CN102719556A - 基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用 - Google Patents

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田文洪
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Abstract

本发明具体涉及一种基于AAV(Adeno-associated virus)载体的高通量miRNA活性检测方法miRNA Asensor Array(miRNA sensor based AAV vector Array，基于AAV载体的、用于miRNA活性检测的生物传感器)及其在细胞miRNA活性谱检测、不同细胞特征miRNA活性谱检测和外界因素(如药物、转基因)对细胞miRNA活性谱的影响等方面的应用。miRNA Asensor Array由不携带miRNA靶序列的control Asensor和多种携带miRNA靶序列的miRNA Asensor按照一定顺序排列组成。Control Asensor和miRNA Asensor均包含Gluc(Gaussia luciferase)和Fluc(firefly luciferase)两个独立的表达单元，其中Gluc用于miRNA活性检测，Fluc用于计算miRNA Asensor的转导系数，校正不同miRNA Asensor之间的感染性差异。使用时，将待检测细胞加入到制备好的miRNA Asensor Array中，一段时间后检测Gluc表达情况并根据转导系数计算出细胞中miRNA活性谱。该方法为细胞miRNA活性谱的制作及其影响因素研究提供了新的选择。

Description

基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用
本发明属于生物技术发明领域。是我们申请的中国专利”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号：200910009059.6)”和”携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途(申请号：200910223723.7)”的延续和扩展。本发明具体涉及一种基于AAV(Adeno-associated virus)载体的高通量miRNA活性检测方法miRNA Asensor Array(miRNA sensor based AAV vector Array，基于AAV载体的、用于miRNA活性检测的生物传感器)及其在细胞miRNA活性谱检测、不同细胞特征miRNA活性谱检测和外界因素(如药物、转基因)对细胞miRNA活性谱的影响等方面的应用。miRNA Asensor Array由不携带miRNA靶序列的control Asensor和多种携带miRNA靶序列的miRNA Asensor按照一定顺序排列组成。Control Asensor和miRNA Asensor均包含Gluc(Gaussia luciferase)和Fluc(firefly luciferase)两个独立的表达单元，其中Gluc用于miRNA活性检测，Fluc用于计算miRNA Asensor的转导系数，校正不同miRNA Asensor之间的感染性差异。使用时，将待检测细胞加入到制备好的miRNA Asensor Array中，一段时间后检测Gluc表达情况并根据转导系数计算出细胞中miRNA活性谱。该方法为细胞miRNA活性谱的制作及其影响因素研究提供了新的选择。 
背景 
miRNA(microRNA)是生物体内源的长度为18～25个核苷酸的非编码RNA(Bartel DP.MiRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell，2004，116(2)：281-297.)。目前，在人类中已发现1000多种miRNA(参见www.mirbase.org数据库)。在体内，miRNA与AGO等蛋白形成RISC(RNA Induced Silencing Complex)，识别并结合mRNA 3’UTR的靶序列，降低mRNA的稳定性和抑制翻译，在转录后水平上对基因的表达进行负调控(Doench JG，Sharp PA.Specificity of microRNA target selection in translation repression.Genes Dev，2004，18(5)：504-511.)。研究发现，miRNA参与人类大约三分之一基因的表达调控(Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell，2005，120(1)：15-20.)， 在细胞分裂(Careton M，Cleary MA，Linsley PS.MicroRNAs and cell cycle regulation.Cell Cycle，2007，6(17)：2127-2132.)、分化(Iovino N，Pane A，Gaul U.miR-184has multiple roles in Drosophila female germline development.Dev Cell，2009，17(1)123-133.)、死亡(Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms：growth，death，fat，stress，and timing[Erratum Cell，2003，114(2)：269].Cell，2003，113(6)：673-676.)、凋亡(Jovanovic M，Henqartner MO.miRNAs and apoptosis：RNAs to die for.Oncogene，2007，25(46)：6176-6187.)、新陈代谢(Dang CV，Le A，Gao P.MYC-induced cancer cell energy metabolism and therapeutic opportunities.Clin Cancer Res，2009，15(21)；6479-6483.)以及干细胞的分化(Xu N，Papagiannakopoulos T，Pan GJ，et al.MicroRNA-145regulates OCT4，SOX2，and KLF4and represses pluripotency in human embryonic stem cells.Cell，2009，137(4)：647-658.)、肿瘤的发生(Schichel R，Boyerinas B，Park SM，et al.MicroRNAs：key players in the immune system，differentiation，tumorigenesis and cell death.Oncogene，2008，27(45)：5959-5974.)等诸多生理病理过程中发挥重要作用。 
目前已建立Northern blot、QRT-PCR、microarray和Deep sequencing等多种miRNA表达水平检测方法。按照检测原理的不同，这些方法可分为基于杂交的Northern blot和microarray、基于扩增的QRT-PCR和基于测序的Deep sequencing三大类。虽然这些方法可以简单、快捷和高通量地检测细胞内的miRNA表达水平，但是由于这些方法均需要提取细胞内RNA，因此不仅操作繁琐，还不能对同一细胞进行长期持续地监测。更为重要的是，已有的研究表明，细胞内miRNA的活性，即细胞内发挥效应的miRNA，不仅与细胞内miRNA的表达水平相关，还受到miRNA在细胞内的定位、miRNA的稳定性以及miRNA形成的miRISC中其他蛋白因子的影响(Krol J，Loedige I，Fillipowicz W.The widespread regulation of microRNA biogenesis，function and decay.Nature Reviews Genetics，2010，11：597-610.)。因此为了了解细胞内miRNA活性，需要建立一种检测细胞内miRNA活性的方法。