CN101988120A - 一种利用血清中的微小核糖核酸诊断肝癌的新技术 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于评价受试者肝癌状态的微小核糖核酸的组合，包含受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸。一种评价受试者的肝癌状态的方法，包括测定受试者的血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸。一种用于评价受试者的肝癌状态的试剂盒，包含测定受试者的血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸的工具。一种评价受试者的肝癌状态的生物芯片，包含测定受试者的血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸的元件。本发明能够用于肝癌的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价等方面。

Description

一种利用血清中的微小核糖核酸诊断肝癌的新技术
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人血清微小核糖核酸分子的分离，定性和定量分析。同时也涉及肝癌的各种临床指征。具体来说它是一种利用血清中的微小核糖核酸的特殊变化诊断肝癌，预测肝癌发病过程，判断并发症的发生，复发的几率，及肝癌的预后，并分析药效和疗效的新技术。
二、技术背景
微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中，目前已在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸。
微小核糖核酸在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用，其序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使之成为信使RNA强有力的调控因子。微小核糖核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对分子进行更迅速更有效调节的新方式，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。微小核糖核酸的发现也是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充，它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其生长发育等方面的重要问题。
微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，如生长发育、细胞调亡以及脂肪代谢等等。同时，微小核糖核酸也与许多病理情况存在千丝万缕的联系。已有研究表明，在慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中有几种微小核糖核酸均有不同程度的下调；并且，研究人员通过对人肺癌、肝癌等癌组织中微小核糖核酸表达谱分析比较，发现每一种肿瘤都有若干特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化，这些现象提示了肿瘤发生和微小核糖核酸表达之间存在相关性。亦有研究证明，微小核糖核酸在心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展中扮演重要角色。此外，微小核糖核酸还与二型糖尿病等代谢性疾病有关联。鉴于这些疾病发生的分子生物学本质是基因表达调控的紊乱，我们猜想微小核糖核酸这一类调控基因表达小分子标志物的变化很可能是疾病发生与发展的一个核心因素，对微小核糖核酸的研究与分析将为疾病的诊断与治疗提供新途径。
微小核糖核酸与疾病的关联有两个层面：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都有可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸发生了紊乱表达，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可以是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。总之，微小核糖核酸完全可以作为一种新的疾病标志物，其在疾病过程中发生的特异性变化，可以帮助疾病定性，诊断疾病的发展阶段或分析疾病治疗过程中的药效和疗效。微小核糖核酸应用于临床医学将具有巨大的前景和经济效益。
目前对疾病进行临床诊断的生物化学及分子生物学手段还比较繁琐和粗糙，比如对于癌症的诊断，需要将手术标本进行组织细胞学染色检验，过程复杂并且耗时耗力。此外，目前尚没有一套早期预测及诊断重症疾病的方法。鉴于目前疾病诊断方法的单一以及早期发现与预判的困难，我们亟待找到一种比目前现有方法都更简单可靠同时又简单易行的新方法来鉴定疾病的发生以及判断病理阶段。我们选取血清中的微小核糖核酸作为研究对象，希望通过检测血清中的微小核糖核酸解决临床早期诊断等问题。检测血清中的微小核糖核酸有以下几个优势：首先，血清相对组织较易获得，甚至在平常体检中都可以收集到；其次，血清中的微小核糖核酸反映的是机体整体的生理病理情况，其检测结果具有指导意义；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的组织器官的病变，因此其又可以作为疾病诊断的一个参数。总之，检测血清中的微小核糖核酸，简单易行且效果优越，从血清中的微小核糖核酸的特异性变化这一新角度出发发现疾病并且区分程度，将建立一种更敏感更精确的用于疾病早期确诊的全新技术。
我们已经发现并证实血清、血浆中稳定地存在微小核糖核酸，每一种疾病都有其特定的变化图谱，且该种变化能被简单的方法检测到。该项发明已经申请了国内和国际专利。本申请是专门针对肝癌的诊断试剂盒的申请。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是制备一种将血清中的微小核糖核酸的特异性变化应用于鉴定肝癌的PCR试剂盒，以提高肝癌的早期发现率以及确诊的准确性。
本发明的技术方案为：用定量PCR技术检测所有的血清中微小核糖核酸在肝癌时的变化趋势及变化量，将发生明显且稳定变化的那部分微小核糖核酸筛选出来，将其引物收集到定量PCR试剂盒中，就制成了专门针对肝癌的血清微小核糖核酸检测试剂盒。
本发明与原有技术相比，其优势在于：一、简单易行，成本低廉。二、特别适用于早期诊断。三、输出的结果简单明了。
四、附图说明
附图1为在正常人血清中能检测到的部分微小核糖核酸的RT-PCR的实验图。
