡ（Transcription－mediated　amplification）法およびＳＤＡ（Strand　Displacement　Amplification）法等があげられ、中でもＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法が好ましい。
　前記核酸増幅物の合成は、例えば、各種プライマーを用いて行うことができる。前記核酸増幅物の合成は、例えば、初めにランダムプライマーを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、各種プライマーを用いて、所望の領域を増幅させてもよい。以下、β－アクチンｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅物の合成に使用するプライマーを「β－アクチン用プライマー」、指標ｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅物の合成に使用するプライマーを「指標用プライマー」、ＨＲＦｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅物の合成に使用するプライマーを「ＨＲＦ用プライマー」、アロマターゼｍＲＮＡを鋳型とする核酸増幅物の合成に使用するプライマーを「アロマターゼ用プライマー」または「ＣＹＰ１９用プライマー」ともいう。これらのプライマーの配列は、特に制限されないが、前述のβ－アクチン検出用プローブまたは指標検出用プローブがハイブリダイズ可能な配列を含む所望の領域を増幅するように設計することが好ましい。前記各プライマーは、例えば、センス鎖を増幅するプライマー（フォワードプライマー）およびアンチセンス鎖を増幅するプライマー（リバースプライマー）のいずれを使用してもよく、両方を併用することが好ましい。前記プライマーの条件、例えば、長さ、配列等は、例えば、前述の各種検出用プローブに応じて適宜設計できる。
　各種プライマーは、例えば、汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、商品名：Ｍｏｄｅｌ　３９４）等を用いて化学的に合成できる。また、本発明の技術分野において公知の他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。なお、プライマーの長さは、特に制限されないが、例えば、２～１００塩基、好ましくは、２～６０塩基である。
　前記β－アクチン用プライマーにより増幅させる目的の領域（増幅領域）は、特に制限されないが、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、前記β－アクチン検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を含むことが好ましい。前記増幅領域は、配列番号１に示す塩基配列において、例えば、８０８番目～９１０番目の領域を含むことが好ましい。また、前記増幅領域の５’末端は、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、８０８番目より５’側であってもよく、例えば、８０８番目から約５０塩基～約１００塩基程度、５’側にシフトさせてもよい。具体例として、前記増幅領域の５’末端は、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、７０８番～８０８番目、７０８番目～７５８番目または７５８番目～８０８番目に位置してもよい。また、前記増幅領域の３’末端は、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、９１０番目よりも３’側であってもよく、例えば、９１０番目から約５０塩基～約１００塩基程度、３’側にシフトさせてもよい。具体例として、前記増幅領域の３’末端は、例えば、配列番号１に示す塩基配列において、９１０番目～１０１０番目、９１０番目～９６０番目または９６０番目～１０１０番目に位置してもよい。前記β－アクチン用プライマーは、例えば、このような増幅領域に応じて適宜決定できる。
　前記β－アクチン検出用プローブとして、前記配列番号２に示すβ－アクチン検出用プローブを使用する場合、前記β－アクチン用プライマーとしては、例えば、配列番号１に示す塩基配列において８２９番目～８５３番目を含み、且つ長さ５０～２００塩基程度の領域を増幅するプライマーが好ましい。前記β－アクチン用プライマーのうち、センス鎖を増幅するプライマー（フォワードプライマー）としては、例えば、下記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記オリゴヌクレオチドからなるプライマーがあげられる。また、アンチセンス鎖を増幅するプライマー（リバースプライマー）としては、例えば、下記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記オリゴヌクレオチドからなるプライマーがあげられる。本発明においては、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーのうち、いずれか一方のみを使用してもよいが、両者が一対となるプライマーセットを使用することが好ましい。
（Ｘ１Ｆ）配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　　　　　５’－gctgccctgaggcactct－３’（配列番号８）
（Ｘ１Ｒ）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　　　　　５’－cggatgtccacgtcacactt－３’（配列番号９）
　また、前記各プライマーは、例えば、目的の領域の増幅が可能であれば、前記（Ｘ１Ｆ）および（Ｘ１Ｒ）の塩基配列は、例えば、配列番号８および配列番号９において、それぞれ、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列であってもよい。置換、欠失、挿入または付加される塩基の数は、例えば、１～５個の範囲であり、好ましくは１～３個の範囲であり、より好ましくは１もしくは２個であり、特に好ましくは１個である。
　前記ＨＲＦ用プライマーとしては、特に制限されず、前述のように、ＨＲＦ検出用プローブに応じて適宜設計できる。具体的に、前記ＨＲＦ用プライマーのうち、センス鎖を増幅するプライマー（フォワードプライマー）としては、例えば、下記（Ｙ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記オリゴヌクレオチドからなるプライマー等があげられる。また、アンチセンス鎖を増幅するプライマー（リバースプライマー）としては、例えば、下記（Ｙ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記オリゴヌクレオチドからなるプライマー等があげられる。本発明においては、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーのうち、いずれか一方のみを使用してもよいが、両者が一対となるプライマーセットとして使用することが好ましい。また、前記各種プライマーは、例えば、目的の領域の増幅が可能であればよく、例えば、前記（Ｙ１Ｆ）および（Ｙ１Ｒ）の塩基配列は、例えば、配列番号１０および１１において、それぞれ、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列であってもよい。置換、欠失、挿入または付加される塩基の数は、例えば、１～５個の範囲であり、好ましくは１～３個の範囲であり、より好ましくは１もしくは２個であり、特に好ましくは１個である。前記ＨＲＦ用プライマーで増幅させる目的の増幅領域は、特に制限されないが、例えば、ＨＲＦのコード領域全部でもよいし、一部であってもよい。また、ＨＲＦｍＲＮＡが、前述のような変異体である可能性を考慮する場合、例えば、変異部位にはハイブリダイズしないプライマーを設計することが好ましい。これにより、ＨＲＦｍＲＮＡが変異体であるか否かにかかわらず、目的の領域を増幅できる。
