CN106591487A - 老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物及其诊断试剂盒 - Google Patents

老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物及其诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物及其诊断试剂盒，用于解决现有老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒灵敏度差的技术问题。技术方案是所述microRNA生物标志物为hsa‑miR‑497‑5p、hsa‑miR‑1290、hsa‑miR‑4299、hsa‑miR‑181c‑5p、hsa‑miR‑320a或hsa‑miR‑204‑3p中的一种或者hsa‑miR‑181c‑5p和hsa‑miR‑4299的组合，或者hsa‑miR‑497‑5p和hsa‑miR‑1290的组合。所述标志物及其引物能够用于诊断试剂盒，用于老年骨质疏松性骨质的诊断，该试剂盒灵敏度高。

Description

老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物及其诊断试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物，还涉及一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒。
背景技术
老年性骨骼退行性改变常常引起骨质疏松症，严重的骨质疏松常可导致骨折的发生，不仅增加了患者的经济负担，并且降低了其生活质量，甚至缩短了寿命。目前用于评估骨质疏松性骨折风险的方法有骨密度检测、FRAX、OSTA等。尽管骨密度、FRAX等方法目前还是骨质疏松性骨折风险预测的主要方法，但其作为临床检测的局限性正在不断显现。骨密度检测依赖各种X线设备，不仅有一定的辐照，而且难以有效地降低患者的检测成本；FRAX及OSTA等在线工具虽然简便快速，但精确度较低，更多地作为家庭自我评估的工具，难以作为临床诊断的参考；血清生化标志物作为骨质疏松性骨折标志物虽然有了一定的应用，但临床缺乏完善的取样、分析质控体系，以及健全的参考数据库，目前并未得到充分应用。随着骨折风险评估研究的不断深入，现有骨折风险评估方法的局限性正在不断凸显。
因此，寻找用于老年性质疏松性骨折风险评估的标志物，不仅有助于完善现行的骨折风险评估方法，也对骨质疏松早期诊断和预防骨折发生、提高老年人群的生活质量有重要的意义。
循环microRNA是一类血液来源的～22nt内源性非蛋白编码RNA，可参与包括骨代谢在内的多种生理和病理学过程。中国航天员科研训练中心李英贤等人发明了一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒，该发明通过对人血清中miR-214的研究发现，miR-214的水平与腰椎骨密度的T值呈明显的正相关，miR-214的水平与骨吸收速率的敏感指标Ⅰ型胶原羧基端(CTX)的量呈明显的负相关。但经检测，miR-214在成骨细胞高表达的小鼠血清中的含量与野生型小鼠相比，并未发生改变，即血清中miR-214水平与骨组织中miR-214水平无相关性。因此，仍不能直接根据人血清中的表达量的多少判定是否患有骨质疏松症。(李英贤，凌树宽，李琦。一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒[P].北京：CN104694639A，20150610)
综上所述，基于现有的技术和方法，一方面缺少直接用于预警或诊断老年性骨质疏松性骨折的诊断标志物，即缺少将骨组织来源的microRNA与血清中microRNA结合起来，筛选老年性骨质疏松性骨折的诊断标志物。另一方面，在实际应用过程中，几种诊断标志物的联合使用会提高诊断的特异性与灵敏度。针对老年性骨质疏松性骨折的诊断试剂盒的研发迫在眉睫。
发明内容
为了克服现有老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒灵敏度差的不足，本发明提供一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物及其诊断试剂盒。所述microRNA生物标志物为hsa-miR-497-5p、hsa-miR-1290、hsa-miR-4299、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-320a或hsa-miR-204-3p中的一种或者hsa-miR-181c-5p和hsa-miR-4299的组合，或者hsa-miR-497-5p和hsa-miR-1290的组合。所述标志物及其引物能够用于诊断试剂盒，用于老年骨质疏松性骨质的诊断，该试剂盒灵敏度高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物，其特点是：包括hsa-miR-497-5p、hsa-miR-1290、hsa-miR-4299、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-320a或hsa-miR-204-3p的任一种或者任几种组合，所述标志物用于老年骨质疏松性骨折诊断试剂盒中的诊断标志物。
