CN111235267A - 一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统。本发明采用血清miR‑3182作为诊断标志物，通过检测血清miR‑3182表达水平，将患者血清miR‑3182表达水平与健康人血清miR‑3182表达水平进行比较，能够很好地预测脆性骨折的发生概率。

Description

一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统
技术领域
本发明涉及一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统。
背景技术
在骨代谢疾病领域，成骨细胞分化成熟能力与骨密度(BMD)密切相关。低(BMD被认为是引起骨质疏松和骨折的重要危险因素。因此，借助影像学手段对人BMD进行测量就成为诊断骨质疏松的临床诊断指标之一。但是，由于影像仪器的昂贵，为骨质疏松的简易筛查工作带来一定的不便利。近年来，外周血循环miRNA成为疾病微创诊断的研究热点。许多的研究报道miRNA作为诊断标志物具有很高的敏感性和特异性，有越来越多的miRNA标志物成为临床诊断的标志物并用于临床筛查，例如，miR-34a用于肝癌早期诊断，miR-10b用于胶质细胞瘤的初步诊断等。因此，循环miRNA检查可以成为简单易行的筛查手段。许多研究报道循环miRNA以外泌体的方式进行远处“靶向”性调控，与BMD代谢相关的靶点mRNA都可以被内源或外源的miRNA调控。BMD水平与基因表达水平密切相关，在众多可以调节BMD的miRNA中，循环miRNA-mRNA形成的相互作用网络的研究显得非常重要。
发明内容
通过研究，申请人发现通过检测血清miR-3182表达水平可以用来预测脆性骨折的发生概率，从而为预测老年人脆性骨折发生倾向提供依据。基于此，本发明提供了一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于预测脆性骨折发生的试剂，包括检测miR-3182表达水平的试剂。
优选地，所述检测miR-3182表达水平的试剂包括miR-3182的逆转录引物和扩增引物。
优选地，所述miR-3182的逆转录引物如SEQ ID NO:2所示，所述miR-3182的扩增引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述miR-3182表达水平为血清miR-3182表达水平。
本发明还提供了一种用于预测脆性骨折发生的试剂盒，包括上述所述的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括检测内参U6表达水平的试剂。
优选地，所述检测内参U6表达水平的试剂包括U6的逆转录引物和扩增引物。
优选地，所述U6的逆转录引物如SEQ ID NO:5所示，所述U6的扩增引物如SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供了检测miR-3182表达水平的试剂在制备用于预测脆性骨折发生的试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种用于预测脆性骨折发生的系统，包括：
数据输入模块，用于将患者血清miR-3182表达水平值和健康人血清miR-3182表达水平值输入模型计算模块；
模型计算模块，包括风险模型，用于根据患者血清miR-3182表达水平值和健康人血清miR-3182表达水平值以及风险模型计算患者风险值，患者风险值＝患者血清miR-3182表达水平值-健康人血清miR-3182表达水平值；
结果输出模块，用于根据患者风险值预测患者发生脆性骨折的概率；当患者风险值大于0，且小于0.175时，患者发生脆性骨折的可能性较低；当患者风险值大于等于0.175，且小于0.3404时，患者发生脆性骨折的可能性较高；当患者风险值大于等于0.3404时，患者发生脆性骨折的可能性极高。
有益效果：
本发明提供了一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统。本发明采用血清miR-3182作为诊断标志物，通过检测血清miR-3182表达水平，将患者血清miR-3182表达水平与健康人血清miR-3182表达水平进行比较，能够很好地预测脆性骨折的发生概率。
附图说明
图1为miR-3182在GSE63446数据的表达水平。外周血循环miR-3182在BMD中的表达水平(A)，mir-3182对BMD水平的ROC分析(B，AUC＝1.000,**P＝0.0009)。
图2为近期骨折患者和健康志愿者的血清miR-3182水平检测结果。血清miR-3182在近期骨折患和健康志愿者中的表达水平(A)，ROC分析(B)。
图3为检测血清miR-3182的PCR引物对。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不对本发明的保护范围构成限制。如未特别指出，以下实施例中所使用的试剂和仪器均可通过商业渠道获得。为简便起见，以下实施例中的部分常规技术操作的细节并未予以描述，但可以理解的是，其属于本领域技术人员可知晓并实施的范围内。
本发明通过生物信息学分析方法对数据库分析得出血清miR-3182表达水平具有与脆性骨折密切相关的关系(如图1所示)，结合本发明对健康志愿者血清和新近发生骨折的患者血清miR-3182表达水平分析(如图2A所示)，研究结果表明用血清miR-3182表达水平与脆性骨折的发生有重要的生物学机制方面的关联，可以用其血清表达水平来预测脆性骨折的发生概率大小。因此，本发明设计可以检测血清miR-3182的逆转录引物和PCR引物对，如图3所示，通过定量PCR反应检测血清miR-3182表达水平，从而反映脆性骨折发生的可能倾向。
1、设计检测miR-3182的逆转录引物，并合成该引物序列
从基因数据库Ensembl下载成熟的miR-3182的序列：GCUUCUGUAGUGUAGUC(SEQ IDNO:1)。根据序列信息设计其逆转录引物如下：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGACTAC(SEQ ID NO:2)
合成该核苷酸序列(由通用生物系统有限公司合成)并配制引物浓度为10μM。
2、设计检测miR-3182的PCR引物
设计miR-3182的PCR引物序列，上游引物序列为:GCTTCTGTAGTGTAGTC：(SEQ IDNO:3)；下游引物序列为:和GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:4)。
设计U6的逆转录引物为：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO:5)，PCR上游引物序列为：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT(SEQ ID NO:6)；下游引物序列为：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQ ID NO:7)。
合成上述核苷酸序列(由通用生物系统有限公司合成)并配制引物浓度均为10μM。
3、检测人血清miR-3182表达水平
根据TRIzol试剂(Thermofisher，#A33250)说明书提取人血总RNA后，加入miR-3182逆转录引物，按Life Technologies的逆转录试剂盒(#10890010)说明进行逆转录反应。然后取1μl反应产物用PCR试剂盒(#4390937)进行PCR定量分析。反应程序为：94℃10min；40个循环94℃15s，58℃30s，72℃30s；循环结束后72℃10min；然后8℃直至取出反应管。选择U6作为内参基因，计算方法为RQ＝2-△Ct(Ct值为循环数，△Ct＝Ct样本-Ct U6)。
RT反应条件：65℃5min，80℃10min，4℃10min。反应体系如下表1：
表1反应体系
Figure BDA0002408872710000041
Figure BDA0002408872710000051
PCR反应条件：94℃10min；94℃15s，58℃30s，72℃30s，40个循环；循环结束后72℃10min；然后8℃直至取出反应管。PCR反应体系如下表2所示：
表2反应体系
Figure BDA0002408872710000052
4、根据数据库分析结果和实验数据判断脆性骨折发生倾向
从ROC分析结果的敏感性和特异性来看(如图2B所示)，当血清miR-3182表达水平高于健康志愿者平均水平0.1750时，发生骨折的敏感性为92.68％，特异性为70.73％，发生概率的95％置信区间为45.46％-83.87％。当血清miR-3182表达水平高于健康志愿者平均水平0.3404时，发生骨折的特异性为95.12％，发生概率的95％置信区间为83.47％-99.40％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 顺德职业技术学院
<120> 一种用于预测脆性骨折发生的试剂、试剂盒和系统
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gcuucuguag uguaguc 17
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgactac 50
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gcttctgtag tgtagtc 17
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
gcttcggcag cacatatact aaaat 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23

