CN106868125A - 用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒。本发明通过基因比对发现在幼年型骨质疏松患者和正常人群中DKK1基因存在着明显的突变位点，为1020位点。通过检测这个突变位点，特别是提供的1对特异性引物对，可以特异性的鉴定人体时候患有幼年型骨质疏松症状。该检测方法相对于现有技术的方法具有检测方便，准确快速的优点，适宜于推广使用。

Description

用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒

技术领域

本发明属于检测领域，涉及一种用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。早年一般认为全身骨质减少即为骨质疏松，美国则认为老年骨折为骨质疏松。直到1990年在丹麦举行的第三届国际骨质疏松研讨会，以及1993年在香港举行的第四届国际骨质疏松研讨会上，骨质疏松才有一个明确的定义，并得到世界的公认：原发性骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨胳疾病。每年的10月20日“国际骨质疏松日”。

骨质疏松症分为原发性和继发性二大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(Ⅰ型)、老年性骨质疏松症(Ⅱ型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)三种。绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5～10年内；老年性骨质疏松症一般指老人70岁后发生的骨质疏松；而特发性骨质疏松主要发生在青少年，病因尚不明。随着人口老龄化，患有骨质疏松症的人也越来越多，我国已成为世界上拥有骨质疏松症患者最多的国家。中国内地总患病率为12.4％，老年人中患病比例超过一半以上，其中骨折发生率接近33％。根据世界卫生组织预测，到2050年全球一半以上骨质疏松性髋部骨折病症将出现在亚洲。

骨质疏松症的检测包括实验室检查指标的检测和辅助检测。

实验室检查指标：

骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收)状态，在骨的高转换状态(例如I型骨质疏松症)下，这些指标可以升高，也可用于监测治疗的早期反应。但其在骨质疏松症中的临床意义仍有待于进一步研究。这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、1型原胶原肽、尿吡啶啉和脱氧吡啶啉、I型胶原的N-C-末端交联肽。正如前面所提到的，使用生化指标检测骨质疏松症的精确度不够。

辅助检查：包括骨影像学检查和骨密度检测。辅助检查的对象一般都是骨质疏松症的晚期患者，不能用于早期骨质疏松症患者的筛查。

发明人在前期发表的文章Genome-wide association meta-analysesidentified 1q43and 2q32.2for hip Ward's triangle areal bone mineral density以及文章Association of 3q13.32 variants with hip trochanter and intertrochanterbone mineral density identified by a genome-wide association study也证实了骨密度与多种基因以及不同的调控有很大的关系。但是目前，并没有特别好的标志物可以用于骨密度不合格的患者，特别是幼年型骨质疏松症的诊断。

骨质疏松症患者血钙一般可维持在正常范围之内，因此不能根据血钙水平来诊断骨质疏松症。X线平片是诊断骨质疏松症常用的检查方法，骨质疏松X线平片的主要表现有骨骼的透光度增加、骨质疏松性骨折。骨密度检测是公认的诊断骨质疏松症以及了解疾病进展的方法，还可以监测治疗效果。是目前使用最广泛，也是能比较真实地反映骨骼状态的检查手段。是世界卫生组织推荐的骨质疏松症诊断金标准。但是该方法由于需要特殊的仪器，在一些贫困地区并不能够大面积的推广使用。

基于现有技术中检测骨质疏松症的手段的局限性，寻找一种有效的能够在早期即可诊断骨质疏松症发生的方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种可用于幼年型骨质疏松症(Osterarthritis，0A)早期诊断的试剂盒。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

本发明的技术方案是：本发明提供了检测Dickkopf-1(Dkk-1)基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的试剂盒中的应用。

本发明发现Dkk-1基因，其序列对应于GenBank:AF177394.1，当位点1020位点T突变为G时，导致幼年型骨质疏松症的发生。

在本发明的具体实施方案中，所述针对Dkk-1基因的引物序列如下：针对1020位点T突变为G；检测的正向引物序列如SEQID N0.1所示，反向引物如SEQIDN0.2所示；扩增大小为200bp。

F1020:5’-taaaccagct atccaaatgca-3’；

R1020:5’-cagtaagggactgcaatcac-3’。

本发明提供的一种扩增含有上述相关突变基因的诊断试剂，所述诊断试剂包括，1)DNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血基因组DNA提取；2)PCR扩增体系试剂盒和3)DNA测序体系，所述PCR扩增体系：以外周静脉血提取的基因组DNA为模板，以(a)组引物进行PCR扩增，具中：(a)组引物为F1020和R1020，即对应于SEQ ID NO：1和2；