（Ｙ１Ｆ）配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　　　　　５’－ttcagtcgccatcatgattatctac－３’（配列番号１０）
（Ｙ１Ｒ）配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　　　　　５’－gcgatctcccggatcttg－３’（配列番号１１）
　前記アロマターゼ用プライマーとしては、特に制限されず、前述のように、アロマターゼ検出用プローブに応じて適宜設計できる。具体的に、前記アロマターゼ用プローブのうち、センス鎖を増幅するプライマー（フォワードプライマー）としては、例えば、下記（Ｚ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記オリゴヌクレオチドからなるプライマー等があげられる。また、アンチセンス鎖を増幅するプライマー（リバースプライマー）としては、例えば、下記（Ｚ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記オリゴヌクレオチドからなるプライマー等があげられる。本発明においては、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーのうち、いずれか一方のみを使用してもよいが、両者が一対となるプライマーセットとして使用することが好ましい。また、前記各種プライマーは、例えば、目的の領域の増幅が可能であれば、前記（Ｚ１Ｆ）および（Ｚ１Ｒ）の塩基配列は、例えば、配列番号１２および１３において、それぞれ、１若しくは数個の塩基が、置換、欠失、挿入または付加された塩基配列であってもよい。置換、欠失、挿入または付加される塩基の数は、例えば、１～５個の範囲であり、好ましくは１～３個の範囲であり、より好ましくは１もしくは２個であり、特に好ましくは１個である。前記アロマターゼ用プライマーで増幅させる目的の増幅領域は、特に制限されないが、例えば、アロマターゼのコード領域全部でもよいし、一部であってもよい。また、アロマターゼｍＲＮＡが変異体である可能性を考慮する場合、例えば、変異部位にはハイブリダイズしないプライマーを設計することが好ましい。これにより、アロマターゼｍＲＮＡが変異体であるか否かにかかわらず、目的の領域を増幅できる。
（Ｚ１Ｆ）配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　　　　　５’－tccttataggtactttcagccatttg－３’（配列番号１２）
（Ｚ１Ｒ）配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
　　　　　５’－caccatggcgatgtactttcc－３’（配列番号１３）
　次に、本発明の検出方法について、一例として、月経血試料を使用し、同一反応液を用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって、指標ｍＲＮＡであるＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡならびにコントロールｍＲＮＡであるβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成し、リアルタイムＰＣＲ法によって、各種プローブを用いて前記各核酸増幅物を検出する方法を説明する。なお、本発明は、これに限定されるものではなく、検出する指標ｍＲＮＡは、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡのいずれか一方であってもよい。
（試料の準備）
　まず、子宮内膜細胞含有試料として月経血を採取する。月経血とは、一般に、月経中の膣出血により回収できる赤血球含有体液である。月経血の採取方法は、特に制限されないが、例えば、膣円蓋部から直接回収してもよいし、ガーゼや生理用ナプキン、タンポン等の吸収剤を用いて回収してもよい。
（核酸増幅物の合成）
　前記月経血試料におけるＨＲＦｍＲＮＡ、アロマターゼｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、同一反応系において、それぞれの核酸増幅物を合成する。なお、核酸増幅物の合成における各種処理条件等は、何ら制限されない。
　まず、前記月経血試料からトータルＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの抽出方法は、特に制限されず、例えば、グアニジン－イソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出等の従来公知の方法が採用でき、また、市販のＲＮＡ抽出試薬を用いて実施してもよい。
　そして、プライマー、逆転写酵素、ｄＮＴＰ等を用いて、抽出したトータルＲＮＡに含まれるｍＲＮＡを鋳型として、相補的なｃＤＮＡ（１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ）を逆転写反応（ＲＴ反応）により合成する。プライマーとしては、特に制限されず、例えば、ランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマー等があげられる。プライマーの条件、例えば、長さ、配列等は、当業者であれば技術常識に基づいて設計でき、また、市販のプライマーを使用することもできる。
　この逆転写反応は、通常、ＰＣＲに先立って行われ、例えば、逆転写反応後、その反応液に、さらにＰＣＲ反応液の組成成分を添加してＰＣＲを行うことができる。また、より簡便な操作が可能であることから、例えば、１つの反応系内に必要な試薬を添加しておき、逆転写反応とＰＣＲとを連続的に行うこともできる（いわゆる、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ法）。
　続いて、合成したｃＤＮＡ（１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ）を鋳型として、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは、例えば、前述のＨＲＦ用プライマー、アロマターゼ用プライマーおよびβ－アクチン用プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を用いて行うことができる。この反応によって、前記１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡにおける目的領域に相補的なｃＤＮＡ（２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ）が増幅される。これによって、ＨＲＦｍＲＮＡ、アロマターゼｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡについて、目的領域のｃＤＮＡ増幅物が得られる。この際、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーを含むプライマーセットを使用することで、核酸増幅物として、目的領域の二本鎖ｃＤＮＡが得られる。
（核酸増幅物の検出）
　得られた各核酸増幅物を、各検出用プローブを用いて検出し、前記核酸増幅物が一定量に達した時点のサイクル数をカウントすることにより、ＨＲＦｃＤＮＡ、アロマターゼｃＤＮＡおよびβ－アクチンｃＤＮＡの量、ひいては、ＨＲＦｍＲＮＡ、アロマターゼｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡのそれぞれの発現量を決定できる。リアルタイムＰＣＲ法は、通常、ＰＣＲにおいて核酸増幅物の生成過程を経時的にモニタリングする方法であり、ＰＣＲと核酸増幅物の検出とが並行して行われる。なお、β－アクチン検出用プローブは、前述の通りである。また、ＨＲＦ検出用プローブおよびアロマターゼ検出用プローブは、特に制限されず、例えば、前述のようなプローブがあげられる。
　前記核酸増幅物の検出方法は、特に制限されず、例えば、蛍光強度の測定を利用した従来公知の方法があげられる。このような方法としては、例えば、従来公知のＴａｑＭａｎ（商標）プローブ法、ハイブリダイゼーション法、サイクリングプローブ法等がある。なお、これらの各種方法に使用する蛍光物質およびクエンチャー等は、何ら制限されず、従来公知のものが適宜使用できる。
　ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ法は、ＰＣＲの鋳型に相補的な部分配列であり、且つ蛍光物質とクエンチャーとを有するプローブ（オリゴヌクレオチド：例えば、２０～３０ｍｅｒ程度）を使用する方法である。前記プローブとしては、鋳型の標的配列に特異的にアニールするオリゴヌクレオチドの末端を、蛍光物質（５’末端）とクエンチャー（３’末端）とでそれぞれ標識化したものが例示できる。この方法を利用する場合は、例えば、ＰＣＲ反応液に予め前記プローブを添加しておき、前記反応液（前記反応液中の蛍光物質）に励起光を照射して、前記蛍光物質より発生する蛍光を測定すればよい。この方法は、以下の原理に基づく。ＰＣＲ反応液において、前記プローブが鋳型にアニールしたのみでは、励起光を照射しても前記クエンチャーにより蛍光物質の蛍光は抑制されるが、伸長工程においてＤＮＡ伸長が起こると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブが分解され、蛍光物質がクエンチャーから離れることにより蛍光を発するという原理である。
　ハイブリダイゼーション法は、ＰＣＲの鋳型に相補的な部分配列である、隣接する２種類のプローブ（オリゴヌクレオチド）を使用する方法である。前記２種類のプローブとしては、例えば、鋳型の３’側にアニールし、且つ３’末端がアクセプター蛍光物質で標識されたプローブと、鋳型の５’側にアニールし、且つ５’末端がドナー蛍光物質で標識されたプローブとの組み合わせが例示できる。この方法を利用する場合は、例えば、ＰＣＲ反応液に予め前記二種類のプローブを添加しておき、前記反応液（前記反応液中のアクセプター蛍光物質）に励起光を照射して、前記アクセプター蛍光物質より発生する蛍光を測定すればよい。この方法は、以下の原理に基づく。すなわち、ＰＣＲ反応液において、二種類のプローブが鋳型にアニールして、それぞれのアクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質とが隣接すると蛍光が発生するが、伸長工程においてＤＮＡ伸長が起こると、アクセプター蛍光物質で標識されたプローブが分解され、アクセプター蛍光物質がドナー蛍光物質から離れることにより蛍光を発生しないという原理である。
　サイクリングプローブ法は、ＰＣＲの鋳型に対して相補的な配列であり、末端が蛍光物質（５’末端）とクエンチャー（３’末端）とでそれぞれ標識され、且つ、中央のみがＲＮＡ配列（リボヌクレオチド配列）となったプローブを使用する方法である。この方法を利用する場合は、例えば、前記ＰＣＲ反応液に予め前記プローブおよびＲＮａｓｅＨを添加しておき、前記反応液（前記反応液中の蛍光物質）に励起光を照射して、前記蛍光物質より発生する蛍光を測定すればよい。この方法は、以下の原理に基づく。すなわち、前記ＰＣＲ反応液において、前記プローブが鋳型にアニールしたのみでは、励起光を照射しても前記クエンチャーにより蛍光物質の蛍光は抑制されるが、キメラ二本鎖を形成したＲＮＡ部分がＲＮａｓｅＨによって切断されると、両端の蛍光物質とクエンチャーとが離れるため蛍光を発し、ＲＮＡ領域にミスマッチが存在するとＲＮａｓｅＨによる切断は生じないという原理である。
　本発明においては、指標ｍＲＮＡであるＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方とβ－アクチンｍＲＮＡとを同一反応系で検出することから、それぞれの検出用プローブは、前述のように、検出条件、例えば、励起波長および／または測定波長が異なる蛍光物質を使用することが好ましい。これによって、同一反応系で同時に核酸増幅物の合成を行っても、励起波長および／または測定波長によって、それぞれの検出が可能となる。
　蛍光強度の検出は、例えば、蛍光光度計で行うことができる。また、一般に、ＰＣＲ反応ユニット（例えば、サーマルサイクラー）と光学系ユニット（例えば、蛍光光度計）との両方を備える装置が使用され、市販のＳｍａｒｔ　Ｃｙｃｌｅｒ（商品名、タカラバイオ社製）、ライトサイクラー（商品名、ロシュ・ダイアグノスティック社製）、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７０００（商品名、アプライド・バイオシステム社製）等があげられる。蛍光強度の検出条件は、特に制限されず、例えば、各検出用プローブにおける蛍光物質の種類に応じて適宜決定することができる。
　このように蛍光強度を測定すれば、核酸増幅物の定量が可能である。リアルタイムＰＣＲにおいては、通常、サイクルごとの蛍光強度をプロットした増幅曲線を作成し、核酸増幅物が設定した値（閾値：例えば、増幅が停止する量）となったサイクル数（Ｃｔ値：Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ）を解析する。この解析内容に基づけば、核酸増幅物を定量できる。そして、本発明においては、前述のようなβ－アクチン検出用プローブを使用するため、例えば、β－アクチン検出用プローブが、ＨＲＦｍＲＮＡの核酸増幅物およびアロマターゼｍＲＮＡの核酸増幅物にもハイブリダイズするという問題が防止できる。このため、高い信頼性で、指標ｍＲＮＡならびにβ－アクチンｍＲＮＡを検出することが可能である。
　本発明は、前記検出工程に加えて、さらに、前記検出工程における前記指標ｍＲＮＡの検出結果とβ－アクチンｍＲＮＡの検出結果とから、前記生体試料中の子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡの発現量を判断する判断工程を含んでもよい。
　β－アクチンｍＲＮＡは、子宮内膜細胞において恒常的に発現するため、その発現量は、目的のｍＲＮＡ（指標ｍＲＮＡ）の発現を検出する際のコントロール（評価基準）となる。そこで、前記検出工程における前記指標ｍＲＮＡの検出結果とβ－アクチンｍＲＮＡの検出結果とを比較することによって、前記生体試料中の子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡの発現量を判断することが可能である。
　前記判断工程は、例えば、さらに、前記指標ｍＲＮＡの補正値を決定する補正値決定工程を含んでもよい。
　この補正値決定工程では、例えば、前記検出工程で得られたβ－アクチンｍＲＮＡの検出結果に対する指標ｍＲＮＡの検出結果の比を算出し、これを指標ｍＲＮＡの補正値とする。この補正値は、例えば、前記生体試料中の子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡの発現量を意味する。月経血試料には、前述のようなＲＮａｓｅが含まれている。このため、例えば、前述のように、採取した試料中のｍＲＮＡが、試料の採取から分析に供するまでの間に、前記ＲＮａｓｅによって分解されたり、変性するため、子宮内膜細胞由来のＨＲＦの真の測定値を得ることが困難である。しかしながら、前記補正値決定工程で得られる値、すなわち、β－アクチンｍＲＮＡ発現量に対する指標ｍＲＮＡ発現量の比は、前述のようなＲＮａｓｅによる分解または変性の影響を除外した指標ｍＲＮＡの発現量の補正値となる。したがって、例えば、前記検出工程で検出した指標ｍＲＮＡ発現量ではなく、前記補正値決定工程により算出した前記指標ｍＲＮＡ補正値を、子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡ発現量を示す代替値とすることによって、後述するように、子宮内膜症関連疾患を従来よりも優れた精度で判断することが可能となる。
　β－アクチンｍＲＮＡおよび指標ｍＲＮＡの検出結果とは、それぞれ、例えば、生体試料における指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡの発現量を示す値である。前記発現量を示す値とは、例えば、測定機器から得られる測定値そのものでもよいし、蛍光強度でもよいし、前記測定値または蛍光強度から得られるｍＲＮＡの量（例えば、重量、質量、濃度等）であってもよい。β－アクチンｍＲＮＡ発現量（Ｘ）に対するＨＲＦｍＲＮＡ発現量（Ｙ）の比は、特に制限されず、例えば、Ｘ：Ｙ、Ｘ／Ｙ、Ｙ／Ｘ、これらの１００分率（％）等で表すことができる。β－アクチンｍＲＮＡ発現量（Ｘ）に対するアロマターゼｍＲＮＡ発現量（Ｚ）の比は、制限されず、例えば、Ｘ：Ｚ、Ｘ／Ｚ、Ｚ／Ｘ、これらの１００分率（％）等で表すことができる。