附图2为病人血清中部分微小核糖核酸相对于正常人血清中微小核糖核酸的变化量。
五、具体实施方式
1、血清中的微小核糖核酸的RT-PCR
首先必须确定微小核糖核酸在血清中能检测到，我们使用了RT-PCR技术证明血清中不仅能检测到微小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为：收集正常人及某些病人的血清；之后的操作有两种方案，一种方案为将10μl血清作为buffer直接逆转录，另一种为提取血清的总RNA，使用的试剂是TRIzol reagent(invitrogen)，10ml血清通常能富集约10μg左右的RNA；之后为逆转录，加入4μl 5×AMV buffer，2μl 10mM each dNTP mixture(Takara)，0.5μl RNase Inhibitor(Takara)，2μl AMV(Takara)以及1.5μl基因特异性反向引物混和物，将混合液16℃孵育15min，42℃反应60min以进行逆转录，85℃孵育5min使AMV酶失活；最后为PCR及电泳：将cDNA按1/50稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.3μlTaq酶(Takara)，0.2μl 10μM正向引物，0.2μl 10μM通用反向引物，1.2μl 25mMMgCl2，1.6μl 2.5mM each dNTP mixture(Takara)，2μl 10×PCR buffer，13.5μlH2O，20μl体系进行PCR。PCR的反应条件是：95℃ 5min进行1个循环→95℃ 15sec，60℃1min进行40个循环。PCR产物取10μl在3％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，UV下观察。
具体实验结果见附图1。附图1a是以正常人血清为研究对象，将血清作为buffer直接逆转并进行RT-PCR的实验结果；附图1b是以正常人血清为研究对象，提取血清RNA进行逆转并进行RT-PCR的实验结果。我们选取了12种微小核糖核酸进行PCR，分别是血细胞特异性的微小核糖核酸miR-181a、miR-181b、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150，来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-1、miR-133a、miR-206，来自脑的微小核糖核酸miR-9、miR-124a，以及来自肝的微小核糖核酸miR-122a。从结果可以看出两种实验方法扩增微小核糖核酸的结果很吻合，PCR产物单一，微小核糖核酸在血清中能正常检测到。但是，并非每个微小核糖核酸在血清中都有高丰度，有些微小核糖核酸是很微量的。
2、血清中的微小核糖核酸的real-time PCR
微小核糖核酸的定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR一样，唯一不同是在PCR的时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪(AppiedBiosystems)，反应条件为95℃ 5min进行1个循环→95℃ 15sec，60℃ 1min进行40个循环。数据处理方法为ΔΔCT法，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CT样品-CT内参。我们将病人(在此为糖尿病病人及骨肉瘤病人)血清样本与正常人血清样本直接进行逆转录，比较了其中所含微小核糖核酸的量，仍旧选取以上提及的12种微小核糖核酸进行PCR。
具体实验结果见附图2。附图2a是糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值，附图2b是骨肉瘤病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值。由结果可知绝大部分微小核糖核酸在发生疾病后会在血清中积聚，可能是通过细胞破裂等途径释放到血清中的，所以微小核糖核酸可以作为一种新的疾病诊疗预测的标志物。
3、专门用于疾病诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒的制作
专门用于诊断预测肝癌的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量PCR技术的，试剂包括常用的Taq酶、dNTP等。此试剂盒的价值在于，用最精简的探针库检测在肝癌发生时微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测肝癌的发生可能或诊断疾病的病理阶段，所以，将此芯片投入实践，可以增加在早期发现肝癌的潜在可能，帮助指导诊断和治疗，把肝癌的确诊和治疗推上一个新的台阶。

Claims (39)

1.一种用于评价受试者肝癌检测标记物，其特征在于该检测标记物是在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟体微小核糖核酸的组合。
2.根据权利要求1所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述血清/血浆取自受试者的活体、组织、器官和/或尸体。
3.根据权利要求1或2所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为测定受试者给予待测物后的肝癌状态。
4.根据权利要求1或2所述所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述肝癌检测标记物用于筛选待测物的预防和/或治疗肝癌的活性。
5.根据权利要求1或2中所述所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为诊断和/或鉴别诊断受试者的肝癌。
6.根据权利要求1或2所述所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为评价对受试者的肝癌进行治疗的有效性。
7.根据权利要求1或2所述所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者发生肝癌进行预测。
8.根据权利要求1或2所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者肝癌并发症的发生和/或的复发进行预测。
9.根据权利要求7所述的肝癌检测标记物，其特征在于所述发生疾病为肝癌。