一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特点是：包括用于扩增上述诊断标志物的引物，以及从血清中提取microRNA的试剂，其中所述用于扩增上述标志物的引物为反转录引物和cDNA的扩增引物，以及内参基因5S的上游引物序列和下游引物序列。
上述的诊断试剂盒用于老年骨质疏松性骨折的诊断。
其中，上述的试剂盒中hsa-miR-497-5p，hsa-miR-1290，hsa-miR-4299，hsa-miR-181c-5p，hsa-miR-320a，hsa-miR-204-3p的反转录引物序列分别为：
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacaaa，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactccctg，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgcctct，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcgccc，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacactcac，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacgtcc。
上述的cDNA扩增引物的上游引物序列分别为：ttattcggcagcagcacactgtg，aaggcggcggtggatttttggat，attattccgccgctggtgacatg，cggcgataacattcaacctgtcg，cggcgataacattcaacctgtcg，gcgcagctgggaaggcaaag。下游通用引物序列为：atccagtgcagggtccgagg。
内参基因5S的上游引物序列和下游引物序列分别为：tcgtctgatctcggaagctaa，aagcctacagcacccggtat。
所述的骨质疏松性骨折诊断试剂盒还包括：逆转录酶、缓冲液、Taq酶和RNA-free水。
本发明的有益效果是：(1)用于该试剂盒中的诊断标志物，不同于背景技术分子标志物，血清中microRNA稳定性好，样品存放无特殊要求；同时，诊断的精确性和灵敏性也有显著提高。(2)血清采集方便，诊断步骤简单，价格低廉。(3)microRNA诊断试剂盒可以动态监测老年骨质疏松患者的病情进展，为临床医生快速诊断病情提供依据，同时也为小分子药物的合成奠定重要基础。
总之，将骨组织来源的microRNA和循环microRNA结合起来，通过比较血清中microRNA在老年性骨质疏松患者样本和正常人样本中的表达差异，筛选出可作为骨质疏松性骨折的诊断标志物。充分显示了microRNA作为诊断标志物的应用前景，揭示了其用于临床筛查和诊断的价值。因此，通过血清生物诊断标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使骨质疏松性骨折诊断，以及骨质疏松动态监测更具可行性，为临床医生快速准确掌握患者病情以及临床治疗效果评价奠定基础，并为开发具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供依据。该组诊断标物的发现及其相应诊断试剂盒的研制同时推进了临床疾病诊断学和治疗学的发展。
以下结合附图和实施例详细说明本发明。
附图说明
图1是老年骨质疏松血清样本中和正常血清样本中microRNA的含量检测；
图2是显示老年骨质疏松血清样本中和正常血清样本中microRNA单独的ROC曲线；
图3是显示hsa-miR-4299和hsa-miR-181c-5p组合的ROC曲线；
图4是显示hsa-miR-1290和hsa-miR-497-5p组合的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1：骨组织中筛选与骨质疏松性骨折的相关microRNA。
1.老年骨质疏松性骨折患者骨组织样本的收集。
从2014年7月至今，本项目组从甘肃省人民医院、兰州大学第二医院、甘肃省中医院、甘肃省中医学院附属医院、西安交通大学附属红会医院收集了原发性膝关节病、腰椎骨折、腰椎间盘突出、髋部/股骨骨折患者外科术中移除的骨组织111例(含男性和女性)，并获取了详细的病理信息，部分患者进行了访谈获取了既往病史、治疗史等信息。样本妥善保存在-80℃后，对照患者病历，依照入组标准对样本进行筛选，获得可用于骨组织提取RNA实验的样品。
