CN110468208A

CN110468208A - 一种用于结直肠癌诊断的标志物及其制备的试剂盒

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Publication number: CN110468208A
Application number: CN201910825477.6A
Authority: CN
Inventors: 郭伟; 刘利胜; 宋兴国
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2019-11-19

Abstract

本发明涉及一种基于外泌体microRNA：miR‑99b‑5p的结直肠癌（CRC）诊断的标志物及其制备的试剂盒，属于医疗卫生领域。所述的标志物为血清外泌体miR‑99b‑5p；所述的试剂盒，包括：逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。相比于良性疾病的患者，结直肠癌血清外泌体中的miR‑99b‑5p表达水平显著下降；相比于健康供者，结直肠癌血清外泌体中的miR‑99b‑5p表达水平显著下降。ROC曲线分析显示，AUC为0.628，灵敏度为32.1%，特异性为90.8%；早期结直肠癌血清外泌体中的miR‑99b‑5p表达水平显著下降；手术后结直肠癌血清外泌体的miR‑99b‑5p表达水平显著升高。

Description

一种用于结直肠癌诊断的标志物及其制备的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基于外泌体microRNA：miR-99b-5p的结直肠癌（CRC）诊断的标志物及其制备的试剂盒，属于医疗卫生领域。

背景技术

结直肠癌（CRC）是全球第三大最常见的癌症，每年新增136万例，死亡约70万人。约有50%的结直肠癌患者因晚期疾病（局部或远处转移）而死亡。因此，现在迫切的需要一种较为灵敏的诊断标记物，为结直肠癌的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。

肿瘤细胞来源的外泌体（Tomor-derived exosomes，TDEs）已经被证明可以促进癌症进展，由外泌体介导的细胞间相互作用可能在肿瘤的发生中具有重要的作用。外泌体的分离及其在临床中的使用可替代侵入性手术以诊断CRC，其中在大多数患者中原发性肿瘤组织的可用性是困难的。此外，外泌体内容物如miRNAs，lncRNA，蛋白质等在外泌体膜的保护下免受酶的降解，TDEs易于在血液样本中获得。因此可以在循环血液中被稳定检测到，使其成为诊断结直肠癌发生的理想的肿瘤标志物。

外泌体内包含多种物质，其中研究最为广泛的是miRNA（miRs/miRNAs），它是一类内源性的非编码RNA分子，长约17-24 nt，通过靶向基因的3'-UTR区域发挥生物学功能，由于该区域可参与调节亚细胞定位，核转运和稳定转录本，miRNA分子可调控众多靶基因，目前已经发现约>60％的所有人类基因由miRNA分子调控。先前的研究显示，miRNA在肿瘤发生发展和进展过程中可能作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥功能，这取决于其靶基因的作用，并且它们在许多人类癌症类型中异常表达，包括膀胱癌，胃癌和神经胶质瘤等。总之，这些发现表明miRNA表现出作为癌症治疗的有效治疗靶点的潜力。

现有的临床诊断技术如钡灌肠检查，粪便隐血等无法做到在临床早期发现，而CT、MRI和PET等检查，可以发现更小的肿瘤组织，但其特异性低，仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。结直肠镜的使用可提高了结直肠癌的诊断率，但为介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，也并非结直肠内所有的部位都能取到活检，不适用于大规模的人群筛选普查。液体活检作为新型的检测手段，具有特异性高、无创、快捷等优点，是癌症检查发展的趋势与方向。

发明内容

针对上述问题及现状，本发明提供了一种使用方便、快捷、特异性高的用于诊断CRC的试剂盒。

一种诊断早期结直肠癌的标志物，所述的标志物为血清外泌体miR-99b-5p；

所述的血清外泌体miR-99b-5p的序列为：CACCCGUAGAACCGACC UUGCG。

一种用于区分结直肠癌与良性疾病的的标志物，所述标志物选自血清外泌体miR-99b-5p；所述的血清外泌体miR-99b-5p的序列为：CACCCGUAGAACCGACCUUGCG。

一种观察术前术后血清外泌体变化的标志物，所述标志物选自血清外泌体miR-99b-5p；所述的血清外泌体miR-99b-5p的序列为：CACCCGUAGAACCG ACCUUGCG。

所述标志物来自血清样品。

一种早期诊断结直肠癌体外诊断及预测试剂盒，包括：逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。

所述的内参体系包括内参及其引物；所的内参为miR-U6；所述的引物为针对miR-U6的正向和反向引物。

所述的miR-U6的序列为：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTA AAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT；

所述的针对miR-U6的正向引物为：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC；

所述的针对miR-U6的反向引物为：TGGAACGCTTCACGAATTTGCG。

所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系使用加尾法，其特征在于中包括分别针对miR-99b-5p的正向引物和通用引物；

