CN105497917A

CN105497917A - miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用

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Publication number: CN105497917A
Application number: CN201510920950.0A
Authority: CN
Inventors: 张嘉宁; 韩逸; 李文利
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明公开了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ？ID？NO.1所示。通过研究发现，miRNA-9在高转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著低于不具有转移能力的小鼠肝癌细胞，同时本发明还发现上调miRNA-9后小鼠肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和黏附能力均减弱。因此认为，miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移，降低小鼠肝癌细胞的恶性程度。针对具有转移能力的小鼠肝癌细胞，将miRNA-9或其类似物miRNA-9的mimic制备成抑制肿瘤转移的药物，或也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。

Description

miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用

技术领域

本发明涉及miRNA-9在制备抑制肝癌转移药物中的应用，属于生物化学与分子生物学技术领域。

背景技术

根据世界卫生组织2014年发布的癌症白皮书，肝癌在我国无论男性或者女性的发病率和致死率都极高，严重地影响了人类的生存和健康。恶性肿瘤细胞与普通肿瘤细胞的区别是前者具有转移能力，其转移能力越高，恶性程度也就越高，越难以治愈。肿瘤的转移机制是一个复杂的网络通路，近年来，随着人们对miRNAs的研究发现，有些miRNAs参与调控肿瘤的发生和发展过程，可以将其作为早期诊断或者早期治疗的分子靶标。

随着糖科学的迅速发展，有关肿瘤与糖基化修饰之间的关系已经越来越多的被科学家证实。唾液酸转移酶属于脊椎动物唾液酸转移酶家族，该家族包括α-2,3，α-2,6，α-2,8唾液酸转移酶3个亚型。其中α-2,6唾液酸转移酶表达在机体许多种细胞的表面，可催化活化的唾液酸以α-2,6糖苷键的形式连接到细胞膜表面的N-乙酰乳糖胺上。唾液酸作为复合糖的组成部分镶嵌于所有细胞表面以及大多数脊椎动物糖蛋白和糖脂分子的末端最外侧。唾液酸介导或调制了炎症、病原感染、肿瘤发生发展等诸多病理过程，与人类疾病密切关联^[1-3]。与正常组织相比较发现，恶性肿瘤组织和恶性肿瘤细胞表面糖链结构发生明显变化。其中，特征连接唾液酸表达的显著上调或下调变化与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后不良等相关，有的作为肿瘤标记物或预后标记物，也可能成为肿瘤免疫治疗的靶点^[4]。

miRNAs是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。自从1993年，Lee等科学家利用遗传分析的方法在秀丽隐杆线虫中发现了miRNA后，科学家开展了大量关于miRNA相关功能的研究。目前已有很多miRNA被鉴定参与细胞癌变、转移等病理过程。如：miR21、miR122、miR182、miR34a、miR138、Let-7c等分别参与乳腺癌、膀胱癌、肺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的发生和转移过程^[5]-[6]。其中，有关miRNA参与调控糖基化修饰的研究也有相关报道。例如，let-7c通过调控甘露糖乙酰基转移酶4的合成(该酶参与了细胞表面糖基化的修饰过程)抑制了小鼠肝癌细胞的转移^[7]来自秀丽线虫中的miR-79与其在哺乳动物中同源的miRNA-9通过调控细胞糖基化修饰过程，影响参与哺乳动物神经元转移的两个靶基因SQV-5和SQV-7的合成^[8]。然而，关于miRNA-9在小鼠肝癌转移中的作用机制还未有报道，包括其靶基因的研究也仅限于少数基因。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达芯片之上，根据芯片结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞(Hepa1-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-P)和高转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，利用RT-qPCR验证芯片结果，找到在三种细胞中存在显著差异的miRNA-9作为研究的基础。接下来，利用westernblotting实验方法发现St6gal1在三种细胞中的表达量同样存在显著差异，并与miNRA-9在三种细胞中的表达差异吻合。为了验证St6gal1是miRNA-9的靶基因之一，设计实验构建了双荧光素酶报告基因，并将miRNA-9的模拟物:miRNA-9mimic与报告基因共转染至Hepa1-6中，通过检测，证实了St6gal1为miRNA-9的靶基因。最后，将miRNA-9的模拟物和抑制物：miRNA-9mimic、miRNA-9inhibitor分别转染到上述三种细胞中，发现miRNA-9的mimic可以抑制St6gal1在三种细胞中的表达量。同时，miRNA-9在细胞中的过表达可以抑制其增殖、迁移、侵袭和黏附能力。因此,miRNA-9具有抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力，可以应用于抑制肿瘤转移药物的开发领域。