现有的miRNA活性检测方法基于miRNA抑制细胞内基因表达的原理，选择常用的报告基因(Fluc、EGFP、RFP、Gluc和Mluc等)，在其3’UTR区插入某种miRNA的靶序列(如和成熟miRNA完全互补的序列)，同时以3’UTR区不含miRNA靶序列的报告基因作为对照，然后将携带和不携带miRNA靶序列的报告基因分别导入检 测细胞中，一定时间后比较报告基因的表达情况，推测细胞内miRNA的活性。报告基因的表达情况比较结果分为两种：其一，携带miRNA靶序列的报告基因表达量小于不携带miRNA靶序列的报告基因的表达量，表明细胞内该种miRNA活性较高；其二，携带miRNA靶序列的报告基因表达量不小于不携带miRNA靶序列的报告基因的表达量，表明细胞内该种miRNA活性较低。从miRNA活性检测的原理可知，报告基因的选择和报告基因高效地导入细胞是单个miRNA活性检测方法需要解决的两个主要问题。Huang等(Huang PC，Chen CY，Yang FY，et al.A multisampling reporter system for monitoring microRNA activity in the same population of cells.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2009.doi：10.1155/2009/104716)报道了一种以分泌型荧光素酶Mluc(Metridia luciferase)为报告基因的质粒型miRNA活性检测载体，利用该方法可以连续监测同一细胞的miRNA活性。Lee等(Lee JY，Kim S，Hwang DW，et al.Development of a Dual-Luciferase repoter system for in vivo visualization of microRNA biogenesis and posttranscriptional regulation.J Nucl Med，2008，49：285-294.)报道了一种以Gluc(Gaussia luciferase)为报告基因的质粒型miRNA活性检测载体，相比于Mluc，Gluc灵敏度更高，检测更加方便，为miRNA活性检测提供了一种新的选择。但是，现在仍然缺乏一种高通量的miRNA活性检测方法。这是因为高通量的miRNA活性检测方法的建立不仅需要选择适当的报告基因和简便的外源基因转导技术，还需要克服多种不同miRNA活性检测载体之间的转导效率差异。 
虽然荧光蛋白基因在miRNA活性检测中也常作为报告基因(Julius Brennecke，Alexander Stark，Robert B.Russell，et al.Principles of MicroRNA-Target Recognition.PLoS Biology，2005，3(3)，404-418，e85.)，但其主要应用于miRNA活性的定性检测。在miRNA活性的定量检测中，则通常选择荧光素酶基因为报告基因，如Fluc(Christine Esau，Xiaolin Kang，Eigen Peralta，et al.MicroRNA-143Regulates Adipocyte Differentiation.The Journal of Biological Chemistry，2004，279，52361-52365.Yong Zhao，Eva Samal and Deepak Srivastava.Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2during cardiogenesis.Nature，2005，436，214-220.)、Gluc(Lee JY，Kim S，Hwang DW，et al.Development of a Dual-Luciferase repoter system for in vivo visualization of microRNA biogenesis and  posttranscriptional regulation.J Nucl Med，2008，49：285-294.)、Rluc(Margaret SEbert，Joel R Neilson and Phillip A Sharp.MicroRNA sponges：competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells.Nature Methods，2007，4，721-726.Vincent Boissonneault，Isabelle Plante，Serge Rivest，et al.MicroRNA-298and MicroRNA-328Regulate Expression of Mouse β-Amyloid Precursor Protein-converting Enzyme 1.The Journal of Biological Chemistry，2009，284，1971-1981.)和Mluc(Huang PC，Chen CY，Yang FY，et al.A multisampling reporter system for monitoring microRNA activity in the same population of cells.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2009.doi：10.1155/2009/104716)等，因为荧光素酶基因可以方便地实现其表达量的定量检测。同时，荧光素基因还具有灵敏度高的特点。新一代的荧光素酶基因Gluc不仅灵敏度高，还易分泌、检测时不依赖ATP、检测方便等特点，可作为miRNA活性检测时选择报告基因。 
携带和不携带miRNA靶序列的报告基因常通过质粒(Miranda，K.C.，Huynh，T.，Tay，Y.et al.A Pattem-Based Method for the Identification of MicroRNA Binding Site and Their Corresponding Heteroduplexes.2006.Cell，126，1203-1217.)和病毒载体(Brown BD，Venneri MA，Zingale A，et al.Endogenous microRNA regulation suppresses transgene expression in hematopoietic lineages and enables stable gene transfer.Nature medicine，2006，12(5)，585-591.)等方式导入细胞内。质粒载体制备方便，但对某些细胞转染效率低下，不能用于这些细胞中的miRNA活性检测。Brown BD等报道了一种利用慢病毒载体检测细胞内miRNA活性的方法(Brown BD，Venneri MA，Zingale A，et al.Endogenous microRNA regulation suppresses transgene expression in hematopoietic lineages and enables stable gene transfer.Nature medicine，2006，12(5)，585-591.)。慢病毒载体能高效转染多种细胞，但其需要在溶液保存，不方便于运输，且稳定性不好，尤其因自身病毒特性，慢病毒干燥后保存在固体附着物上时的稳定性很不好。相反，另一种常用的病毒载体：AAV病毒载体的稳定性就非常好，这是由于AAV病毒是一种无包膜的纳米级颗粒(直径约20nm)，正二十面体对称，结构比较”刚性”，对pH值、温度、盐浓度变化及有机溶剂(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很强的耐受性，因此AAV病毒载体具有很高的稳定性。同时，在体外AAV2病毒(AAV病毒的一种血清亚型)对多种细胞具 有较高的转导效率。利用AAV2病毒载体的这些特点，我们建立了一种AAV2病毒的反向感染阵列(Dong X，Tian W，Wang G，et al.Establishment of an AAV reverse infection-based array.PLoS ONE，2010，5(10)：e13479.)，而且我们申请了相应的专利：AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号：200910009059.6)。该专利和技术的特点是，区别于传统的正向感染，反向感染阵列先将病毒反向包被于各种型号的细胞培养板上，并在操作工作台中无菌晾干后2-8℃保存，使用时，将待检测细胞加入已制备好的病毒反向感染阵列中，放入细胞培养孵箱培养一定时间后检测相应的检测标志(如报告基因)即可。我们的研究发现，该方法建立的AAV2病毒反向感染阵列可以在2-8℃保存一年以上而感染活性无明显降低。因为使用阵列这种”高通量”设计模式，所以，AAV2病毒反向感染阵列能够简单、方便地实现外源基因的高通量体外转导，为需要体外外源基因的高通量转导提供了新的选择。利用AAV2病毒反向感染阵列的方法，我们进一步建立了一种高通量的miRNA活性检测方法(申请号：200910223723.7)，该案所申请的发明正是在上述发明专利申请的基础上技术进一步地延伸和扩展。 