所述的针对miR-99b-5p的正向引物的序列为：CACCCGTAGAACCGACCTT；

所述的针对miR-99b-5p的反向通用引物购自takara（大连宝生物有限公司）。

上述试剂盒在术前术后血清外泌体变化上的应用。

上述试剂盒在诊断早期结直肠癌上的应用。

上述试剂盒在区分结直肠癌与良性疾病上的应用。

本发明有益效果

1、结直肠癌血清外泌体中的miR-99b-5p表达水平显著下降。

相比于良性疾病的患者，结直肠癌血清外泌体中的miR-99b-5p表达水平显著下降；相比于健康供者，结直肠癌血清外泌体中的miR-99b-5p表达水平显著下降。ROC曲线分析显示，AUC为0.628，灵敏度为32.1%，特异性为90.8%。

2、早期结直肠癌血清外泌体中的miR-99b-5p表达水平显著下降

相比于健康供者，早期结直肠癌患者血清外泌体中的miR-99b-5p表达水平显著下降。ROC曲线分析显示，AUC为0.652，灵敏度为33.3%，特异性为91.5%。

3、手术后结直肠癌血清外泌体的miR-99b-5p表达水平显著升高

首次将结直肠癌患者手术前后的血清外泌体miR-99b-5p作对比，肿瘤占位和血清外泌体miR-99b-5p表达水平呈负相关。

附图说明

图1结直肠癌血清外泌体miR-99b-5p的表达水平图。

图2 miR-99b-5p在早期结直肠癌中的表达水平图。

图3 miR-99b-5p诊断结直肠癌患者的ROC曲线。

图4 miR-99b-5p诊断早期结直肠癌患者的ROC曲线。

图5 结直肠癌患者手术前后血清外泌体miR-99b-5p的表达水平图。

具体实施方式

以下实施用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施案例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施案例1：microRNAs：miR-99b-5p在诊断早期CRC中的应用

1、实验设计

该实验设计为采集山东省肿瘤医院诊断为CRC初治病人以及健康志愿者血清样本，分离富集外泌体并获得外泌体RNA。通过qPCR的方法检测miR-99b-5p表达，统计分析其表达在健康志愿者与CRC、早期CRC之间的差异，并分析其诊断效能。

实验所涉及的病人及样本

纳入山东大学附属山东肿瘤医院于2017年12月至2018年7月收治的153名健康对照者，165名CRC患者，良性疾病患者20名以及随访手术肿瘤患者20名。基于术后病理学检查进行TNM分类。本研究纳入的临床资料主要包括年龄，性别，AJCC肿瘤分期（第8版），饮酒史以及糖尿病史。CRC患者共165例，年龄16-87岁，健康对照者共153例，年龄30-83岁。所有患者均接受结直肠镜检查或手术活检。于化疗，放疗和手术治疗前采集受试者外周血样品约1.5ml，置于不含EDTA抗凝剂的真空管中混匀，并在3，000g，4℃离心15分钟。然后收集血浆样品于离心管中并储存在-80℃，备用。

血清中外泌体miR-99b-5p水平的测定

使用qPCR方法分析CRC的患者和健康志愿者的血清中外泌体miR-99b-5p的表达水平，具体步骤如下：

3.1、外泌体的分离

使用孔径为0.22μm的滤网进行过滤，4°C放置，备用，将血清标本冻融，4°C，10000g，离心30min，弃沉淀，吸上清1ml于超速离心管中，加入1mlPBS，4°C，100000g，离心2h，弃掉上清液，加入0.5 ml TRIzol Reagent，-80°C保存。

总RNA的提取

将加有0.5 ml TRIzol Reagent的外泌体样本从-80℃冰箱中取出，融化。加入100 μL三氯甲烷，震荡混匀，孵育10 min。4℃ 12000 g离心15 min（混合物分离成下层红色酚-氯仿液相，中间层为白色絮状物，上层为无色的水相，RNA分布于水相中）。用移液器将上层水相转移至新无RNase EP管内（注意不要吸到中间层）。加入250 μL异丙醇，孵育10min后，4℃12000 g离心10 min，出现白色可见RNA沉淀物，去除上层液体。加入750 μL 75%乙醇，震荡混匀，4℃7500 g离心5 min，洗涤RNA，去除上层液体。空气干燥RNA管5 min～10 min，加入15μL～20 μL无RNase水溶解RNA，用移液器反复吹打，55～60℃水浴孵育5 min～10 min，使RNA充分溶解。将RNA样品置于-80℃保存备用。用ASP-3700分析软件检测样品浓度和纯度。

逆转录反应及qPCR

(1)逆转录反应：将5μl 2×mRQ Buffer，1.25μl mRQ Enzyme，3.75μl总RNA混匀，37°C孵育 1h，85°C孵育5 min

表1 逆转录反应体系

(2)qPCR反应：于生物安全柜内，将以上配置完成的反应液，分别加入相对应的PCR扩增板的孔内，注意避免污染，之后附上透明膜。注意每个样本均做1个副孔，实验重复3次。小心离心，并混匀。上机操作，使用LightCycler 480定量PCR仪进行检测，按下表设定的程序进行反应。