2.骨质疏松性骨折患者骨组织microRNA表达谱芯片实验。
基于前期收集的绝经后骨质疏松性骨折患者(60岁组，n＝45；90岁组，n＝45)骨组织样本，法提取骨组织总RNA，并对RNA纯度、浓度进行验证(吸光度A260/280≈2.0，A260/230≈2.0，浓度>100ng/μL)。使用基于miRBase Release 21.0的microRNA4.0Array(AffymetrixTM，北京博奥晶典生物技术有限公司)，检测患者骨组织中的microRNA表达谱。对表达谱芯片实验获得的数据，使用cluster 3.0和treeview对microRNA进行聚类分析，筛选差异表达倍数(fold change)大于2.0的microRNAs；再根据GeneOntology功能注释以及KEGG生物信号通路分析，从差异表达的microRNAs中筛选出了17个与骨代谢相关的microRNAs。
3.定量检测骨质疏松性骨折骨组织样本及正常骨组织样本中的microRNA。
3.1骨组织总RNA提取。
将上述收取临床手术中弃除的骨组织，分为60岁和90岁年龄组，排除不符合标准的样本，最后每组各有45例入选，组织收取后立即冻存于-80℃冰箱。提取RNA时，取出-80℃冻存的骨组织，置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮速冻后迅速研磨成粉末。将粉末转移至试剂，氯仿抽提、异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤挥干后，加入RNase free无菌水溶解RNA，使用紫外分光光度计对RNA样品进行质检，确保所有样本的A260/280≥1.80，RNA总量≥1μg；经1％琼脂糖电泳、70V、25min检测，确保电泳条带清晰，28S：18S rRNA条带亮度大于或接近1：1。
3.2RNA样品反转录及real time PCR。
取出-80℃冻存的质检合格的骨组织总RNA样品，采用PrimeScriptTM RT reagentKit(Perfect Real Time)反转录试剂盒，以1μg total RNA/20μL反应体系，依照试剂盒说明书反转录合成cDNA。在95℃、30s，变性：95℃、10s；60℃、30s，44个循环的条件下，以U6为内参，使用Bio-Rad CFX96PCR仪检测与老年性骨质疏松性骨折相关的microRNA的表达水平。
3.3结果分析。
qPCR验证上述筛选出的microRNA：得到以下17种microRNA在老年骨质疏松样本中存在差异表达包括：hsa-miR-1290，hsa-miR-486-3p，hsa-miR-20b-5p，hsa-miR-210-3p，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4299，hsa-miR-320a，hsa-miR-497-5p，hsa-miR-100-5p，hsa-miR-138-5，hsa-miR-182-5p，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-125b-2-3p，hsa-miR-152-3p，hsa-miR-204-3p，hsa-miR-181c-p。
实施例2：血清临床样本的采集和制备。
1.对象及方法。
1.1样本及来源。
获得患者的知情同意后，在西安市红会医院收集30例BMD>-2.5的无骨质疏松的健康人以及30例BMD<-2.5的骨质疏松患者血液。血液采集后，记录患者病历的详细信息，包括既往疾病史、治疗史，以及最新的T Score等诊断信息。并记录患者年龄、民族、学历、工作等个人信息，以及饮酒、吸烟、饮食等必要的生活习惯信息。
排除标准：50岁以下，同时患有心血管疾病、癌症、类风湿性关节炎以及其它可能导致骨骼系统病变的遗传性、营养性疾病；长期吸烟导致的肺部疾病；严重酗酒造成的肝脏疾病；过去3年内接受过骨科手术，或有过双膦酸盐、激素、钙制剂治疗史；患有由职业或生活环境可能导致的慢性疾病；其它可能导致骨骼系统病变的情况。
1.2血清样本采集及处理。
抽取清晨空腹静脉血3ml，放入不含抗凝剂的采样管中，两小时内，于4℃离心机中5000rpm，离心10分钟。取上清1ml于1.5ml RNase-free EP管中，置于-80℃冰箱保存。
2.主要仪器及设备。
超净工作台(苏净集团安泰有限公司)，高速冷冻离心机(Thermo Scientific)，紫外分光光度计nano(IMPLEN)，-80℃超低温冰箱(澳柯玛)，PCR仪(VERITI)，实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD)。
3.主要实验试剂。