　また、本発明は、さらに、生体試料ごとの子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡの補正値を比較する工程を含んでもよい。前記指標ｍＲＮＡ補正値は、前述のようなＲＮａｓｅによる分解または変性の影響を除外した値である。このため、例えば、特定の患者について、子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡの経時的な変化を相対的に比較することや、異なる患者間の子宮内膜細胞由来の指標ｍＲＮＡを相対的に比較すること等も可能となる。
＜子宮内膜症関連疾患の診断方法＞
　本発明の検出方法により子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現を検出することによって、例えば、以下に示す方法により、子宮内膜症関連疾患の発症の有無、その程度、リスクまたは治療結果を判断すること等が可能である。
　本発明の子宮内膜症関連疾患の診断方法としては、例えば、下記（１）～（３）工程を含む方法があげられる。
（１）被検体の子宮内膜細胞を含む生体試料について、本発明の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法により、指標ｍＲＮＡとβ－アクチンｍＲＮＡとを検出する工程
（２）前記（１）工程で得られた指標ｍＲＮＡとβ－アクチンｍＲＮＡの検出結果から、β－アクチンｍＲＮＡの検出結果に対する前記指標ｍＲＮＡの検出結果の比（指標ｍＲＮＡ補正値）を算出する工程
（３）子宮内膜症関連疾患の患者の生体試料におけるβ－アクチンｍＲＮＡの発現量に対する前記指標ｍＲＮＡの発現量の比（指標ｍＲＮＡ補正値）、および、健常者の生体試料におけるβ－アクチンｍＲＮＡの発現量に対する前記指標ｍＲＮＡの発現量の比（指標ｍＲＮＡ補正値）の少なくとも一方を基準値とし、
前記基準値と、前記（２）工程において算出した指標ｍＲＮＡ補正値とを比較する工程
　本発明において「子宮内膜症関連疾患」とは、前述のように、いわゆる子宮内膜症の他に、例えば、月経困難症、不妊症、腺筋症等、子宮内膜症に起因する疾患（関連する疾患）も含む。なお、本発明において「健常者」とは、子宮内膜症関連疾患に関して健常であることを意味するものであり、他の疾患についても健常であることを意味するものではない。
　この診断方法において、前記（１）および（２）工程は、前述の本発明の検出方法と同様にして行うことができる。
　前記（３）工程において、子宮内膜症関連疾患の患者ならびに健常者についての、β－アクチンｍＲＮＡ発現量に対する指標ｍＲＮＡ発現量の比は、それぞれ、例えば、前述と同様にして本発明の検出方法により測定できる。なお、本発明において、前記指標ｍＲＮＡは、前述と同様に、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡのいずれか一方でもよいし、両方であってよい。
　前記（３）工程において、前記基準値と、前記（２）工程において算出した指標ｍＲＮＡ補正値とを比較することによって、前記被検体の子宮内膜症関連疾患の発症の有無を判断することができる。前記（３）工程は、前記基準値と、前記（２）工程において算出した指標ｍＲＮＡ補正値との比較によって、前記被検体の子宮内膜症関連疾患の発症の有無を判断する工程であってもよい。
　つぎに、前記（３）工程について、一例を説明する。なお、本発明は、これには制限されない。
　前記被検体の子宮内膜症関連疾患の発症の有無は、例えば、以下のように判断できる。前記（３）工程においては、予め、子宮内膜症関連疾患の患者（以下、「患者」という）の生体試料における指標ｍＲＮＡ補正値、および、健常者の生体試料における指標ｍＲＮＡ補正値の少なくとも一方を準備しておく。これらの補正値は、前述のように、本発明の検出方法により決定できる。そして、これらの値を発症の有無の基準値とし、これらと、被検体の生体試料における指標ｍＲＮＡ補正値とを比較することによって、子宮内膜症関連疾患の発症の有無を判断できる。前記（３）工程において前記基準値は、その度に本発明の検出方法により決定することもできるが、予め、決定しておいた指標ｍＲＮＡ補正値を基準値として使用することが好ましい。
　前記判断方法について、ＨＲＦｍＲＮＡ補正値を使用した例を以下に示すが、本発明はこれらには制限されない。以下の判断は、β－アクチンｍＲＮＡ発現量（Ｘ）に対するＨＲＦｍＲＮＡ発現量（Ｙ）の比が、Ｙ／Ｘまたはその１００分率（％）で表される場合を例示する。前記被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「健常者の基準値」と比較して高い値を示す場合、特に、有意に高い値を示す場合、例えば、前記被検体は子宮内膜症関連疾患を発症している、発症している可能性が高い、もしくは、ハイリスク者（発症する危険性が高い）であると判断できる。他方、前記被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「健常者の基準値」以下である場合、例えば、被検体は健常者である、発症している可能性が低い、または、発症する危険性が低いと判断できる。「有意に高い値」とは、特に制限されないが、被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が健常者の基準値に対して、例えば、１０％以上高いことを意味し、好ましくは３０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、特に好ましくは１００％以上である。また、前記被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「健常者の基準値（特に上限値）」に対して相対的に高い程、例えば、相対的に発症している可能性が高い、相対的に発症する危険性が高い、相対的に症状が重いと判断できる。前記健常者の生体試料における基準値は、ＨＲＦｍＲＮＡ発現量とβ－アクチンｍＲＮＡ発現量（Ｘ）との比（Ｙ／Ｘ）で表わされる場合、例えば、１以下であり、好ましくは０．８以下であり、より好ましくは０．５以下である。
　前記判断方法のその他の例としては、前記被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「患者の基準値」と重複する場合、例えば、被検体が子宮内膜症関連疾患を発症している、発症している可能性が高い、もしくは、ハイリスク者であると判断でき、他方、被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「患者の基準値」と比較して低い値を示す場合、特に、有意に低い値を示す場合、例えば、被検体が健常者である、発症している可能性が低い、または発症する危険性が低いと判断できる。「有意に低い値」とは、特に制限されないが、被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「患者の基準値」に対して、例えば、２０％以下であることを意味し、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは５％以下であり、特に好ましくは１％以下である。また、前記被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が「患者の基準値（特に下限値）」に対して相対的に高い程、例えば、相対的に発症している可能性が高い、相対的に発症する危険性が高い、相対的に症状が重いと判断することができ、他方、相対的に低い程、例えば、相対的に発症している可能性が低い、または相対的に発症する危険性が低いと判断することができる。ＨＲＦｍＲＮＡ補正値が、ＨＲＦｍＲＮＡ発現量（Ｙ）とβ－アクチンｍＲＮＡ発現量との比（Ｙ／Ｘ）で表わされる場合、前記患者の生体試料における基準値は、例えば、２以上であり、好ましくは１以上であり、より好ましくは０．３以上である。