表2 PCR反应条件

(3)内参体系反应：以U6基因作为内参基因；具体反应体系如下：10μLSYBR GreenMaster Mix荧光染料、0.8μL正向引物、0.8 μL 反向引物、2 μL cDNA 溶液、6.4 μL 无核酶水；反应条件见表2

4、数学统计分析

使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计量资料比较若服从正态分布用参数检验并以平均数±标准差表示；若不服从正态分布用非参数检验用Mann-Whitney 检验并以中位数，四分位间距表示。三组之间的比较使用DKruskal-Wallis Htest。使用二元逻辑回归建立诊断组合，通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）和曲线下面积（AUC）确定差异表达的miR-99b-5p。以p＜0.05为差异有统计学意义。

病例特征总结以及与miR-99b-5p表达水平之间的关系

表3结果分析了165例CRC患者的临床特征，包括年龄，性别，饮酒状况，组织学类型和肿瘤分期。MiR-99b-5p的表达水平与年龄，饮酒状况和组织学类型等无关，与性别有关。

表3CRC病例特征总结以及与miR-99b-5p表达水平之间的关系

6、血清外泌体miR-99b-5p在健康志愿者与结直肠癌患者水平差异

采用qPCR的方法对结直肠癌患者和健康供体的血清外泌体的miR-99b-5p水平进行定量，以确定miR-99b-5p是否可作为诊断结直肠癌的生物标记物。结果显示miR-99b-5p的表达水平在结直肠癌患者中均显著降低，差异具有统计学意义（p<0.0001），见图1。同理，采用qPCR的方法对早期结直肠癌患者和健康供体的血清外泌体miR-99b-5p水平进行定量，以确定血清外泌体miR-99b-5p是否可作为诊断早期结直肠癌的生物标记物。结果显示miR-99b-5p的表达水平在早期结直肠癌患者中均显著降低，差异具有统计学意义（p<0.0001）见图2。

曲线分析血清外泌体miR-99b-5p对结直肠癌的诊断效能

本发明进而利用ROC曲线分析，检测miR-99b-5p对结直肠癌的诊断效能， ROC曲线分析显示，AUC为0.628，灵敏度为32.1%，特异性为90.8%，见图3。

曲线分析血清外泌体miR-99b-5p对早期结直肠癌的诊断效能

本发明进而利用ROC曲线分析，检测miR-99b-5p对早期结直肠癌的诊断效能，ROC曲线分析显示，AUC为0.652，灵敏度为33.3%，特异性为91.5%，见图4。

手术后结直肠癌血清外泌体的miR-99b-5p表达水平显著升高

本发明首次提出将结直肠癌患者手术前后的血清外泌体miR-99b-5p作对比，手术后结直肠癌血清外泌体的miR-99b-5p表达水平显著升高(p=0.0058)，见图5。

序列表

<110> 郭伟

<120> 一种用于结直肠癌诊断的标志物及其制备的试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

cacccguaga accgaccuug cg 22

<210> 2

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60

ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt 107

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

ggaacgatac agagaagatt agc 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

tggaacgctt cacgaatttg cg 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

cacccgtaga accgacctt 19

Claims

1.一种诊断早期结直肠癌的标志物，其特征在于，所述的标志物为血清外泌体miR-99b-5p；所述的血清外泌体miR-99b-5p的序列如SEQ No.1所示。

2.一种用于区分结直肠癌与良性疾病的的标志物，其特征在于，所述标志物选自血清外泌体miR-99b-5p；所述的血清外泌体miR-99b-5p的序列如SEQ No.1所示。

3.一种观察术前术后血清外泌体变化的标志物，其特征在于，所述标志物选自血清外泌体miR-99b-5p；所述的血清外泌体miR-99b-5p的序列如SEQ No.1所示。

4.根据权利要求1-3所述的标志物，其特征在于，所述标志物来自血清样品。

5.一种采用权利要求1-3所述的标志物制备的试剂盒，其特征在于，包括：逆转录反应体系、荧光定量PCR反应体系和内参体系。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的内参体系包括内参及其引物；所的内参为miR-U6；所述的引物为针对miR-U6的正向和反向引物；

所述的miR-U6的序列如SEQ No.2所示；

所述的针对miR-U6的正向引物如SEQ No.3所示；

所述的针对miR-U6的反向引物如SEQ No.4所示。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系使用加尾法，其特征在于中包括分别针对miR-99b-5p的正向引物和通用引物；

所述的针对miR-99b-5p的正向引物的序列如SEQ No.5所示。

8.权利要求5所述的试剂盒在术前术后血清外泌体变化上的应用。

9.权利要求5所述的试剂盒在诊断早期结直肠癌上的应用。

10.权利要求5所述的试剂盒在区分结直肠癌与良性疾病上的应用。