具体地，本发明提供一种miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9的序列如SEQIDNO.1所示。

本发明还提供miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义链序列如SEQIDNO.2所示，反义链序列如SEQIDNO.3所示。

在优选的技术方案中，所述miRNA-9或miRNA-9模拟物用于制备抑制肝癌转移药物。

本发明还提供miRNA-9的靶基因，该靶基因为St6gal1。

在本发明所述miRNA-9可以用于制备抑制肝癌等转移性肿瘤转移的药物。具体应用时，可以将miRNA-9的模拟物用于药物设计，也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。

附图说明

图1表示miRNA-9在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞中的相对表达量的real-timePCR结果；

图2表示St6gal1蛋白在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞中的表达量的WesternBlotting实验结果；

图3表示St6gal13’UTR区域中与miNRA-9结合位点；

图4表示双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-9的mimic对St6gal-3’UTR/pGL-3荧光强度的影响；

图5表示转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后St6gal1蛋白在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞中的表达量；

图6表示miRNA-9的模拟物mimic和抑制物inhibitor在Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌细胞的转染效率；

图7表示三种细胞分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后细胞增殖能力的变化；

图8表示Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后细胞迁移能力的变化；

图9表示Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后细胞侵袭能力的变化；

图10表示不同包被浓度下Hca-F和Hca-P细胞与FN、LN、COL的黏附能力显著高于Hepa1-6细胞；

图11表示Hca-F，Hca-P和Hepa1-6三种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC后p-FAK蛋白水平表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达芯片之上，根据芯片结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞(Hepa1-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-P)和高转移能力的小鼠肝癌细胞(Hca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，根据芯片结果的分析，确定候选的miRNA为miRNA-9，其序列为UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA。

本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：

所述肝癌细胞Hepa1-6为小鼠普通肝癌细胞、所述肝癌细胞Hca-P为低转移能力的小鼠肝癌细胞、所述肝癌细胞Hca-F为高转移能力的小鼠肝癌细胞，根据文献(Y.Guoetal.TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,2014,53,1～8)获得。pGl3载体购自(Promega,USA)，pMD-19T载体购自(TaKaRa,Japan)。

miRNA-9的模拟物、抑制物以及相应阴性对照物的名称和序列如表1。

表1.miRNA-9、miRNA-9的模拟物、抑制物以及相应阴性对照物的名称和序列

实施例1

miRNA-9在不同小鼠肝癌细胞中的表达：将对数期的小鼠肝癌细胞Hepa1-6、Hca-P、Hca-F分别贴壁和悬浮培养在含有90％DMEM、90％RPMI1640和10％FBS的全培培养基中，在37℃、5％CO₂的培养条件下培养24h，得到状态良好的小鼠肝癌细胞。收集细胞，通过Trisol法提取细胞中的总RNA。将提取的总RNA反转录得到cDNA，RNA模板的含量为2μg总RNA。将反转得到的cDNA根据进行real-timePCR检测miRNA-9在三种细胞中的表达量，根据试剂盒(Bulge-Loop^TMmiRNAqRT-PCR，RIBOBIO)的说明进行，通过PCR反应扩增扩增miRNA-9。图1为miRNA-9在三种细胞中的相对表达量，可见miRNA-9在Hepa1-6中的表达量显著高于Hca-p和Hca-F，说明miRNA-9的表达量与小鼠肝癌细胞的恶性程度负相关。

实验结果与芯片结果一致，即miRNA-9在不具有转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著高于具有转移能力的小鼠肝癌细胞。

实施例2

为了寻找miRNA-9的靶基因，通过TargetScan、MiRDB等生物信息预测软件找到了感兴趣的靶基因之一：St6gal1，将此作为研究对象。St6gal1是真核细胞生物中高度保守的一个糖基转移酶，其在糖链上的表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。

具体为：将对数期的小鼠肝癌细胞Hepa1-6、Hca-P、Hca-F分别贴壁和悬浮培养在含有90％DMEM、90％RPMI1640和10％FBS的全培培养基中，在37℃、5％CO₂的培养条件下培养24h，收集细胞，分别提取总蛋白质，通过Westernblotting实验，证实了三种细胞中St6gal1的表达，结果如图2所示。结果表明St6gal1在Hca-F的表达量显著高于Hepa1-6和Hca-p，St6gal1在三种细胞中的相对表达量与miRNA-9在三种细胞中的相对表达量存在正确的逻辑关系，说明St6gal1的表达与miNRA-9具有相关性。