　さらにその他の判断方法としては、例えば、前記患者の基準値と健常者の基準値との分岐点に基づき判断する方法があげられる。この方法によれば、前記被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が前記分岐点よりも高い場合に、例えば、子宮内膜症関連疾患を発症している、発症している可能性が高い、発症する危険性が高いと判断でき、さらに、前記分岐的よりも相対的に高いほど、例えば、その症状が相対的に重いと判断できる。他方、被検体のＨＲＦｍＲＮＡ補正値が、前記分岐点よりも低い場合には、例えば、健常者である、発症している可能性が低い、または、発症する危険性が低いと判断でき、前記分岐点よりも相対的に低いほど、例えば、相対的に発症している可能性が低い、または相対的に発症する危険性が低いと判断できる。ＨＲＦｍＲＮＡ補正値がＨＲＦｍＲＮＡ発現量（Ｙ）とβ－アクチンｍＲＮＡ発現量との比（Ｙ／Ｘ）で表わされる場合、前記分岐点（基準値）は、例えば、０．３～３であり、好ましくは、０．５～２である。この分岐点は、例えば、発症群（患者群）と非発症群（健常者群）との境界点として一つの値を設定することにより、前記被検体が、発症・非発症という２群のいずれに属するかを判断することもできる。さらに、例えば、前記基準値の決定に使用した生体試料の提供者（患者・健常者）の状態を考慮することによって、より詳細に疾患についての判断を行うこともできる。すなわち、前記生体試料の提供者を、例えば、発症の有無だけでなく、例えば、症状の程度、今後発症する危険性の高さ（発症予備軍）、今後発症する可能性の低さ等で分類し、それぞれのＨＲＦ補正値（基準値）を決定しておく。そして、分類した複数の群の各基準値と、前記被検体のＨＲＦ補正値とを比較すれば、発症の有無だけでなく、例えば、症状の重さ、発症の危険性の高さ、発症の可能性の低さ等についても、より詳細に判断することが可能である。なお、このような判断方法を採用する場合、例えば、従来の方法によって提供者を症状によって分類し、前述の本発明の測定方法により前記提供者由来の生体試料についてＨＲＦｍＲＮＡ測定値を測定すれば足りることから、当業者であれば、本明細書の記載に基づき、各群の基準値をそれぞれ決定することが可能である。
　ＨＲＦｍＲＮＡ補正値が、例えば、β－アクチンｍＲＮＡ発現量／ＨＲＦｍＲＮＡ発現量、または、その１００分率（％）で表される場合は、逆に判断すればよい。すなわち、例えば、被検体の指標ｍＲＮＡ補正値が「健常者の基準値」と比較して低い値を示す場合、特に有意に低い値を示す場合、例えば、被検体は子宮内膜症関連疾患を発症している、発症している可能性が高い、もしくは、ハイリスク者であると判断でき、他方、被検体の指標ｍＲＮＡ補正値が「健常者の基準値」以上である場合、被検体は健常者である、もしくは、発症している可能性が低い、もしくは発症する危険性が低いと判断できる。なお、本発明は、これらの例には制限されず、例えば、疾患指標がアロマターゼの場合も、同様に判断できる。
＜子宮内膜症関連疾患の発症危険度の決定方法＞
　本発明の検出方法により子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現を検出することによって、例えば、以下に示す方法により、子宮内膜症関連疾患の発症の危険度を決定することが可能である。
　本発明の子宮内膜症関連疾患の発症危険度の決定方法としては、例えば、下記（１’）～（３’）工程を含む方法があげられる。
（１’）被検体の子宮内膜細胞を含む生体試料について、本発明の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法により、指標ｍＲＮＡとβ－アクチンｍＲＮＡとを検出する工程
（２’）前記（１’）工程で得られた指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡの検出結果から、β－アクチンｍＲＮＡの検出結果に対する前記指標ｍＲＮＡの検出結果の比（指標ｍＲＮＡ補正値）を算出する工程
（３’）子宮内膜症関連疾患の患者の生体試料におけるβ－アクチンｍＲＮＡの発現量に対する前記指標ｍＲＮＡの発現量の比（指標ｍＲＮＡ補正値）、および、健常者の生体試料におけるβ－アクチンｍＲＮＡの発現量に対する前記指標ｍＲＮＡの発現量の比（指標ｍＲＮＡ補正値）の少なくとも一方を基準値とし、
前記基準値と、前記（２’）工程において算出した指標ｍＲＮＡ補正値とを比較する工程
　本発明の決定方法においては、（３’）工程において、前記基準値と被検体の補正値とを比較することにより、被検体が子宮内膜症関連疾患を発症する危険性の有無、危険性の高さ、危険性の低さ等を判断することができる。前記（３’）工程は、前記基準値と、前記（２’）工程において算出した指標ｍＲＮＡ補正値とを比較することによって、被検体の子宮内膜症関連疾患の発症の危険度を決定する工程であってもよい。なお、前記（１’）～（３’）の工程は、それぞれ、前記診断方法における、前記（１）～（３）工程に対応し、発症危険度を決定する以外は、前述と同様に判断できる。
＜核酸増幅物の製造方法＞
　本発明の核酸増幅物の製造方法は、指標ｍＲＮＡの発現の検出方法に用いる核酸増幅物の製造方法であって、前記検出方法が、前記本発明の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法であり、同一反応系内で、プライマーを用いて、指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡをそれぞれ鋳型とする核酸増幅物を合成する工程を含み、前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、前記β－アクチンｍＲＮＡの核酸増幅を合成するためのプライマーが、前記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび前記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方であることを特徴とする。本発明の核酸増幅物の製造方法は、前記本発明の検出方法における、前述の合成工程と同様に行うことができる。また、使用するプライマーも、例えば、前述と同様である。
＜プライマー試薬＞
　本発明のプライマー試薬は、前述のように、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するプライマー試薬であり、前記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明のプライマー試薬を用いれば、例えば、本発明の製造方法ならびに検出方法をより簡便に行うことができる。
　前記各プライマーは、前記β－アクチン用プライマーであり、具体例は、前述の通りである。本発明のプライマー試薬は、前記β－アクチン用プライマーとして、例えば、前述したフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方を含んでもよいが、両者を一対とするプライマーセットを含むことが好ましい。本発明のプライマー試薬は、例えば、さらに、前記ＨＲＦ用プライマーおよびアロマターゼ用プライマーの少なくとも一方を含んでもよい。前記ＨＲＦ用プライマーおよび前記アロマターゼ用プライマーは、特に制限されないが、具体例は、前述の通りである。本発明のプライマー試薬は、前記ＨＲＦ用プライマーとして、前述したフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方を含んでもよいが、両者を一対とするプライマーセットを含むことが好ましい。本発明のプライマー試薬は、前記アロマターゼ用プライマーとして、前述したフォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか一方を含んでもよいが、両者を一対とするプライマーセットを含むことが好ましい。
＜検出試薬＞
　本発明の検出試薬は、前述のように、子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡに特異的なプローブおよびコントロールｍＲＮＡに特異的なプローブを含み、前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、本発明のコントロール検出用プローブであることを特徴とする。本発明の検出試薬は、β－アクチンｍＲＮＡの検出のために、本発明のコントロール検出用プローブ（β－アクチン検出用プローブ）を含んでいればよく、その他の構成や条件は、特に制限されない。