10.一种评价受试者的肝癌状态的方法，其特征在于，所述方法包括测定以下受试者的血清/血浆中稳定存在且可检测。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述血清/血浆来源于受试者活体、组织、器官和/或尸体。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为测定受试者给予待测物后的肝癌状态。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述方法用于筛选待测物的预防和/或治疗肝癌的活性。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为诊断和/或鉴别诊断受试者的肝癌。
15.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为评价对受试者的肝癌进行治疗的有效性。
16.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者发生肝癌进行预测。
17.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者肝癌并发症的发生和/或复发进行预测。
18.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述测定受试者的血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸的方法选自：RT-PCR方法、Real-time PCR方法、Northern blotting方法、RNase protection assay、Solexa sequencing technology以及生物芯片方法中的一种或几种。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述RT-PCR方法包括以下步骤：
(1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
(2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；
(3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
(4)EB染色后在紫外灯下观察结果。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述Real-time PCR方法包括以下步骤：
(1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；
(2)用微小核糖核酸设计引物；
(3)加入荧光探针进行PCR反应；
(4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。
21.一种用于评价受试者的肝癌状态的试剂盒，其特征在所述试剂盒包含测定下述血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸的工具。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含人血清/血浆中的成熟体微小核糖核酸的引物。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于所述血清/血浆来取自受试者的活体、组织、器官和/或尸体。
24.根据权利要求21至23任一项所述的试剂盒，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为测定受试者给予待测物后的肝癌状态。
25.根据权利要求21至23所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于筛选待测物的预防和/或治疗肝癌的活性。
26.根据权利要求21至23任一项所述的试剂盒，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为诊断和/或鉴别诊断受试者的疾病。
27.根据权利要求21至23任一项所述的试剂盒，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为评价对受试者的肝癌进行治疗的有效性。
28.根据权利要求21至23任一项所述的试剂盒，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者发生肝癌进行预测。
29.根据权利要求21至23所述的试剂盒，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者小细胞肺癌并发症的发生和/或复发进行预测。
30.一种用于评价肝癌状态的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含测定下述血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸的元件。
31.根据权利要求30所述的生物芯片，其特征在于所述血清/血浆取自受试者的活体、组织、器官和/或尸体。
32.根据权利要求30所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含人血清/血浆中的成熟体微小核糖核酸的探针。
33.根据权利要求32所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包含微小核糖核酸相对应的探针。
34.根据权利要求30至33任一项所述的生物芯片，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为测定受试者给予待测物后的肝癌状态。
35.根据权利要求30至33任一项所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片用于筛选待测物的预防和/或治疗肝癌的活性。
36.根据权利要求30至33任一项所述的生物芯片，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为诊断和/或鉴别诊断受试者的肝癌。
37.根据权利要求30至33任一项所述的生物芯片，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为评价对受试者的肝癌进行治疗的有效性。
38.根据权利要求30至33任一项所述的生物芯片，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者发生肝癌进行预测。
39.根据权利要求30至33所述的生物芯片，其特征在于所述评价受试者的肝癌状态为对受试者肝癌并发症的发生和/或复发进行预测。
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