CN108841951A

CN108841951A - 一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的rnase2基因引物对及其试剂盒

Info

Publication number: CN108841951A
Application number: CN201810796997.4A
Authority: CN
Inventors: 冯学兵; 孙凌云; 唐小军
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2018-11-20

Abstract

本发明涉及基因诊断领域，提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的RNASE2基因引物对，该引物特异性好、扩增效率高。本发明还提供了用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，包括正常对照组cDNA样本、实时荧光定量PCR扩增试剂预混料、上述RNASE2基因的引物对、管家基因GAPDH的引物对和去核酸酶水，并给出了具体的引物序列。本发明提供的诊断试剂盒对系统性红斑狼疮的检测特异性达到92％，敏感性达到83％，相比于现有的系统性红斑狼疮诊断试剂盒的特异性和敏感性更高。同时，本发明提供的诊断试剂盒针对RNASE2的基因转录水平进行检测，RNASE2的mRNA在患者体内的半衰期较短，可以及时的反应患者体内疾病的活动性。

Description

一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的RNASE2基因引物对及其试剂盒

技术领域

本发明涉及基因诊断领域，具体涉及一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的RNASE2基因引物对及其试剂盒。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，累及全身多系统，包括肾、皮肤、关节、神经系统、浆膜，是自身免疫病的原型疾病。在SLE患者出现重要器官受累前进行早期诊断及疾病活动性的评估，对于SLE的治疗，对改善患者的生活质量、提高患者生存率具有重大意义。

当前，临床上开展的SLE疾病评估主要是依据一系列临床与实验室指标的组合，非常复杂而难以常规开展，近期有人提出采用疾病相关突变位点检测和自身抗体滴度检测进行判断。检测疾病相关突变位点虽然可以预测罹患 SLE的风险，但是遗传因素仅占其发病原因的30～40％左右，不能够覆盖所有的发病因素；同时，基因的突变位点检测也无法反应患者体内的疾病活动性。自身抗体检测评价患者疾病情况的方法主要应用的是抗核抗体的检测，特异性不足80％，而SLE特异性抗体中，抗dsDNA抗体在患者中的阳性率仅为50～60％，抗Sm抗体的阳性率仅为20～30％，均无法满足SLE诊断的需求。

另外，从DNA水平检测单核苷酸多态性，评价受试者罹患SLE的风险，由于基因组比较稳定，检测结果不能够反应受试者目前疾病的状况。同时，自身抗体在患者体内的半衰期较长，不能很及时的反应患者体内的疾病活动度。前期研究发现通过检测干扰素诱导基因的表达水平，可以用来诊断SLE，但是干扰素诱导基因的表达水平并不随疾病活动性变化而改变，也就是说目前的SLE诊断试剂盒难以实现兼顾诊断特异性和疾病活动度。

发明内容

本发明为了解决现有技术中系统性红斑狼疮诊断方法特异性和灵敏度不高，并且无法即使反应患者体内的疾病活动度问题，提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的RNASE2基因引物对，能够有效提高诊断结果的特异性和敏感性，并可进一步用于检测系统性红斑狼疮的疾病活动情况。

本发明还提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，诊断的特异性高、敏感性好，且能够及时反应患者体内的疾病活动度。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的 RNASE2基因引物对，包括上游引物序列RNASE2-F： CCCCAACAGAAGAAGCAGAC和下游引物序列RNASE2-R：AACCAGCTGGATCAGTTCTCA。

本发明还提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，包括以下组分：

正常对照组cDNA样本、实时荧光定量PCR扩增试剂预混料、上述技术方案所述的RNASE2基因的引物对、管家基因GAPDH的引物对和去核酸酶水；

所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料包括PCR缓冲液、dNTPs、高效Taq酶、Rox惰性参比染料以及去核酸酶水。