为了直接证明St6gal1是miRNA-9的靶基因，构建了双荧光素酶报告基因，设计引物将St6gal13’UTR区域中与miNRA-9结合位点的片段扩增出来(结合位点如图3所示，结合位点用粗体字标注)，并将此段序列连接到pGl-3载体中，然后将其与miRNA-9的mimic共转染到Hepa1-6中。

扩增片段引物设计：

设计引物扩增St6gal1基因(NM_001252505)的3’UTR非翻译区片段，并根据pGl-3载体上的酶切位点选择适合的酶切位点，在引物的5’端和3’端分别加入MμlI和XholI酶切位点，引物分别命名为St6gal1/3’UTR-F(上游引物)St6gal1/3’UTR-R(下游引物)，引物序列如下：

St6gal/3’UTR-F：5’-ACGCGTTATAAGGCATCAGGACTGT-3’

St6gal1/3’UTR-R：5’-CCGCTCGAGGATTTCTGAAAAAGATATT-3’

上述St6gal1基因(NM_001252505)的cDNA序列如SEQIDNo.4，总长度为4177bp。

按照前述方法提取Hepa1-6细胞中的总RNA，反转录得到cDNA，使用PCR扩增试剂盒(TaKaRaPCRAmplificationKit,Japan)扩增目的片段。PCR体系如下所示：

PCR条件为：95℃，预变性4min；94℃变性40s，60℃复性40s，70℃延伸60s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

反应结束后，PCR反应产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带进行切胶回收步骤，收集目的片段(即St6gal1的3’UTR片段)，测序，序列如SEQIDNo.5，长度239bp。将目的片段与克隆载体pMD-19T在16℃下过夜连接，目的片段和pMD-19T分别用MμlI和XholI进行双酶切后，进行连接，连接体系如下：

将连接产物转化至制备好的感受态细胞E.coliJM109中，具体方法如下：

(1)取200μl感受态细胞溶液，加入10μl连接产物，混匀，于冰上30min；

(2)42℃水浴90秒钟热激，放置于冰水中2min；

(3)加入37℃预热培养基(无抗性)振荡培养50min；

(4)取出50μl转化物涂于含Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板放置于孵箱中，37℃培养过夜。

筛选阳性克隆：

(1)随机挑取平板上独立的圆滑的菌落，37℃下摇菌培养约12h，收集菌液后，使用试剂盒(OMEGA质粒小量提取试剂盒，D6942-01E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKitI)提取质粒。将质粒测序，选取测序正确的质粒与pGl3-ControlVector连接。将质粒和pGL3-ControlVector分别用MμlI和XholI进行双酶切，得目的片段和线性载体，在16℃下过夜连接，连接体系如下：

将连接产物转化至感受态细胞中，进行重组质粒的转化实验和质粒提取实验，方法同上述实验过程。将大量精提取好的重组质粒与miRNA-9的mimic共转染至Hepa1-6细胞中，接下来进行双荧光素酶报告基因检测(Dual-ReporterAssaySystem,Promega,USA)

具体为：将重组质粒与miRNA-9的模拟物共转染至Hepa1-6细胞培养12小时后，收集细胞，用裂解液进行裂解，裂解液按照试剂说明配置萤火虫荧光素酶检测试剂工作液和Renilla荧光素酶检测工作液，用荧光测定仪进行检测，检测结果进行统计学分析，结果如图4所示。图4中，mock为没有转染的Hepa1-6细胞，mimic为转染了miRNA-9的模拟物的Hepa1-6细胞，mimicNC为转染了miRNA-9模拟物的阴性对照的Hepa1-6细胞，可见，miRNA-9的模拟物可以显著抑制pGL3的荧光强度，故St6gal1为miRNA-9的靶基因之一。

实施例3

为了进一步寻找miRNA-9与小鼠肝癌细胞转移能力的关系，将miRNA-9的模拟物(mimic)、miRNA-9的抑制物(inhibitor)和miRNA-9模拟物的阴性对照物(mimicNC)与miRNA-9抑制物的阴性对照物(inhibitorNC)的分别转染至Hepa1-6、Hca-P、Hca-F三种细胞中。培养36-48小时后，收集细胞，提取总蛋白，通过WesternBlotting检测St6gal1的表达水平，结果如图5A-C所示。试验结果可见，转染miRNA-9的mimic可以下调St6gal1在细胞中的表达水平，相应的，转染miRNA-9的inhibitor上调了St6gal1的表达水平。