　前記ＨＲＦ検出用プローブおよび前記アロマターゼ検出用プローブは、それぞれ、特に制限されないが、例えば、前述のような各検出用プローブが使用できる。
　また、本発明の検出試薬は、例えば、さらに、核酸増幅物の合成に使用する試薬を含んでもよく、前述のような、β－アクチン用プライマー、ＨＲＦ用プライマー、アロマターゼ用プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ等を含んでもよい。また、本発明の検出試薬は、検出キットでもよく、この場合、例えば、使用説明書等を含んでもよい。
　さらに、本発明の検出試薬は、例えば、子宮内膜症関連疾患の診断試薬または診断キットとして使用できる。この場合、例えば、健常者群の基準値、子宮内膜症関連疾患の患者群の基準値、子宮内膜症関連疾患の重篤程度でグループ分けされた患者群の基準値等が、情報として添付されていることが好ましい。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。特に記載しない限り、「％」は、ｗ/ｖ％である。
［実施例１］
（ｃＤＮＡの調製）
　非内膜症患者群（ｎ＝７）、月経困難症患者群（ｎ＝１５）および内膜症患者群（ｎ＝１３）から月経血を採取し、Ａｃｉｄ　Ｐｈｅｎｏｌ法により全ＲＮＡを抽出した。そして、得られた全ＲＮＡ（１μｇ）から、ランダムプライマーを用いて１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡを調製し、これを後述するＰＣＲの鋳型とした。
　市販のＰＣＲキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＱＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（登録商標））を使用して、下記表１のＰＣＲ反応液を調製した。なお、下記プライマーで増幅させるβ－アクチンｍＲＮＡは、子宮内膜細胞（例えば、上皮細胞）に発現するβ－アクチンのｍＲＮＡである（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｘ００３５１；Ｊ０００７４；Ｍ１０２７８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
β-アクチン用プライマー
　センス　５’－gctgccctgaggcactct－３’　　　　　　（配列番号８）
　アンチセンス　５’－cggatgtccacgtcacactt－３’　　（配列番号９）
ＨＲＦ用プライマー
　センス　５’－ttcagtcgccatcatgattatctac－３’　　（配列番号１０）
　アンチセンス　５’－gcgatctcccggatcttg－３’　　　（配列番号１１）
ＣＹＰ１９Ａ１用プライマー
　センス　５’－tccttataggtactttcagccatttg－３’　　（配列番号１２）
　アンチセンス　５’－caccatggcgatgtactttcc－３’　（配列番号１３）
β-アクチン検出用プローブ
　５’－CF560－agccttccttcctgggcatggagtc－BHQ1－３’（配列番号２）
ＨＲＦ検出用プローブ
　５’－FAM－cctcatcagccacgatgagatgttctcc－BHQ1－３’（配列番号４）
ＣＹＰ１９Ａ１検出用プローブ
　５’－Quasar　670－ctttgggccccgtggctgtgc－BHQ2－３’（配列番号６）
プローブの標識
ＣＦ５６０：ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ　Ｏｒａｎｇｅ５６０（登録商標）
ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ　Ｈｏｌｅ　Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）
Ｑｕａｓａｒ　６７０：登録商標
　市販の装置ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ　Ｍｘ３００５Ｐ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で１０分を１サイクル行った後、９５℃で３０秒および６０℃で６０秒を１サイクルとして５０サイクル行った。
　得られたＰＣＲ増幅物について、前記各プローブの５’末端に結合させた蛍光色素の検出を行った。検出波長は、各蛍光色素の説明書に基づいて設定した。そして、得られた測定データを、市販のソフト（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）ＭｘＰｒｏ(商標)Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅであるＲＯＸのデータで補正し、自動的にＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値（閾値）を決定した。希釈系列により予め作成した検量線を用いて、各ＰＣＲ増幅物における対象ｍＲＮＡ（ＨＲＦｍＲＮＡ、ＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡ）の発現量を測定した。得られたＨＲＦｍＲＮＡ発現量の測定値およびＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡ発現量の測定値を、それぞれβ-アクチンｍＲＮＡ発現量の測定値で割り、「ＨＲＦｍＲＮＡ／β－アクチンｍＲＮＡ」（以下、ＨＲＦ／β－アクチン）および「ＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡ／β－アクチンｍＲＮＡ」（以下、ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン）を算出した。これらの結果を図１に示す。同図（Ａ）は、非内膜症患者群、月経困難症患者群および内膜症患者群の「ＨＲＦ／β－アクチン」の平均を示すグラフであり、同図（Ｂ）は、非内膜症患者群、月経困難症患者群および内膜症患者群の「ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン」の平均を示すグラフである。
　同図（Ａ）に示すように、「ＨＲＦ／β－アクチン」によると、非内膜症群に対する月経困難症群のＰ値が０．０１２、非内膜症群に対する内膜症群のＰ値が０．０３５であった。また、同図（Ｂ）に示すように、「ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン」によると、非内膜症群に対する月経困難症群のＰ値が０．６９、非内膜症群に対する内膜症群のＰ値が０．４５であった。このように、「ＨＲＦ／β－アクチン」および「ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン」の算出によって、非内膜症群と月経困難症群および内膜症群との間で有意差があることが確認できた。以上の結果より、ＨＲＦｍＲＮＡまたはＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡと、コントロールｍＲＮＡとの比を求めることによって、子宮内膜細胞以外の細胞が含まれる生体試料であっても、従来よりも正確に、非内膜症群であるか、月経困難症群および内膜症群であるかを判断することが可能となった。なお、ＨＲＦ用プローブとして、配列番号５に示すプローブ、ＣＹＰ１９Ａ１用プローブとして、配列番号７に示すプライマーを使用した場合も同様である。
［実施例２］
　前記実施例１とは異なる患者、すなわち、非内膜症患者群（ｎ＝７）、月経困難症患者群（ｎ＝２８）および内膜症患者群（ｎ＝２０）から採取した月経血を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、「ＨＲＦ／β－アクチン」を算出した。これらの結果を図２に示す。同図は、非内膜症患者群、月経困難症患者群および内膜症患者群の「ＨＲＦ／β－アクチン」の平均を示すグラフである。