高通量miRNA活性检测的另外一个主要障碍是，多种不同miRNA活性生物传感器(Sensors)之间的转导效率差异和误差，将导致检测结果与真实结果出现的偏差较大。即，不同的miRNA生物传感器是预先包被在同一个96孔板的不同的孔里，这些不同的孔里所预先包被的包含有不同的miRNA生物传感器的AAV病毒在制备和生产过程中无法达到完全一致，它们的质量和病毒滴度总会有差异，而这些差异会带来后续的结果和数据的不可信。 
为了克服因包含有不同的miRNA生物传感器的AAV病毒之间的差异导致的测量误差，我们的方法是，利用不同miRNA生物传感器的结构中预先设计好的、组成比例相对稳定的物质，或测量这种差异来校正不同miRNA生物传感器之间的差异。 
由于miRNA活性生物传感器的转导效率通常受到多种因素的影响，例如，以质粒为载体的miRNA活性生物传感器受到质粒的质量、质粒的转染剂量等因素的影响，而以病毒为载体的miRNA活性生物传感器则受到病毒载体的质量、病毒载体的感染剂量等因素的影响，因此，不容易找到一种相对稳定的标记来指示转导效率，因此需要引入一种外源标志来指示不同miRNA活性生物传感器受间的转导效率，并且用这种外源标志校正转染效率的差异。 
miRNA不仅在诸多生理病理过程中发挥重要作用，而且还能够作为一种有效的分子标记用于指示特定的生理病理过程。例如，miRNA可作为癌症的一种检测标记，用于癌症的检测、分类和预后判断(Calin GA，Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers.Nature Reviews Cancer，2006，6，857-866.)。而且不同种类的细胞具有特异性的miRNA表达谱，可用于细胞种类的指示。Houbaviy HB等(Houbaviy HB，Murray MF，Sharp PA.Embryonic stem cell-specific microRNAs.Developmental Cell，2003，5，351-358.)研究发现，胚胎干细胞呈现出独特的miRNA表达谱，且这些独特的miRNA在胚胎干细胞的分化和多能性的维持中发挥重要作用。这提示miRNA可能作为一种分子标记用于鉴定胚胎干细胞。此外，某些miRNA特异性地在特定的组织和组织来源细胞中高表达，如miR122主要在肝脏和肝脏来源细胞中高表达(Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse.Current Biology，2002，12：735-739.；Sempere LF，Freemantle S，Pitha-Rowe I，et al.Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNA s with possible roles in murine and human neuronal differentiation.Genome Biol，2004，5，R13.)，miR142-3p则主要在造血干细胞系来源细胞中高表达(Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation.Science，2004，303(5654)：83-86.)，miR206、miR133a和miR1主要在肌肉及其来源细胞中高表达(Sempere LF，Freemantle S，Pitha-Rowe I，et al.Expression profiling of mammalian microRNAsuncovers a subset of brain-expressed microRNA s with possible roles in murine and human neuronal differentiation.Genome Biol，2004，5，R13.)。这表明miRNA可能成为一种分子标记用于鉴定细胞的来源。 
为了体现本发明与我们之前申请的中国专利”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号：200910009059.6)”和”携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途(申请号：200910223723.7)”等原案申请的相关、连续性及充分公开的要求，原案申请中的实施例也都被以背景资料进行详述。 
以下为我们之前申请的发明专利的背景介绍，是关于”AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列(申请号：200910009059.6)”的。 
申请号为200910009059.6的申请专利具体涉及AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列，将制备好的携带外源基因和基因调控元件的重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培养支持物(如96孔板)上，在无菌条件下制成可以长期存放的重组AAV病毒阵列。将活细胞悬液加入布置了重组AAV病毒阵列的细胞培养孔板中(如96孔板)，预先包被的重组AAV病毒能够有效地感染所加入的细胞，并将重组AAV病毒携带的外源基因(如报告基因)和/或基因元件带入细胞中发挥作用。 
申请号为200910009059.6的申请专利的背景：将外源基因和/或基因元件导入细胞、使其在细胞中表达或阻断其它基因的表达，是分子生物学中常用的技术方法，称之为转导(transduction)。这个过程往往需要载体(vector)和导入系统(delivery system)来介导。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体通常是借助人工制备或合成的材料如脂质体、壳聚糖、多聚阳离子化合物等将DNA质粒”包裹”成复合物导入细胞中，这个过程通常被称为”转染”(transfection)。而病毒载体则借助病毒天然的感染能力将”搭载”的外源基因和元件序列导入细胞中，这个过程和病毒感染过程相似，也被称为”感染”。 
无论是转染方式还是感染方式，通常的基因导入方法都是先将细胞铺入培养板中、再加入DNA复合物或病毒进行”转染”或”感染”；与常规方法在操作顺序上有所不同的是，本发明所述的转导方法是先将所使用的重组病毒预先包被在孔板中，之后再加入细胞来实现感染，因此这样的方法可称作”反向感染”(reverse infection)。为了便于区别，我们把常规方法进行的转导方法称为”正向转染”或”正向感染”。 
实际上，”微阵列”(Microarray)技术已经广泛用于生物技术领域。其中最为常见的是DNA Array(基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化稳定性和独特的碱基配对结构，而成为理想阵列材料。比如将多种合成的寡核苷酸(单链DNA)作为探针有序地排列固定在表面经过处理的玻片上制成”微阵列”(芯片)，而将待检测的样品提取核酸，用地高辛标记的随机引物进行扩增和标记后与芯片上的探针杂交，最后显色获得杂交信号。根据信号所在的探针位置来判断样品中有与该探针序列互补的序列。除了DNA外，多肽和蛋白(包括抗体)也被成功地用来制成阵列，用于蛋白检测。阵列(Array)技术的优势是具备高通量的特点，即一次检测能同时获得样品与多个探针作用的信息。传统的Southern杂交、Northern杂交和Western杂交都是将样品经过电泳分离后转印到膜上，而用标记的探针来进行检测。如果把 这样的操顺序称为”正向”方式，那么，阵列技术是将已知信息的物质(探针)排布成点阵，而加入被检测的对象进行检测就可称为”反向”方式。 