实施例4

为了进一步研究上调、下调miRNA-9在三种细胞中的表达量对细胞功能的影响，进行细胞增殖、侵袭、迁移和黏附的实验。

1.细胞转染

将复苏好的Hepa1-6、Hca-P、Hca-F细胞分别铺在6孔板中，每孔约5*10⁵个细胞。参照转染试剂(riboFECT^TMCP,RIBOBIO,China)说明书，分别稀释miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC和转染试剂，并按照说明书混合转染试剂与相应的siRNA。置于37℃，CO₂培养箱中孵育24h。转染结果在荧光显微镜下观察，结果如图6，如图6A-C分别为在Hca-F、Hca-P、Hepa1-6三种细胞中转染了带有荧光标记的miRNA-9模拟物的阴性对照物mimicNC后的荧光效果图，表明在该转染条件下转染实验成功，同样，转染其他试剂时，也表现出良好的转染效率，转染率在60-70％之间。

2.对小鼠肝癌细胞增殖的影响

细胞增殖-CCK8实验：采用CCK8试剂盒(Dojindo,Japan)进行检测，具体方法如下：

收集成功转染miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC，以及未作转染处理(mock)的Hepa1-6，Hca-P，Hca-F三种细胞，用血球计数板计数大约2*10⁴个细胞，并将记数后的细胞铺在96孔板的每孔中，总体积为100μl，每组设3个复孔。将96孔板放置于37℃，CO₂培养箱中分别培养24h、48h、72h、96h。每孔细胞悬液中加10μlCCK-8溶液，置于37℃，CO₂培养箱中孵育2h。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的方差分析方法来分析各组数据，结果如图7所示。图7可见，转染了miRNA-9模拟物(miRNA-9mimic)的小鼠肝癌细胞Hepa1-6、Hca-P、Hca-F的增殖速率显著低于转染了miRNA-9抑制物(miRNA-9inhibitor)的小鼠肝癌细胞，表明miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6、Hca-P、Hca-F的增殖速率。

3.对小鼠肝癌细胞的转移能力

Transwell小室法检测miRNA-9对Hepa1-6、Hca-P、Hca-F细胞迁移能力的影响：同细胞增殖实验一样，收集转染后培养24h的各组细胞，使用PBS洗涤细胞3次(1000rpm离心5min)，调整细胞密度至5×10⁴个/ml，吸取约100μl不含FBS的培养基将各组细胞悬液按每孔100μl的量加入Transwell小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入600μl全培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养细胞24h。PBS冲洗各小室3次，用棉签擦拭上室的上层细胞(未穿过小室的细胞)。另取24孔板，在每孔中加入约200μl4％的多聚甲醛，将小室置于其中，使膜浸没在多聚甲醛中，固定15min后，取出Transwell小室，用PBS冲洗三次，冲洗小室下部未固定的细胞。接下来，待膜风干后将小室浸在含0.1％结晶紫溶液的24孔板中，染色15min。PBS小心洗膜3次，至小室上多余的结晶紫染色洗去。正置显微镜观察Transwell小室下底面发生转移的细胞，并对转移的细胞进行计数，各组细胞间的差异采用单因素方差分析，SPSS13.0统计学软件进行分析，结果如图8所示，其中图8A-C分别为对Hepa1-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图8中可见，转染miRNA-9的mimic，相对于转染了miRNA-9的inhibitor，三种细胞的转移能力明显被抑制，而加入inhibitor时三种细胞的转移能力都显著高于未处理的三种细胞，说明miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。

4.对细胞侵袭能力的影响

Transwell小室检测转染miRNA-9的mimic和inhibitor后Heap1-6，Hca-P和Hca-F三种细胞侵袭能力的变化：将BD胶置于4℃过夜融化，待胶融化后，将BD胶分别与无血清的DMED、RPMI1640培养基按1:10的比例混匀，加入混合液100μl于各个小室中。将小室置于在37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min。吸出胶融化后小室中残余的空培养基，加入转染好的各组细胞于小室中，细胞数量约5×10⁴个/ml。其余步骤同Transwell小室实验检测细胞的迁移能力。此实验需要注意铺胶前需要全程保证冰上操作，避免超过10℃。结果如图9所示，其中图9A-C分别为对Hepa1-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图9中可见，转染miRNA-9的mimic后穿过小室的细胞数量显著低于转染了miRNA-9的inhibitor的细胞数量。说明miRNA-9可以抑制小鼠肝癌的侵袭能力，相反的，miRNA-9的inhibitor可以提高小鼠肝癌细胞的侵袭能力。