优选的，所述管家基因GAPDH的引物对中上下游引物序列如下：

GAPDH-F：ATGGGGAAGGTGAAGGTCG；

GAPDH-R：GGGGTCATTGATGGCAACAATA。

优选的，所述正常对照组cDNA样本为至少50份正常人外周血cDNA 的混合物。

优选的，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料中的PCR缓冲液为 2×PCR缓冲液，所述2×PCR缓冲液包括20mM pH 8.3的Tris-HCl、3mM Mg²⁺和100mM KCl。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的 RNASE2基因引物对，试验表明，本发明提供的引物对扩增效率高、特异性强，采用本发明提供的引物对不仅可以能够提高系统性红斑狼疮诊断的特异性和敏感性，还可以帮助判断疾病活动状况。

本发明还提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，包括实时荧光定量PCR扩增试剂预混料、RNASE2基因的引物对、管家基因GAPDH的引物对和去核酸酶水，并给出了具体的引物序列。本发明所述用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒针对RNASE2 的基因转录水平进行检测，RNASE2mRNA在患者体内的半衰期较短，可以及时的反应患者体内疾病情况。

本发明提供的试剂盒通过对RNASE2基因表达水平进行检测，RNASE2 基因的表达水平能够有效覆盖大多数系统性红斑狼疮的病因并能有效区别于其他自身免疫性疾病，采用的RNASE2基因引物对特异性强，从而相对于常规SLE诊断试剂盒而言本发明提供的诊断试剂盒对系统性红斑狼疮的检测特异性达到92％，敏感性达到83％，相比于现有的系统性红斑狼疮诊断试剂盒的特异性和敏感性更高。

附图说明

图1为实施例2中不同来源的样品RNASE2表达标化值分布情况；

图2为实施例2中系统性红斑狼疮患者体内的疾病活动度与其RNASE2 基因表达标化值的相关性；

图3为RNASE2表达标化值的ROC曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的 RNASE2基因引物对，包括上游引物序列RNASE2-F：CCCCAACAGAAGAAGCAGAC和下游引物序列RNASE2-R：AACCAGCTGGATCAGTTCTCA。

在本发明中，所述RNASE2基因的序列参见登录号为NM_002934.2的核苷酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_002934.2/)。本发明针对RNASE2基因设计了一组特异性高、扩增效率高的引物对，以提高本发明所述试剂盒的检测特异性和敏感度，为获得有效的系统性红斑狼疮在患者体内活动情况提供基础。试验表明，本发明提供的RNASE2基因的引物对在扩增效率和特异性方面显著高于其他引物对。

在本发明中，所述RNASE2基因的引物对中，上游引物序列RNASE2-F 如SEQ IDNO.1所示，即CCCCAACAGAAGAAGCAGAC；下游引物序列 RNASE2-R如SEQ ID NO.2所示，即AACCAGCTGGATCAGTTCTCA。

正常对照组cDNA样本、实时荧光定量PCR扩增试剂预混料、RNASE2 基因的引物对、管家基因GAPDH的引物对和去核酸酶水；

所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料包括PCR缓冲液、dNTPs、高效Taq酶、Rox惰性参比染料以及去核酸酶水；

所述RNASE2基因的引物对中上下游引物序列如下：

RNASE2-F：CCCCAACAGAAGAAGCAGAC；

RNASE2-R：AACCAGCTGGATCAGTTCTC。

本发明提供的用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒以检测RNASE2基因的转录水平为目标，根据RNASE2基因的转录水平高低来判断患者是否患有系统性红斑狼疮。与常规的系统性红斑狼疮诊断试剂盒相比，本发明具有以下优点：

1)在本申请中，RNASE2基因的表达是系统性红斑狼疮发病原因之一，是系统性红斑狼疮发病相关的上游基因，检测RNASE2基因的转录水平能够有效提高诊断的特异性和敏感性。

2)在本申请中，RNASE2mRNA在体内的半衰期较短，通过对RNASE2 基因的转录水平检测和计算能够有效判断患者的疾病活动度。

在本发明中，所述RNASE2基因的引物对上下游引物用量优选为各1.2μL/份样品。在本发明中，所述一份样品的量为1.0μL的待测cDNA。

在本发明中，所述管家基因GAPDH起到内参对照的作用，通过管家基因GAPDH可以排除异常代谢情况，当不同样本间的管家基因的表达量无显著差异时对目的基因(RNASE2基因)表达量进行校正，从而使获得的结果更为准确。