microRNA(miRNA)是长度在18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。它由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被转录。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到达mRNA，进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。有研究人员发现线虫体内的异时性基因lin-4编码的小RNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30％的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌症发生发展中发挥作用的miRNA被称作oncogenic miRNA，即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等。下表罗列出部分microRNA的表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后的关系： 
Figure BSA00000461224500081
Figure BSA00000461224500101
基于目前人们对microRNA与肿瘤的关系的理解，可以预见，其在肿瘤诊断中将发挥出相应的作用。 
Lu等人采用串珠流式细胞miRNA表达谱分析技术对来自人恶性肿瘤组织的miRNA进行系统表达分析，其中包括结肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌。miRNA表达谱成功对低分化肿瘤进行了分类。研究揭示了miRNA表达水平在癌症诊断中的重要作用[Lu J，Getz G，Miska EA，et al.(2005)MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature.435，834-838]。Bottoni等人则采用芯片技术及RT-PCR分析了垂体腺瘤和正常垂体样本中的全部miRNA，结果发现miRNA表达水平可以区分垂体微腺瘤和垂体巨腺瘤，还有一些miRNA参与细胞增殖与凋亡的过程。miRNA可以作为有效的诊断标志，提高对垂体腺瘤的分类水平[Bottoni A，Zatelli MC，Ferracin M，et al.(2007).Identification of differentially expressed microRNAs by microarray：a possible role for microRNA genes in pituitary adenomas.J Cell Physiol.210，370-377.]。Lee等人采用原位RT-PCR技术，经分析发现miR-221、miR-301和miR-376a的异常表达只在胰腺癌细胞中出现，而没有在良性胰腺肿瘤及正常间质和导管处出现。miRNA的异常表达可以作为胰腺肿瘤发生的研究线索，同时也可能为胰腺癌诊断提供新的生物学标志[Lee EJ，Gusev Y，Jiang J，et al.(2007).Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.Int J Cancer.120，1046-1054.]。 
microRNA在癌症预后判断中的作用：Takamizawa等人报道指出，let-7miRNA的表达往往在人肺癌中缺失，而let-7miRNA表达的减少与术后生存期的减短显著相关。此外，let-7miRNA在A549肺腺癌细胞株中的过表达可在体外抑制肺癌细胞的生长。他们的研究结果表明了let-7miRNA表达水平的改变具有潜在临床和生物学作用[Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.(2004).Reduced  expression of the let-7microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival.Cancer Res.64，3753-3756.]。Yanaihara等人的研究可以区分肺癌组织和非恶性肿瘤组织的miRNA表达模式。前体miRNAhsa-miR-155的高表达和hsa-let-7a-2的低表达与肺腺癌的低生存率相关。他们的研究表明，miRNA不仅可以作为肺癌的诊断学标志，还可以作为预后预测的标志[Yanaihara N，Caplen N，Bowman E，et al.(2006).Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell.9，189-198]。Roldo等人则发现，miR-21在胰腺肿瘤中的过表达与高Ki67增殖指数及出现肝转移高度相关。他们的研究结果表明，miRNA表达水平的改变与恶性肿瘤的进展状态相关[Roldo C，Missiaglia E，Hagan JP，et al.(2006).MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior.J Clin Oncol.24，4677-4684.]。此外，Bloomston等人将胰腺癌细胞中的miRNA的表达水平与正常胰腺和慢性胰腺炎组织细胞的miRNA进行比较，结果发现，胰腺癌细胞中miRNA表达水平与后两者不同，可以有效区分开来。miR-196a-2的高表达可以用于预测不良预后[Bloomston M，Frankel WL，Petrocca F，et al.(2007).MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA.297，1901-1908.]。 
某些miRNA表达状态受到癌细胞中表观遗传学改变的控制，比如DNA甲基化和组蛋白修饰。采用染色质修饰药物激活肿瘤抑制因子miRNA可以调节靶向癌基因，这一策略也许能在不久的将来成为癌症的新型治疗方法。miRNA可以与基因组学、蛋白质组学中的生物学标志相结合，成为癌症诊断和判断预后的参考指标[Cho WC.(2007).Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery.Mol Cancer.6，25.；Cho WC，Cheng CH.(2007).Oncoproteomics：current trends and future perspectives.Expert Rev Proteomics.4，401-410.]。尽管每个miRNA可以调控成百个靶向基因，但在癌症研究中鉴别出miRNA的准确靶点仍然是一大难题。此外，由于干细胞可以分化发育成为多种类型的细胞，因而成为研究者们瞩目的焦点。已有研究指出miRNA通路在干细胞分化中起调控作用，而其机制是否可用于癌症的预防与治疗还需要进一步研究[Cho WC.(2007).A future of cancer  prevention and cures：highlights of the Centennial Meeting of the American Association for Cancer Research.Ann Oncol.doi：10.1093/annonc/mdm335]。miRNA在多种病理过程中的功能的发现，使得对疾病进行分子水平的诊断和预后预测成为可能，对于癌症尤其如此。 