所述DNA测序体系：将PCR扩增产物直接进行DNA测序，并与原DKK-1基因编码DNA序列对比。

当扩增产物中位点1020位点T突变为G时，导致幼年型骨质疏松症的发生。当突变不存在时，为健康个体。

用于诊断骨质疏松症的DKK-1基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断骨质疏松症的DKK-1基因及其表达产物的来源是血液。

本发明的优点是：

1.本发明首次发现了DKK-1基因表达与骨质疏松症相关，特别是幼年型骨质疏松症。通过检测受试者中DKK-1的表达，可以判断受试者是否患有幼年型骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有幼年型骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；

2.本发明发现了一种新的分子标记物-DKK-1基因，相比传统的复杂、苦难、检测手段，本发明的基因诊断检测方便及时准确，能够有效的用于幼年型骨质疏松症的早期诊断，从而使得幼年型骨质疏松症在早期即可检测出来，降低骨质疏松症的畸形率和对儿童的发育影响。

附图说明

图1为患者1-30的1020位点PCR检测产物测序结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：参见图1所示，实施例1筛选幼年型骨质疏松症患者和正常人中基因变异筛选：

1、研究对象：从苏州大学附属第一医院、苏州大学附属第二医院收集病例样本，具体如下：

幼年型骨质疏松组：抽取医院骨科收治的150例幼年型骨质疏松症患者，男、女各25例，年龄最小20岁，最大50岁。纳入标准：符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。

正常组：选取年龄8-15岁的健康志愿者20例，男女各10例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。

所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。基因组的提取，采用本领域常规的DNA提取方法进行，比如上海生工的血液DNA提取试剂盒即可完成。

2、高通量基因测序以及差异基因的获得

利用超声波仪将各基因组DNA样本随机打断成100-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见:http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文)。文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的步骤进行测序，测序平台为Illumina Hiseq2000,读取长度为90bp，样本的平均测序深度为79.5X。利用Illumina basecalling Softwarel 7对上述获得的原始测序数据进行处理，经过过滤去污染后，使用S0APaligner/S0AP2比对到参考基因组，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp.，确定靶区域的基因型。通过研究比对，发现在在DKK1基因的第1020位点处，幼年型骨质疏松组与正常组存在着1个变异，因此，认定其为幼年型骨质疏松组的鉴定标志物。

实施例二：PCR扩增鉴定

(1)引物设计

根据Genbank中DKK-1基因AF177394.1序列设计PCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如SEQ ID NO：1-2所示。以持家基因作为对照。

PCR反应体系为：DNA模板1μ1，上、下游引物各0.5μ1，PCR Mix l2.5μ1，超纯水补充至25μ1；

PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，57.5℃lmin和72℃lmin的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。

聚合酶链式反应体系购自上海生工。

(2)模板的获得：提取另外的30组幼年型骨质疏松症患者以及10组正常人群的血液DNA，具体方法采用常规的试剂盒提取方法。采用上述的PCR扩增体系以及扩增条件进行扩增。

(3)结果鉴定：将扩增得到的基因产物进行测序，通过图的测序结果可以看出，幼年型骨质疏松症患者血液中均存在第1020位点的突变，正常人群中均没有检测到相应的突变。

从以上结果可以看出，采用1020位点进行鉴定，可以100％的达到相应的鉴定结果，具有非常好的准确性和特异性，可以用于相应的疾病检测。

当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

〈110〉苏州大学

〈120〉用于幼年型骨质疏松症检测的试剂盒

〈210〉1

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉F1020

5’-taaaccagct atccaaatgca-3’

〈210〉2

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉R1020

5’-cagtaagggactgcaatcac-3’

Claims (5)

1.一种试剂盒，其特征在于能够特异性检测幼年型骨质疏松症。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其包含一引物组，序列为SEQ ID NO：1和2。

3.一种幼年型骨质疏松症诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：

⑴DNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血基因组DNA提取；

⑵PCR扩增体系试剂盒；

⑶DNA测序体系，其特征在于：所述PCR扩增体系：以外周静脉血提取的基因组DNA为模板，以(a)组引物进行PCR扩增，其中：(a)组引物组为SEQ ID NO：1和2；

所述DNA测序体系：将PCR扩增产物直接进行DNA测序，并与原DKK1基因编码DNA序列对比；当扩增产物中1020T>G突变存在时，为幼年型骨质疏松症，当突变不存在时，为健康个体。

4.一个引物组，其序列为SEQ ID NO：1和2。

5.权利要求4所述的引物组在制备用于诊断幼年型骨质疏松症的试剂盒中的用途。