在本发明中，所述管家基因GAPDH的序列参见登录号为NM_002046.6

本发明所述引物对中，上游引物序列GAPDH-F如SEQ ID NO.3所示，即ATGGGGAAGGTGAAGGTCG；下游引物序列GAPDH-R如SEQ ID NO.4 所示，即GGGGTCATTGATGGCAACAATA。

在本发明中，所述管家基因GAPDH的上下游引物用量优选为各1.2μL/ 份样品。

在本发明中，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料优选的采用含有包括PCR缓冲液、dNTPs、高效Taq酶、Rox惰性参比染料以及去核酸酶水的市售商品，比如AceQ qPCR SYBRGreen Master Mix等。本发明对此无特殊限定，能够满足实时荧光定量PCR扩增反应的完成即可。

本发明优选的，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料中的PCR缓冲液为2×PCR缓冲液，所述2×PCR缓冲液优选的包括20mM pH8.3的 Tris-HCl、3mM Mg²⁺和100mM KCl。

具体的，还可以根据使用的荧光定量PCR仪器型号具体选择实时荧光定量PCR扩增试剂预混料，比如荧光定量PCR仪器型号为ABI的 StepOnePlus等使用的含有High ROX的扩增试剂，如荧光定量PCR仪器型号为ABI的Q6等则使用含有Low ROX的扩增试剂。

在本发明中，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料用量优选为30μL/ 样品。

在本发明中，所述正常对照组cDNA样本优选为至少50份正常人外周血cDNA的混合物，更优选为50份正常人外周血cDNA的混合物。所述的正常对照组cDNA样本用于作为对照，方便最终检测结果的计算，同时也能减小试验误差。

在本发明中，所述用于用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)取待测cDNA1.0μL、RNASE2基因的上下游引物各0.4μL、实时荧光定量PCR扩增试剂预混料10μL和去核酸酶水8.2μL，共20μL反应体系，进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得RNASE2基因的Ct值；

所述的扩增程序为：95℃预变性10s，95℃变性10s、60℃退火30s，其中变性退火步骤循环40次；

(2)将步骤(1)中RNASE2基因的上下游引物替换为管家基因GAPDH 的上下游引物，按照步骤(1)所述方式进行实时荧光定量PCR，获得GAPDH 基因的Ct值；

(3)将步骤(1)、步骤(2)中的待测cDNA替换为正常对照组cDNA 样本，分别按照步骤(1)和步骤(2)所述方法进行实时荧光定量PCR，获得正常对照RNASE2表达Ct值和正常对照GAPDH表达Ct值；

(4)按照下述公式计算待测样品的RNASE2表达标化值，当所述 RNASE2的表达标化值≥1.53时，则诊断为系统性红斑狼疮：

(5)当所述RNASE2的表达标化值大于1.53时，可以通过带入疾病活动度评价回归方程，判断系统性红斑狼疮在患者体内的疾病活动度；

所述疾病活动度评价回归方程为：

Y＝0.5713*X+1.473

其中X为RNASE2的表达标化值，Y为系统性红斑狼疮的疾病活动度。

Y值越大则系统性红斑狼疮的病情活动度越高，通过检测不同时期的病情活动度可以对治疗药物的有效性进行判断。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.待测样本处理

清晨空腹静息状态下以EDTA静脉真空一次性血常规采血管(美国BDBiosciences)采集静脉全血2～3ml，随即应用RNA全血提取试剂盒(TAKARA, 日本)提取RNA，再以逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)逆转录为cDNA,储存于-70℃备用。