Andrew Fire和Craig Mello因发现RNA干扰现象——双链RNA诱导的基因沉默而获2006年度诺贝尔奖。自从在一些生物体内发现相互作用的反义RNA具有调控功能以来，转录后的基因调节便跻身于主要基因调控机制的行列。miRNA通过碱基互补诱导RNA干扰路径，从而抑制靶向mRNA。数以百计的miRNA的发现使我们对于RNA干扰现象的生物医学意义有了全新的认识。研究者的目光开始集中于利用反义寡核苷酸抑制miRNA功能，或者采用小干扰RNA类技术研究miRNA。科学家们致力于揭开miRNA生物学的神秘面纱，挖掘其在疾病治疗方面的应用潜力。对患者进行的有关oncomiR的大型高通量研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的预测。联合基因组学、微RNA组学(miRomics)以及蛋白质组学的高通量靶向分析，有助于我们进一步发现miRNA的调节靶点。 
申请号为200910009059.6的申请专利的发明概述：本发明的重要目的是建立一种基于AAV病毒载体的高通量反向感染活细胞及检测表达变化的技术方法，尤其是提出一种用luciferase基因作为报告基因测定活细胞内miRNA活性的技术方法。 
miRNA是一种长度为22nt(nucleotide)左右(18-25nt)的非编码RNA，广泛存在于植物和后生动物中，调节基因的表达。近年来研究发现miRNA不仅参与调节生物的生长发育过程，还在某些生理病理过程中(如癌症的发生)表达异常。因此，特定细胞或细胞株中的miRNA表达状况的揭示有助于认识生物个体发育过程和某些疾病的发生机制。目前，研究组织细胞中miRNA表达差异方法主要包括基因芯片、QRT-PCR和northern blot等，这些方法都需要从提取组织细胞中的RNA。本发明提出的方法具有可直接检测活细胞中成熟且发挥功能的miRNA活性的优点。 
申请号为200910009059.6的申请专利的发明详述： 
将定量的AAV病毒纯品溶液点在细胞培养支持物(如96孔板、384孔板等)上，形成有序的AAV病毒阵列(AAV Array)；使用时将等量的细胞悬液加入AAV阵列中，实现细胞的反向感染；通过分析AAV病毒介导的导入细胞中的外源基因表 达情况，获得可供分析的信息。 
与正向感染相比，AAV病毒反向感染技术有以下可以被利用的优点： 
1)包被了AAV病毒的细胞培养板可以在干燥状态下长期保存(1年以上)而不失去感染活性和效率。 
2)有利于对转感染效率的质量控制； 
3)AAV病毒对于大多数细胞体外转染都具有较高的转染效率； 
4)有利于进行高通量转导细胞。 
制备AAV病毒阵列时，AAV病毒与培养板之间的包被不必要进行化学反应交联，只需要自然的吸附和晾干。 
AAV病毒是一种无包膜的纳米级颗粒(直径约20nm)，正二十面体对称，结构比较”刚性”，对pH值、温度、盐浓度变化及有机溶剂(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很强的耐受性，因此便于存放。将AAV病毒溶液置于56℃水浴中2小时，其感染活性几乎不下降；而同样的条件处理逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或腺病毒，病毒感染活性都几乎全部丧失。我们曾经利用AAV病毒对有机溶剂的高耐受性发明了一种快速高效纯化AAV病毒的方法(专利号：99123723.4)。其中利用AAV病毒耐受有机溶剂的特性，在粗纯化过程中用三氯甲烷处理细胞悬液以使大量宿主蛋白变性沉淀而除去，进一步用三氯甲烷抽提含有AAV病毒的溶液，弃去有机相而保留水相，获得的AAV病毒纯度可达到80％以上。 
我们在研究中发现，纯化的AAV病毒在适当配方的溶液中可以在-70℃保存5年以上，在4℃保存2年以上，在室温下保存6个月以上。说明AAV病毒制品本身具有良好的稳定性。 
我们的研究还发现，包被在细胞培养孔板(如96孔板)上的重组AAV病毒阵列可以在干燥状态下长期保存(4℃保存1年以上)而不失去感染活性。说明AAV病毒在干燥状态下仍能够保持其感染性。与AAV病毒相比，腺病毒虽然也没有病毒包膜，结构也相对稳定，但用同样的条件包被在细胞培养孔板上，晾干后感染效率比在溶液状况下明显下降，加入细胞后病毒对细胞的转染效率在1‰以下，不能达到使用的有效预期。对于有包膜的病毒如逆转录病毒和慢病毒，由于病毒的包膜稳定性对外界环境变化敏感，亦不能很好地耐受干燥环境，因此用反向转染方法时也只能够在溶液状态下操作，不能晾干保存。而AAV病毒能在干燥环境下保持感染活 性这个特性使其成为反向感染技术最合适的病毒之一。 
为了有效控制细胞培养板上每孔包被的AAV病毒质量、孔间差异、板间差异和生产的批间差异，通过对AAV病毒制备过程进行质量控制和AAV病毒的质量检定，可以批量生产AAV病毒阵列，并能长期保存(4℃保存1年以上)。这种预制好的AAV病毒阵列产品，在应用时只要每孔加入等量的细胞就能实现病毒对待检测细胞的基因转染。而该AAV病毒阵列产品因采用了”反向感染”策略，其与”正向感染”相比，可以有效消除由于繁琐的转染操作带来的系统误差和操作误差，并使该AAV病毒阵列产品的应用变得操作简便。 
原则上，各种血清型的AAV病毒都可以用于制备AAV病毒阵列。AAV2病毒研究得最多，是最早建立成载体系统的AAV病毒。对其结构和感染特性的研究也最为深入。AAV2的主要细胞受体是硫酸肝素糖蛋白(HSPG)，辅助受体是bFGF1受体、整合素αvβ5。各种血清型的AAV病毒体内外转导效率极不一致。比如对体外培养的BHK21细胞和HEK293细胞，AAV2-EGFP的表达水平明显高于同等用量的AAV1或AAV8病毒，而小鼠肌肉注射时AAV1-EGFP和AAV8-EGFP则比同等剂量的AAV2-EGFP病毒表达水平高20～100倍以上。由于AAV2病毒能有效感染多种体外培养的细胞，并且用肝素柱能十分有效地获得高纯度的AAV2病毒，因此，AAV2在制备AAV病毒阵列上有优势。另外，对AAV病毒外壳基因进行分子改造，可以获得具有新的感染特性的AAV病毒，用于制备有某种感染特性的AAV病毒阵列。 
将携带报告基因和miRNA靶序列的DNA或重组病毒导入细胞中，通过检测报告基因的表达水平，可以反映出细胞相对应的内源性miRNA的活性。导入的DNA的主要结构包括”启动子-报告基因-miRNA靶序列-polyA”。作用原理是细胞中相对应的内源性miRNA与导入DNA的miRNA靶序列结合在RISC作用下使位于其上游的报告基因表达受到抑制。由于AAV病毒有对大多数细胞有具有感染能力、容量合适、安全性好、稳定性好等优点，因此，本发明采用了腺病毒相关病毒(AAV)载体来导入基因。 
申请号为200910009059.6的申请专利的发明提出将反向转染的AAV病毒阵列用做检测各种细胞内miRNA水平和变化的生物传感器。具体方法是，将已经发现的microRNA的靶序列分别置于报告基因荧光素酶(luciferase)基因的3’UTR区，包 装成AAV病毒，并将这些包含了各种miRNA生物传感器的AAV病毒制备成AAV病毒阵列。同时，在这个AAV病毒阵列中设立不带microRNA靶序列、但带有报告基因的AAV病毒为对照。这个AAV病毒阵列用于检测细胞中miRNA活性，采用分泌型的荧光素酶基因，因此，这个AAV病毒阵列能够在不裂解细胞的情况下检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性，从而实现miRNA活性的活细胞检测。进一步，可以比较各种因素影响下对细胞中miRNA活性的影响。这些因素包括药物、病毒感染、基因转染、温度和pH值等理化变化。 
目前，在人类基因组中已经发现的microRNA的种类有1000种左右。http://microrna.sanger.ac.uk/网站目前收录了已经确定了的695种。查找miRNA靶序列的方法是，登录http://microrna.sanger.ac.uk/，进入miRBase Database主页，点击Targets，链接到miRBase Targets Database，点击enter，在显示界面选择microRNA所属物种。点击view，从显示界面中选择该microRNA，再点击其所属的view按钮，显示即为该种microRNA的预测的靶基因，点击view显示该microRNA在这个靶基因中的靶序列。 
将microRNA的靶序列构建到报告基因荧光素酶(luciferase)基因的3’UTR区的策略是：将荧光素酶(luciferase)基因插入AAV病毒载体(如pAAV2neo)中，并在其3’UTR区(polyA序列之前)设计两个不同的限制性酶切位点(如EcoRI和Bg/II)；将待插入的miRNA靶序列假定为正链，其互补链假定为负链。在正负链的5’端分别设计相应的限制性酶酶切后产生的突出末端序列，正负链退火后形成粘性末端，插入荧光素酶(luciferase)基因的3’UTR区相应的位置，得到在其3’UTR区含有microRNA的靶序的荧光素酶(luciferase)基因。 