　図２に示すように、β-アクチンｍＲＮＡをコントロールｍＲＮＡとして、「ＨＲＦ／β－アクチン」を算出した結果、非内膜症群に対する月経困難症群のＰ値は０．００９４であり、非内膜症群に対する内膜症群のＰ値は０．０１４５であった。このように、「ＨＲＦ／β－アクチン」の算出によって、非内膜症群と月経困難症群および内膜症群との間で明らかに有意差があることが確認できた。以上の結果より、指標となるＨＲＦｍＲＮＡとコントロールとなるβ－アクチンｍＲＮＡとの比を求めることによって、子宮内膜細胞以外の細胞が含まれる生体試料であっても、従来より正確に、非内膜症群であるか、月経困難症群および内膜症群であるかを判断することが可能となった。
［実施例３］
　実施例１および実施例２とは異なる患者、すなわち、非内膜症患者群（ｎ＝７６）および内膜症患者群（ｎ＝１０）から採取した月経血を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、「ＨＲＦ／β－アクチン」および「ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン」を算出した。これらの結果、ならびに、補正前のＨＲＦｍＲＮＡ発現量の測定値およびＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡ発現量の測定値を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記表２に示すように、「ＨＲＦ／β－アクチン」を算出した結果、補正前のＨＲＦｍＲＮＡ発現量の測定値と比べ、非内膜症群に対する内膜症群のＰ値は十分に低い値を示した。また、同表に示すように、「ＣＹＰ１９Ａ１／β－アクチン」を算出した結果も、補正前のＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡ発現量の測定値と比べ、非内膜症群に対する内膜症群のＰ値は十分に低い値を示した。以上の結果より、ＨＲＦｍＲＮＡまたはＣＹＰ１９Ａ１ｍＲＮＡとβ－アクチンｍＲＮＡとの比を求めることによって、例えば、試料の採取から分析に供するまでの間に、前記試料に含まれるＲＮａｓｅによってｍＲＮＡが分解されたり、変性した場合であっても、生体試料について、従来よりも正確に、非内膜症群であるか、内膜症群であるかを判断することが可能となった。
　本発明によれば、前述のような本発明のβ－アクチン検出用プローブを使用することによって、同一反応系においても、指標ｍＲＮＡであるＨＲＦｍＲＮＡならびにアロマターゼｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡであるβ－アクチンｍＲＮＡとを、それぞれ優れた信頼性で検出することができる。このように、同一反応系において、指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡの両方を検出できるため、操作が簡便となり、一検体の検出に係る時間やコストを低減できる。また、このような方法によれば、例えば、腹腔鏡検査等のように、患者・医師に多大な労力をかけることなく、容易且つ正確に、子宮内膜症関連疾患の発症を間接的に診断できる。このため、本発明は、例えば、臨床分野において非常に有用といえる。

Claims (33)

  1. 子宮内膜細胞を含有する生体試料における、子宮内膜症関連疾患の指標となるｍＲＮＡの発現を検出する方法であって、
    同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡとを、それぞれに特異的なプローブにより検出する検出工程を含み、
    前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
    前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
    前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号１に示す塩基配列において８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能なプローブおよび前記プローブに相補的な塩基配列からなるプローブの少なくも一方であることを特徴とする検出方法。
  2. 前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号２に示す塩基配列および配列番号３に示す塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲１記載の検出方法。
  3. 前記検出工程において、前記同一反応系内で、ＨＲＦｍＲＮＡ、アロマターゼｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを検出する、請求の範囲１記載の検出工程。
  4. 前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号２に示す塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲１記載の検出方法。
  5. 前記ＨＲＦｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号４に示す塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲１記載の検出方法。
  6. 前記アロマターゼｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号６に示す塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲１記載の検出方法。
  7. 前記プローブが、標識物質で標識化されたプローブである、請求の範囲１記載の検出方法。
  8. 前記各プローブが、異なる検出条件の標識物質で標識化されたプローブである、請求の範囲１記載の検出方法。
  9. 前記検出工程において、前記指標ｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物と前記コントロールｍＲＮＡを鋳型とした核酸増幅物とを検出することにより、前記指標ｍＲＮＡとコントロールｍＲＮＡとを検出する、請求の範囲１記載の検出方法。
  10. さらに、前記生体試料の前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成する合成工程を含む、請求の範囲９記載の検出方法。
  11. 前記合成工程において、同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成する、請求の範囲１０記載の検出方法。
  12. 前記合成工程において、前記指標ｍＲＮＡに特異的なプローブおよび前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブの存在下、同一反応系内で、前記指標ｍＲＮＡおよびβ－アクチンｍＲＮＡを鋳型として、それぞれの核酸増幅物を合成する、請求の範囲１０記載の検出方法。
  13. 前記合成工程および前記検出工程を、同一反応系内で、並行して行う、請求の範囲１０記載の検出方法。
  14. 前記核酸増幅物の合成方法が、逆転写－ポリメラーゼチェーンリアクション法である、請求の範囲１０記載の検出方法。
  15. 前記β－アクチンｍＲＮＡの核酸増幅物を、下記（Ｘ１Ｆ）の塩基配列を含むプライマーおよび下記（Ｘ１Ｒ）の塩基配列を含むプライマーの少なくとも一方を用いて合成する、請求の範囲１０記載の検出方法。
    （Ｘ１Ｆ）配列番号８に示す塩基配列
    （Ｘ１Ｒ）配列番号９に示す塩基配列
  16. ＨＲＦｍＲＮＡの核酸増幅物を、下記（Ｙ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｙ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を用いて合成する、請求の範囲１０記載の検出方法。