5.对细胞黏附能力的影响

以小鼠肝癌Hca-F，Hca-P和Hepa1-6细胞为研究对象，观察两种细胞与主要细胞外基质成分FN(纤连蛋白)、LN(层粘连蛋白)、COL(胶原蛋白)黏附能力的差异。不同浓度(5nM和10nM)的FN、LN、COL分别包被96孔板，4℃包被过夜，其中牛血清白蛋白(BSA)及多聚赖氨酸(P-LYS)的包被分别作为阴性和阳性对照。使用含0.1％BSA的无血清培养基悬浮细胞，并种植于包被好的96-well板中，37℃孵育1小时。冷PBS洗掉未结合的细胞，使用40％甲醇配制的0.3％结晶紫标记结合细胞，染色持续30min，ddH₂O清洗后，570nm波长下检测结果。每个处理需要三个复孔。结果如图10所示：在不同包被浓度下，Hca-F和Hca-P细胞与FN、LN、COL的黏附能力显著高于Hepa1-6细胞。

由图7-9的实验结果可推断miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。

实施例5

为了找到miRNA-9对细胞黏附功能改变的信号通路，在实施例4中所述的miRNA-9对小鼠肝癌Hca-F，Hca-P和Hepa1-6细胞肝癌Hca-F，Hca-P和Hepa1-6细胞实验结果的基础上，设计实验如下所示：

小鼠肝癌Hca-F，Hca-P和Hepa1-6细胞分别用miRNA-9的mimic、mimicNC、inhibitor、inhibitorNC转染后，培养24小时，用于如下试验。

免疫印迹分析蛋白磷酸化水平

1)以10nM的FN包被细胞培养板，4℃包被过夜；

2)使用含0.1％BSA的无血清培养基悬浮各转染细胞和未转染细胞(mock)，并种植于包被好的细胞培养板中，37℃孵育1小时；

3)冷PBS洗掉未结合的细胞后细胞裂解液充分裂解结合细胞，BCA蛋白定量后进行Westernblot检测；

4)其中利用FAK抗体检测FAK的总蛋白水平，p-FAK抗体检测其磷酸化水平。

得到的结果如图11所示，其中图11A-C分别为对Hepa1-6、Hca-P、Hca-F的实验结果可见，转染了miRNA-9的mimic的三种细胞的p-FAK蛋白水平表达量下降，显著低于转染了miNRA-9的inhibitor的细胞，说明miRNA-9是通过抑制FAK蛋白磷酸化水平来降低细胞的黏附能力。

参考文献：

[1]Dall’OlioF,MalagoliniN,TrincheraM,ChiricoloM:Sialosignaling:sialyltransferasesasenginesofself-fuelingloopsincancerprogression.BiochimBiophysActa1840,2014:2752-2764.

[2]V,NovokmetM,I,LaucG.Genomicsandepigenomicsofthehumanglycome.GlycoconjJ.2013；30:41-50.

[3]SchachterH,FreezeHH.Glycosylationdiseases:quovadis？BiochimBiophysActa.2009；1792:925-930.

[4]SchultzMJ,SwindallAF,BellisSL:Regulationofthemetastaticcellphenotypebysialylatedglycans.CancerMetastasisRev2012,31:501-518.

[5]CalinGA,CroceCM.MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatRevCancer2006；6:857-66.

[6]CalinGA,SevignaniC,DumitruCD,HyslopT,NochE,YendamuriS,etal.HumanmicroRNAgenesarefrequentlylocatedatfragilesitesandgenomicregionsinvolvedincancers.ProcNatlAcadSciUSA2004；101:2999-3004.

[7]Yanjie,GuoLet-7cinhibitsmetastaticabilityofmousehepatocarcinomacellsviatargetingmannosideacetylglucosaminyltransferase4isoenzymeA.TheinternationaljournalofBiochemistry&CellBiology2014；53:1-8.

[8]ChangshinYoon,MiR-9regulatesthepost-transcriptionallevelofVEGF165abytargetingSRPK-1inARPE-19cells.GraefesArchClinExpOphthalmol2014；252:1369-1376。

Claims

1.miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQIDNO.1所示。

2.miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义链序列如SEQIDNO.2所示，反义链序列如SEQIDNO.3所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。

5.St6gal1在制备抑制肝癌转移药物中的应用，其特征在于，所述St6gal1为如权利要求1所述的miRNA-9的靶基因。