按所述方法，可以把所有已经发现了的miRNA相应的互补序列作为靶序列，分别插入AAV-luciferase载体中，得到一系列重组AAV-luciferase载体质粒；将这些AAV载体质粒分别制备成AAV病毒，并制备成AAV病毒-miRNA靶序列阵列。可以把制备的所有种类的AAV病毒做成一套全AAV病毒-miRNA靶序列阵列，也可以选择一种或几种或一组相关的miRNA靶序列所在的AAV病毒制备成特定用途的AAV病毒-miRNA靶序列阵列。 
除了用于所述的活细胞中miRNA活性检测以外，AAV病毒阵列还可以有多种用途。比如在制备AAV病毒阵列时，可以在同一块培养孔板上包被同一种AAV病 毒，用于反向感染不同的细胞并比较其转染效率和生物学反应；也可以在同一块培养孔板上包被不同血清型(如AAV1至11及外壳改造的AAV)的AAV病毒，用于反向感染相同的细胞并比较其转染效率；也可以在同一块培养孔板上包被携带不同外源基因和/或基因元件的AAV病毒，用于反向感染相同的细胞并比较其生物学反应。 
运用AAV病毒阵列反向感染技术，制备检测试剂(AAV2-Gluc-miRNAT)，可以用于进行临床肿瘤标本的细胞的基因元件活性的检测。具体的操作流程是：将取自临床的无菌的肝癌组织标本，用胰酶进行消化处理，用含10％胎牛血清的DMEM将经胰酶消化处理后的肿瘤标本的细胞制备成2.5×105/ml的分散的原代肿瘤细胞悬液，以100ul/孔的细胞量接种于包含了AAV2-Gluc-miRNAT的”AAV病毒阵列反向感染检测试剂”的96孔板中，该阵列含有系列梯度的12种AAV2-Gluc-miRNAT，本实验中每种AAV2-Gluc-miRNAT的使用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104等3个剂量梯度，共使用36孔，此外，另外使用3个孔，设为Negative Control孔(不加AAV病毒)。详见实施例7中所述。加入肝癌原代细胞悬液后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，检测AAV2-Gluc-miRNAT介导的Gluc在细胞中的表达情况，其结果可以用于判断肝癌原代细胞对哪些miRNA有反应，可受到哪些元件的调控，并在本发明所描述的检测体系中以可以判读的Gluc的的变化来显示它们的关系的存在。 
申请号为200910009059.6的申请专利发明的最终应用方式将是包含尽可能多的miRNA调节元件及其靶序列的AAV病毒阵列，用于对不同疾病组织、细胞的检测，并最终成为合乎国家、行业标准的诊断试剂盒。 
申请号为200910009059.6的申请专利的附图说明： 
图18：重组质粒pAAV2neo-EGFP的图谱，即其结构示意图。见申请号为200910009059.6的申请专利的实施例1。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；EGFP是绿色荧光蛋白基因；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因。 
图19：重组质粒pAAV2neo-luc的图谱，即其结构示意图。见申请号为 200910009059.6的申请专利的实施例1。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；luc是萤火虫荧光素酶基因。 
图20：BHK21细胞反向感染rAAV2-EGFP病毒实验结果。见申请号为200910009059.6的申请专利的实施例3。预制的rAAV-EGFP阵列晾干后4-8℃放置9天。本图中共有9张拍摄了表达绿色荧光蛋白的细胞的照片，所包被的rAAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104、4.0×104、2.0×104、1.0×104、5.0×103、2.5×103、Negative Control(不加AAV病毒)。BHK21细胞按2.5×105/ml，100ul/孔接种。结果表明，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。图20中的9张照片的排列方式为下表所示意。 
Figure BSA00000461224500171
图21：U937细胞反向感染rAAV2-EGFP病毒实验结果。见申请号为200910009059.6的申请专利的实施例3。预制的rAAV-EGFP阵列晾干后4-8℃放置9天。本图中共有9张拍摄了表达绿色荧光蛋白的细胞的照片，所包被的rAAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：2.6×105、1.3×105、6.4×104、3.2×104、1.6×104、8×103、4×103、2×103、Negative Control(不加AAV病毒)。U937细胞按3.0×105/ml，100ul/孔接种。结果表明，U937细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。图21中的9张照片的排列方式为下表所示意。 
Figure BSA00000461224500172
图22：重组质粒pAAV2neo-luc-142T结构示意图。见申请号为200910009059.6 的申请专利的实施例4。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；luc是萤火虫荧光素酶基因；142T是3个hsa-mir142-3p靶序列定向串联后得到的序列。 
图23：U937、HEK293T细胞各分别转染pAAV2neo-luc和pAAV2neo-luc-142T重组质粒实验结果。见申请号为200910009059.6的申请专利的实施例5。U937细胞以5×104/孔，HEK293T细胞以1×104/孔接种于96孔细胞培养板中。pAAV2neo-luc和pAAV2neo-luc-142T重组质粒分别以0.1μg/孔转染U937或HEK293T细胞。结果表明，转染24小时和48小时后，转染pAAV2neo-luc-142T的U937细胞萤火虫荧光素酶表达量相当于转染等量pAAV2neo-luc的U937细胞1/30或以下，但转染等量的pAAV2neo-luc或pAAV2neo-luc的HEK293T细胞间，细胞萤火虫荧光素酶表达量未见差异。
图24：rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T介导的反向感染U937、HEK293T和Hela细胞实验结果。见申请号为200910009059.6的申请专利的实施例6。预制的rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T阵列晾干后，4℃放置48小时。阵列中每孔包被5×105vg的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T。U937、HEK293T和Hela细胞按5×104/孔接种。结果表明，反向感染24小时后，反向感染等量的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见差异；Hela细胞与HEK293T细胞情况相似，萤火虫荧光素酶表达量也未见差异。相反，在U937细胞中，反向感染rAAV2-luc-142T的细胞中萤火虫荧光素酶的表达量相当于反向感染等量rAAV2-luc细胞的1/20。 
图25：重组质粒pAAV2neo-Gluc-miRNAT结构示意图。见申请号为200910009059.6的申请专利的实施例7。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；AmpR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；miRNAT是一种miRNA靶序列。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例对本发明的AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列作了详细说明，但并不意味着限制该发明的内容。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例1AAV2-EGFP病毒和AAV2-luc病毒的制备 