2.实时荧光定量PCR

将备检的cDNA加入96孔板，1μl/孔，分别加入RNASE2和管家基因 GAPDH引物，实时荧光定量PCR扩增试剂预混料(南京诺唯赞生物科技有限公司，AceQ qPCR SYBRGreenMasterMix(High ROX Premixed))，反应体系由以下组分组成：

cDNA 1.0μl，PCR扩增试剂10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，去核酸酶水8.2μl，共20μl。置入ABI Stepone快速实时荧光定量PCR检测系统(美国Applied Biosystems)进行PCR反应。每个基因反应重复3次，扩增条件为首次95℃预变性10秒，之后95℃变性10秒-60℃30秒共进行40 循环反应。

RNASE2基因的引物对如下：

RNASE2-F：CCCCAACAGAAGAAGCAGAC；

RNASE2-R：AACCAGCTGGATCAGTTCTCA；

管家基因GAPDH的引物对如下：

GAPDH-F：ATGGGGAAGGTGAAGGTCG；

GAPDH-R：GGGGTCATTGATGGCAACAATA。

3.数据分析

通过StepOneTM软件(美国Applied Biosystems)获取RNASE2和管家基因GAPDH表达的Ct值，计算3次重复的平均值。按照下列公式计算 RNASE2表达标化值：

所述通过计算RNASE2表达标化值进行结果判断，当表达标化值大于等于1.53时，诊断为系统性红斑狼疮，其敏感性和特异性分别为92％和83％；

当RNASE2的表达标化值大于1.53时，代入疾病活动度评价回归方程：

Y＝0.5713*X+1.473，

其中X为RNASE2的表达标化值，Y为疾病的活动度，计算疾病的活动度。

实施例2

分别采集正常人20份、确诊的系统性红斑狼疮患者(SLE)39份和确诊的其他自身免疫疾病患者20份血样，以SLE患者血样作为系统性红斑狼疮组，正常人血样作为健康对照，其他自身免疫疾病患者的血样作为疾病对照。其中其他自身免疫疾病患者血样包括类风湿关节炎患者血样10份和干燥综合征患者血样10份。

(1)按实施例1所述方法进行检测，获取RNASE2表达标化值，结果如图1所示，与健康对照组相比，系统性红斑狼疮组的RNASE2基因表达显著高于健康对照组，而其他自身免疫疾病血样的疾病对照组的RNASE2基因表达无显著差异(图1，*p<0.05；**p<0.01,ns没有统计差异)。

图1的左图为健康对照、疾病对照和系统性红斑狼疮患者的RNASE2 表达的标化值，可以看出，系统性狼疮患者的RNASE2表达的标化值显著高于健康对照组和疾病对照组。

图1的右图为系统性红斑狼疮患者和健康对照以及类风湿关节炎、干燥综合征疾病对照的的RNASE2表达的标化值，可以看出，类风湿炎关节炎和干燥综合征患者的RNSE2表达标化值与健康对照组比较没有差异。

综上，本发明通过对RNASE2基因表达水平的检测能够有效区分正常人群和其他自身免疫疾病患者。

(2)进一步将获得的RNASE2的表达标化值与样本来源的系统性红斑狼疮患者的SLE疾病活动度(SLEDAI)进行线性相关分析，如图2所示， SLE的疾病活动度与RNASE2基因表达标化值所做的一元线性回归曲线r 值为0.4638，该一元线性回归曲线的回归分析检验显示p＜0.01，即表明系统性红斑狼疮的疾病活动度与RNASE2基因表达标化值间存在显著相关性。

(3)对RNASE2基因表达标化值诊断SLE的敏感性和特异性进行计算，结果如图3所示。

图3中的图左为采用RNASE2表达标化值诊断SLE的特异性和敏感性的ROC曲线；图右为计算该方法诊断SLE特异性和敏感性样本的RNASE2 表达标化值；其中图右的0表示非SLE健康及疾病对照的RNASE2表达标化值，1表示SLE患者RNASE2的表达标化值，右图中的虚线为判断是否为SLE的临界值。

可以看出，与正常人的样本以及其他自身免疫疾病患者的样本相比，系统性红斑狼疮患者的ROC曲线下的面积达到了0.955(95％的可信区间 0.904-1.000)。

进一步计算，采用本发明提供的诊断试剂盒对系统性红斑狼疮患者进行检测的敏感性为83％，特异性为92％。

实施例3

本次试验对本发明提供的RNASE2的引物对特异性进行验证：

1、以本发明提供的RNASE2的引物对作为试验组，其上下游引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