血清microRNA提取分离试剂盒(TIANGEN)：裂解液MZA，去蛋白液MRD，漂洗液RW，RNase-Free miRelute(含2ml收集管)，RNase-Free ddH2O，PrimeScriptTM RT ReagentKit试剂盒(大连宝生物TaKaRa)中的反转录试剂：5×PrimeScript Buffer(for RealTime)，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ，Random 6mers以及上述六种microRNA的茎环法反转录引物；定量PCR试剂：2×SYBR GREEN Taq MIX，以上所述的六种microRNA的上游引物及下游引物，RNase-Free ddH2O。
实施例3:定量检测正常血清样本及骨质疏松血清样本中的microRNA。
1.血清中microRNA的提取。
血清中microRNA的提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，提取的RNA通过使用微量紫外分光光度计测定浓度，并获得260/280nm的OD值。
2.定量检测血清样本的microRNA。
2.1反转录RNA为cDNA。
按照如下体系配制反应液(反应液配制在冰上进行)如下：
表1：microRNA反转录体系
5×PrimeScript Buffer(for Real time) 2μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μl
特异microRNA引物(50μM) 0.5μl
Random 6mers(100μM) 0.5μl
Total RNA 0.5μg
RNase Free dH2O up to10μl
反转录反应条件如下：37℃15分钟(反转录反应)，85℃5秒(反转录酶失活反应)。
3.qPCR定量检测microRNA含量。
3.1qPCR实验。
实时定量PCR实验使用仪器Bio-Rad CFX96 PCR仪，在96孔板内完成。对cDNA原液稀释11倍作为模板，5S作为内参，按如下方法进行操作。qPCR反应体系如表2。
表2：qPCR反应体系
对于每一组的样品实验设置三个复孔，所有的加样过程均在冰上进行并避光。qPCR的反应程序如下：
表3：qPCR反应程序
3.2数据处理。
3.2.1qPCR数据处理。
根据内参5S和目标microRNA的Ct值，用2–ΔΔCT的经典方法计算microRNA在血清中的相对含量。由此得到的分析结果是通过内参基因5S表达水平校准的实验组样本中目的基因相对于对照组样本的增加或减少的倍数，使用内参基因校准目标基因表达的目的是为了弥补不同样本中模板量的差异。
3.2.2统计分析。
使用Graph Pad Prism5统计软件进行数据处理，采用t检验的方法，以mean±SD表示。P<0.05为差异具有统计学意义。
3.3结果分析。
参照图1：本研究对骨质疏松及非骨质疏松患者血清样本中目标microRNA进行定量分析，以5S作为内参，结果表明：在骨质疏松样血清样本中：hsa-miR-4299，hsa-miR-320a，hsa-miR-204-3p，hsa-miR-181c-5p的表达量上调，hsa-miR-497-5p，hsa-miR-1290表达量下调。
3.4工作特征曲线(ROC)分析。
参照图2-4：构建ROC曲线比较5个血清microRNA区分老年骨质疏松性骨折患者和正常人的诊断能力。5个血清中microRNA ROC曲线下面积(AUC)分别为hsa-miR-1290，0.786(95％置信区间0.582-0.921)，hsa-miR-497-5p，0.976(95％置信区间0.826-1.000)，hsa-miR-4299，0.724(95％置信区间0.511-0.882)，hsa-miR-181c-5p，0.818(95％置信区间0.614-0.942)hsa-miR-204-3p，0.744(95％置信区间0.515-0.903)，hsa-miR-320a，0.836(95％置信区间0.612-0.960)，组合一：hsa-miR-181c-5p和hsa-miR-4299，0.970(95％置信区间0.795-1.000)，组合二：hsa-miR-497-5p和hsa-miR-1290，0.931(95％置信区间0.749-0.994)。在最佳的cut off的值下，microRNA的灵敏度和特异性如下：hsa-miR-1290，分别为：75.00％和78.57％，hsa-miR-497-5p，分别为：100％，91.67％，hsa-miR-4299，分别为：75.00％，76.92％，hsa-miR-181c-5p，分别为：81.82％，71.57％，hsa-miR-204-3p，分别为：100％，46.15％，hsa-miR-320a，分别为：63.64％，100％。组合一：hsa-miR-181c-5p和hsa-miR-4299分别为：100％和84.6％，组合二：hsa-miR-497-5p和hsa-miR-1290分别为：100％和91.7％。