将EGFP基因和firefly luciferase基因分别插入AAV载体pAAV2neo中，获得重组质粒pAAV2neo-EGFP和pAAV2neo-luc(图18、图19)。用Iipofectamine 2000(Invitrogen)分别转染至BHK21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK-21/pAAV2neo-EGFP和BHK21/pAAV2neo-luc。按文献方法(伍志坚，吴小兵等，一种高效的重组腺伴随病毒生产系统，中国科学(C辑)37(5)：423-430)制备重组AAV2病毒；用”氯仿处理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法(吴小兵等，一种快速和高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通报45(19)：2070-2075)纯化获得粗提液；进一步用肝素柱纯化获得AAV2病毒精纯液(rAAV2-EGFP病毒和rAAV2-luc病毒)。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例2重组AAV病毒的质量控制 
为了有效控制反向感染的AAV病毒阵列对应于细胞培养板上包被的AAV病毒的孔间差异、板间差异和批间差异，须对AAV病毒制备过程进行质量控制，并对AAV病毒进行质量检定，确保AAV病毒的质量符合标准。 
用于反向感染的AAV病毒阵列的AAV病毒，其质量标准和检定方法包含以下几个方面的内容：结构鉴定、基因组滴度(vg)、颗粒滴度(vp)、比活(vp/vg)、血清型鉴定、纯度、目的基因表达活性、酸碱度、无菌检查等。 
1)PCR法鉴定重组AAV的基因片段(结构鉴定) 
重组AAV基因组中含有ITR序列、CMV立早启动子、目的基因及bGH polyA。采用4对引物分别扩增ITR及ITR与CMV启动子连接区；CMV及CMV与目的基因连接区；目的基因及目的基因与bGH polyA连接区；bGH polyA及bGH polyA与ITR连接区以鉴定重组AAV病毒基因组DNA，阳性对照以包装病毒对应质粒DNA为模板，阴性对照以ddH2O为模板。将病毒于100℃煮沸10min，暴露出模板DNA，扩增时50ul体系加样4μl。引物量为30pmol，反应总体积50μl。 
AAV病毒样品经PCR扩增后进行琼脂糖电泳，其迁移率应与对照相一致。 
2)基因组滴度(vg) 
采用DNA斑点杂交法。 
材料：Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)； 方法：按Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)的方法进行。以地高辛标记CMV/目的基因为探针，以系列稀释的AAV病毒包装质粒为标准对照，将样品的杂交信号与标准对照进行比较、定量。 
3)颗粒滴度(vp) 
AAV病毒的颗粒滴度是在AAV病毒满足一定纯度要求(SDS-PAGE纯度≥90％)的条件下，通过测定AAV病毒的蛋白浓度，以经验公式折算，得到其颗粒滴度。 
病毒蛋白浓度测定方法按Pierce公司的BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书进行。 
对AAV2病毒而言，以蛋白浓度(mg/ml)折算颗粒滴度(vp)的经验公式为： 
vp(vp/ml)＝蛋白浓度(mg/ml)×1.33×1014
4)比活(vp/vg) 
基因组滴度代表的是AAV病毒溶液中，目的基因被包装进了病毒的病毒量；颗粒滴度代表的是病毒溶液中病毒颗粒的总的病毒量，包括含有与不含有目的基因的病毒。将AAV病毒的基因组滴度与颗粒滴度结合起来，根据vp与vg的比值，才能更有效地综合判断AAV病毒的质量。 
用于反向感染的AAV病毒阵列的AAV病毒的比活vp/vg控制在10～20之间。 
5)血清型鉴定 
由于不同血清型的SDS-PAGE电泳条带的大小具有特征性，通过对AAV病毒进行SDS-PAGE电泳，通过其电泳条带的大小与标准品比较，可对AAV病毒的血清型进行鉴别。进一步用特异性的抗体加以验证。 
分离胶12％，浓缩胶5％(配制方法见分子克隆第二版)，恒流20mA，电泳约1h。电泳完毕，置于染色盘中，用考马斯亮蓝R250振荡染色2h，之后用脱色液脱色1h。加入的样品量为10μg。2型AAV病毒外壳蛋白电泳后应形成3个特征性条带，其大小分别约为87kD，72kD，62kD。 
6)纯度 
按5)相同的SDS-PAGE方法对AAV病毒进行SDS-PAGE电泳，重组AAV病毒的三种外壳蛋白总量应达到总蛋白量的90.0％以上。 
7)目的基因表达活性 
AAV病毒最主要的质量指标，包装到病毒中去的目的基因的表达活性，直接影响到反向感染的AAV病毒阵列的应用。EGFP和LUC是两个在反向感染的AAV病毒阵列中通用报告基因，它们的表达活性检测方法如下： 
A、EGFP的检测： 
对AAV病毒，按不同血清型，用其对应的敏感细胞作为受试细胞。对AAV2而言，用BHK21细胞作为受试细胞。 
将BHK21细胞按1×105/孔接种到24孔细胞培养板中，过夜培养16～18小时，根据AAV病毒的基因组滴度，按MOI＝1×105加入一定量AAV病毒感染细胞，24小时后于荧光显微镜下观察荧光细胞，荧光细胞占总细胞的比例应大于80％。 
B、LUC的检测： 
对AAV病毒，按不同血清型，用其对应的敏感细胞作为受试细胞。对AAV2而言，用BHK21细胞作为受试细胞。 
将BHK21细胞按1×105/孔接种到24孔细胞培养板中，过夜培养16～18小时，根据AAV病毒的基因组滴度，按MOI＝1×105加入一定量AAV病毒感染细胞，24小时后，直接吸取细胞培养上清用于LUC检测。 
8)酸碱度 
AAV病毒制品的pH值应为7.0-8.0。直接用精密pH试纸测量。 
9)无菌检测 
AAV病毒应无菌，检测方法按现行《中国药典》(三部)附录XIIA进行，应符合规定。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例3AAV病毒包被96孔板和反向转染实验 
为了测试AAV病毒包被在细胞培养板上并在干燥状态下的感染活性，我们将纯化的AAV-EGFP制备成系列梯度稀释的病毒溶液，以5μl/well点在96孔细胞培养板的孔中，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)，制备成反向感染的AAV病毒阵列，然后无菌封闭细胞培养板，置于2～8℃保存。一定的时间点将反向感染的AAV病毒阵列用于贴壁细胞(BHK21)和悬浮细胞(U937)的反向感染，以检测其保存的稳定性。下面是实验是AAV病毒阵列放置9天后进行的。 
将BHK21细胞在消化后用含10％胎牛血清的DMEM制备成2.5×105/m l的细胞悬液，以100ul/孔的细胞量接种于反向感染的AAV病毒阵列，该阵列含有系列梯度的AAV2-EGFP，本实验中所使用的AAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104、4.0×104、2.0×104、1.0×104、5.0×103、2.5×103、Negative Control(不加AAV病毒)。加入细胞后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，于荧光显微镜下观察AAV-EGFP介导的EGFP在细胞中的表达情况，并拍照，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP后24小时的荧光显微镜照片见说明书附图中的图20。结果表明，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。 