    （Ｙ１Ｆ）配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｙ１Ｒ）配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  17. アロマターゼｍＲＮＡの核酸増幅物を、下記（Ｚ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｚ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を用いて合成する、請求の範囲１０記載の検出方法。
    （Ｚ１Ｆ）配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｚ１Ｒ）配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  18. 前記生体試料が、月経血試料である、請求の範囲１記載の検出方法。
  19. さらに、前記検出工程における、前記指標ｍＲＮＡの検出結果と前記β－アクチンｍＲＮＡの検出結果とから、子宮内膜細胞における前記指標ｍＲＮＡの発現量を判断する判断工程を含む、請求の範囲１記載の検出方法。
  20. 前記判断工程において、さらに、前記指標ｍＲＮＡの検出結果と前記β－アクチンｍＲＮＡの検出結果との比を算出し、これを、前記指標ｍＲＮＡの発現量の補正値として決定する、請求の範囲１９記載の検出方法。
  21. 配列番号１に示す塩基配列における８０８番目～９１０番目の領域内にハイブリダイズ可能な塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含み、
    請求の範囲１記載の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法に用いる、コントロールｍＲＮＡを検出するためのプローブであることを特徴とするコントロール検出用プローブ。
  22. 前記プローブが、配列番号２に示す塩基配列および配列番号３に示す塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲２１記載のコントロール検出用プローブ。
  23. 指標ｍＲＮＡの発現の検出方法に用いる核酸増幅物の製造方法であって、
    前記検出方法が、請求の範囲１記載の子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡの発現の検出方法であり、
    同一反応系内で、プライマーを用いて、指標ｍＲＮＡおよびコントロールｍＲＮＡをそれぞれ鋳型とする核酸増幅物を合成する工程を含み、
    前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
    前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
    前記β－アクチンｍＲＮＡの核酸増幅を合成するためのプライマーが、下記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方であることを特徴とする製造方法。
    （Ｘ１Ｆ）配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｘ１Ｒ）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  24. 前記ＨＲＦｍＲＮＡの核酸増幅物を合成するためのプライマーが、下記（Ｙ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｙ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方である、請求の範囲２３記載の製造方法。
    （Ｙ１Ｆ）配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｙ１Ｒ）配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  25. 前記アロマターゼｍＲＮＡの核酸増幅物を合成するためのプライマーが、下記（Ｚ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｚ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方である、請求の範囲２３記載の製造方法。
    （Ｚ１Ｆ）配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｚ１Ｒ）配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  26. 下記（Ｘ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｘ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を含み、
    請求の範囲２３記載の核酸増幅物の製造方法に使用することを特徴とするプライマー試薬。
    （Ｘ１Ｆ）配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｘ１Ｒ）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  27. さらに、下記（Ｙ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｙ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を含む、請求の範囲２６記載のプライマー試薬。
    （Ｙ１Ｆ）配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｙ１Ｒ）配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  28. さらに、下記（Ｚ１Ｆ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーおよび下記（Ｚ１Ｒ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーの少なくとも一方を含む、請求の範囲２６記載のプライマー試薬。
    （Ｚ１Ｆ）配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｚ１Ｒ）配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  29. 子宮内膜症関連疾患の指標ｍＲＮＡに特異的なプローブおよびコントロールｍＲＮＡに特異的なプローブを含み、
    前記指標ｍＲＮＡが、ＨＲＦｍＲＮＡおよびアロマターゼｍＲＮＡの少なくとも一方であり、
    前記コントロールｍＲＮＡが、β－アクチンｍＲＮＡであり、
    前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、請求の範囲２１記載のコントロール検出用プローブであることを特徴とする検出試薬。
  30. 前記β－アクチンｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号２に示す塩基配列および配列番号３に示す塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲２９記載の検出試薬。
  31. 前記ＨＲＦｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号４に示す塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲２９記載の検出試薬。
  32. 前記アロマターゼｍＲＮＡに特異的なプローブが、配列番号６に示す塩基配列およびこれに相補的な塩基配列の少なくとも一方の塩基配列を含むプローブである、請求の範囲２９記載の検出試薬。
  33. さらに、請求の範囲２６記載のプライマー試薬を含む、請求の範囲２９記載の検出試薬。
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