实施例4：老年骨质疏松性骨折诊断试剂盒的制作：
上述实施例表明，hsa-miR-4299，hsa-miR-320a，hsa-miR-204-3p，hsa-miR-181c-5p，hsa-miR-497-5p，hsa-mir-1290在骨质疏松与非骨质疏松血清样本中有显著性差异，具有非常高的特异性。因此，可基于hsa-miR-4299，hsa-miR-320a，hsa-miR-204-3p，hsa-miR-181c-5p，hsa-miR-497-5p，hsa-miR-1290制作老年骨质疏松性骨折诊断试剂盒。试剂盒中应该包括：hsa-miR-1290，hsa-miR-497-5p，hsa-miR-4299，hsa-miR-181c-5p，hsa-miR-204-3p，hsa-miR-320a的引物。
所述的引物包括反转录引物、定量PCR上游引物和通用的定量PCR下游引物，以及内参基因5S的上游引物和下游引物，引物的一种设计如下。除此之外，试剂盒中还应包括逆转录酶、缓冲液、Taq酶、RNA-free水。
表4：引物的一种设计
上述实施例的作用是说明实质性的内容，上述本发明的技术领域方案可以更改。但不脱离本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断标志物，其特征在于：包括hsa-miR-497-5p、hsa-miR-1290、hsa-miR-4299、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-320a或hsa-miR-204-3p的任一种或者任几种组合，所述标志物用于老年骨质疏松性骨折诊断试剂盒中的诊断标志物。
2.一种老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特征在于：包括用于扩增权利要求1所述诊断标志物的引物，以及从血清中提取microRNA的试剂，其中所述用于扩增上述标志物的引物为反转录引物和cDNA的扩增引物，以及内参基因5S的上游引物序列和下游引物序列。
3.一种权利要求2所述的老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特征在于：用于老年骨质疏松性骨折的诊断。
4.一种权利要求2所述的老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特征在于：还包括hsa-miR-497-5p，hsa-miR-1290，hsa-miR-4299，hsa-miR-181c-5p，hsa-miR-320a，hsa-miR-204-3p的反转录引物序列，分别为：
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacaaa，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactccctg，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgcctct，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcgccc，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacactcac，
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacgtcc。
5.一种权利要求2所述的老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特征在于：还包括cDNA扩增引物的上游引物序列，分别为：ttattcggcagcagcacactgtg，aaggcggcggtggatttttggat，attattccgccgctggtgacatg，cggcgataacattcaacctgtcg，cggcgataacattcaacctgtcg，gcgcagctgggaaggcaaag；下游通用引物序列为：atccagtgcagggtccgagg。
6.一种权利要求2所述的老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特征在于：还包括内参基因5S的上游引物序列和下游引物序列，分别为：tcgtctgatctcggaagctaa和aagcctacagcacccggtat。
7.一种权利要求2所述的老年骨质疏松性骨折的血清microRNA诊断试剂盒，其特征在于：还包括逆转录酶、缓冲液、Taq酶和RNA-free水。
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