以随机设计的两个RNASE2引物对作为对照组1、2，

其中对照组1采用的引物对2为：

RNASE2-F2(SEQ ID NO.5所示)：GATCAACGACGAGACCCTCC；

RNASE2-R2(SEQ ID NO.6所示):GGAGCTTGGCAGATGAGTGA；

其中对照组1采用的引物对3为：

RNASE2-F3(SEQ ID NO.7所示):ACCTCACAACTCCAAGTCCAC；

RNAE2-R3(SEQ ID NO.8所示):ACCACCGGATACTGTGGAGG。

2、试验过程：

将正常对照组cDNA样本为PCR模板，进行2倍梯度稀释，共稀释5 个梯度，即待测cDNA、分别将待测cDNA稀释2倍、4倍、8倍和16倍后得到的稀释液。

反应体系为：待测cDNA 1.0μl，实时荧光定量PCR扩增试剂预混料10μl (南京诺唯赞生物科技有限公司，AceQ qPCR SYBR Green MasterMix(High ROX Premixed))，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，去核酸酶水8.2μl，共 20μl。置入ABI Stepone快速实时荧光定量PCR检测系统(美国Applied Biosystems)进行PCR反应。每个基因反应重复3次，扩增条件为首次95℃预变性10秒，之后95℃变性10秒-60℃30秒共进行40循环反应。

按照上述方法，将试验组和对照组1、对照组2的引物分别扩增，获得 RNASE2的扩增Ct值。以1/稀释倍数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，计算各组的斜率值。根据下列公式计算各引物对的扩增效率：

扩增效率E(％)＝(10^-1/斜率-1)×100％。

实验组引物扩增的标准曲线为Y＝-3.416*X+24.59，根据公式计算扩增效率为96.2％；对照引物1扩增的标准曲线为Y＝-3.549*X+24.97，根据公式计算扩增效率为91.3％；对照引物2扩增的标准曲线为Y＝-3.486*X+ 24.87，根据公式计算扩增效率为93.6％。

3、试验结果

计算结果显示，试验组引物对的扩增效率为96.2％，对照组1的引物对 2扩增效率为91.3％，对照组2的引物对3扩增效率为93.6％，均显著低于本发明提供的RNASE2基因的引物对。

可见，本发明提供的RNASE2引物对相对于常规设计的引物对具有优异的扩增效率，其特异性更强，能够有效地辅助提高本发明所述试剂盒的特异性和敏感性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京鼓楼医院

<120> 一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的RNASE2基因引物对及其试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccccaacaga agaagcagac 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaccagctgg atcagttctc a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggggaagg tgaaggtcg 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtcattg atggcaacaa ta 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatcaacgac gagaccctcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagcttggc agatgagtga 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acctcacaac tccaagtcca c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accaccggat actgtggagg 20

Claims

1.一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的RNASE2基因引物对，包括上游引物序列RNASE2-F：CCCCAACAGAAGAAGCAGAC和下游引物序列RNASE2-R：AACCAGCTGGATCAGTTCTCA。

2.一种用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，包括以下组分：

正常对照组cDNA样本、实时荧光定量PCR扩增试剂预混料、权利要求1所述的RNASE2基因的引物对、管家基因GAPDH的引物对和去核酸酶水；

3.根据权利要求2所述用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，其特征在于，所述管家基因GAPDH的引物对中上下游引物序列如下：

GAPDH-F：ATGGGGAAGGTGAAGGTCG；

GAPDH-R：GGGGTCATTGATGGCAACAATA。

4.根据权利要求2所述用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，其特征在于，所述正常对照组cDNA样本为至少50份正常人外周血cDNA的混合物。

5.根据权利要求2所述用于系统性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料中的PCR缓冲液为2×PCR缓冲液，所述2×PCR缓冲液包括20mM pH 8.3的Tris-HCl、3mM Mg²⁺和100mM KCl。