Claims (10)

1.一种用于预测脆性骨折发生的试剂，其特征在于，包括检测miR-3182表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述检测miR-3182表达水平的试剂包括miR-3182的逆转录引物和扩增引物。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述miR-3182的逆转录引物如SEQ ID NO:2所示，所述miR-3182的扩增引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂，其特征在于，所述miR-3182表达水平为血清miR-3182表达水平。
5.一种用于预测脆性骨折发生的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任一所述的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测内参U6表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测内参U6表达水平的试剂包括U6的逆转录引物和扩增引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述U6的逆转录引物如SEQ ID NO:5所示，所述U6的扩增引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
9.检测miR-3182表达水平的试剂在制备用于预测脆性骨折发生的试剂盒中的用途。
10.一种用于预测脆性骨折发生的系统，包括：
数据输入模块，用于将患者血清miR-3182表达水平值和健康人血清miR-3182表达水平值输入模型计算模块；
模型计算模块，包括风险模型，用于根据患者血清miR-3182表达水平值和健康人血清miR-3182表达水平值以及风险模型计算患者风险值，患者风险值＝患者血清miR-3182表达水平值-健康人血清miR-3182表达水平值；
结果输出模块，用于根据患者风险值判断患者发生脆性骨折的概率；当患者风险值大于0，且小于0.175时，患者发生脆性骨折的可能性较低；当患者风险值大于等于0.175，且小于0.3404时，患者发生脆性骨折的可能性较高；当患者风险值大于等于0.3404时，患者发生脆性骨折的可能性极高。
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