U937细胞是悬浮细胞，不需消化。将U937细胞轻轻从培养瓶壁吹下，收集细胞悬液，离心，置换培养上清为新鲜的含10％胎牛血清的DMEM，调整细胞悬液中细胞浓度为3.0×105/ml，以100ul/孔的细胞量接种于反向感染的AAV病毒阵列，该阵列含有系列梯度的AAV2-EGFP，本实验中所使用的AAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：2.6×105、1.3×105、6.4×104、3.2×104、1.6×104、8×103、4×103、2×103、Negative Control(不加AAV病毒)。加入细胞后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，于荧光显微镜下观察AAV-EGFP介导的EGFP在细胞中的表达情况，并拍照。U937细胞反向感染rAAV-EGFP24小时的荧光显微镜照片见说明书附图中的图21。结果表明，U937细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例4携带hsa-mir142-3p靶序列的rAAV2-luc病毒构建和病毒制备 
设计并合成以下两条序列： 
Seq1：5’gaattcgtagactccataaagtaggaaacactacagtagacggatcca 3’ 
Seq2：5’ggatccgtctactgtagtgtttcctactttatggagtctacgaattca 3’ 
将Seq1和Seq1退火后，插入pMD18T simple vector(购自Takara)中，得 到pT-mir142-3pT。以pT-mir142-3pT为模板，以5’gagcggataacaatttcacacagg3’和5’cgccagggttttcccagtcacgac3’为引物，PCR扩增得到含有hsa-mir142-3p靶序列的片段。该片段Accl酶切后的混合物与Accl酶切并去磷处理的pT-mir142-3pT载体片段连接，筛选得到3个hsa-mir142-3p靶序列的克隆(pT-3mir142-3pT)。将含3个hsa-mir142-3p靶序列的片段插入pAAV2neo，得到含有3个hsa-mir142-3p靶序列的pAAV2neo载体。 
将firefly luciferase基因插入含3个hsa-mir142-3p靶序列串联序列的pAAV2neo载体中，获得pAAV2neo-luc-142T(见图22)。用Iipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒pAAV2neo-luc-142T转染至BHK21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK21/pAAV2neo-luc-142T。用申请号为200910009059.6的申请专利的实施例1所述方法制备重组AAV2病毒，命名为rAAV2-luc-142T。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例5用U937细胞检测pAAV2neo-luc-142T中hsa-mir142-3p靶序列的功能 
文献报道，U937细胞中hsa-mir142-3p有较高的内源性表达。因此本实验用U937细胞来测试所构建的pAAV2neo-luc-142T中hsa-mir142-3p靶序列的功能。以HEK293T细胞为阴性对照。将U937、HEK293T细胞分别接种于96孔细胞培养板(DMEM，10％FBS)，其中U9375×104/孔，HEK293T 1×104/孔，各12孔。每种细胞分为4组，每组3个孔，具体转染实验分组见申请号为200910009059.6的申请专利的表一。 
表一： 
Figure BSA00000461224500231
用Iipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒pAAV2neo-luc、pAAV2neo-luc-142T分别以0.1μg/孔转染至U937和H EK293T细胞中。转染24h和48h后，用luciferase assay system(Promega)检测细胞中萤火虫荧光素酶表达情况，试验结果如图23所示。 
由图23所示结果可见，分别转染等量pAAV2neo-luc、pAAV2neo-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见明显差异；相反，U937细胞间则差异显著，转染pAAV2neo-luc-142T的U937细胞萤火虫荧光素酶的表达量相当于转染等量pAAV2neo-luc的U937细胞的1/30或以下，且这种差异不随时间变化。由于内源性的hsa-mir142-3p在HEK293T细胞中不表达(或极低表达)，而U937细胞中高表达，因此U937细胞中萤火虫荧光素酶的表达降低表明所构建的pAAV2neo-luc-142T中hsa-mir142-3p靶序列可被hsa-mir142-3p识别并被有效抑制。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例6AAV病毒介导的反向感染方法比较不同细胞中hsa-mir142-3p的表达活性 
将纯化的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T溶液5×105vg/孔点于96孔细胞培养板孔中，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)，制成含rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T阵列。阵列4℃放置48h后，将HEK293T、U937、Hela细胞接种于其孔中(DMEM，10％FBS，5×104/孔)，每种细胞各接种6孔。即对于每种病毒，一种细胞接种3孔。反向感染24h后，用luciferase assay system(Promega)检测细胞中萤火虫荧光素酶表达水平，试验结果如图24所示。 
从图24的结果看，反向感染等量的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见差异；Hela细胞与HEK293T细胞情况相似，萤火虫荧光素酶表达量也未见差异。相反，在U937细胞中，反向感染rAAV2-luc-142T的细胞中萤火虫荧光素酶的表达量相当于反向感染等量rAAV2-luc细胞的1/20。结果表明，hsa-mir142-3p在HEK293T和Hela细胞中低表达，在U937细胞中高表达。这与hsa-mir142-3p主要在造血细胞系、造血干细胞、T细胞和B细胞中高表达相一致(changzheng Chen，et al.MicroRNA modulate hematopoietic lineage differatiation.science 303，83(2004))。 
申请号为200910009059.6的申请专利的实施例7携带12种miRNA靶序列的AAV病毒阵列制备 
1)12种miRNA靶序列的选取及靶序列的获得 
参考Yu Wang等的报道(Yu Wang et al.J.Cell.Mol.Med.13(1)：12-23，2008.)，选取12种凋亡途径相关的肿瘤细胞中异常表达miRNA为研究对象。从 http://microrna.sanger.ac.uk/网站查找获取这12种miRNA主要的成熟miRNA序列，根据waston-crick碱基配对法则推断出其miRNA完全互补的序列作为相应的靶序列。 
2)序列合成 
在每种miRNA靶序列5’端设计EcoRI酶切产生的突出末端，假定为该种miRNA靶序列正链；在每种miRNA的5’端设计BglII酶切产生的突出末端，假定为该种miRNA靶序列负链。依照此设计原则合成以下每种miRNA靶序列的正负链。 
hsa-mir155-f  5’aattacccctatcacgattagcattaa3’ 
hsa-mir155-r  5’gatcttaatgctaatcgtgataggggt3’ 
hsa-let7a-f   5’aattaactatacaacctactacctca3’ 
hsa-let7a-r   5’gatctgaggtagtaggttgtatagtt3’ 
hsa-mir17-92f 5’aattctacctgcactgtaagcactttg3’ 
hsa-mir17-92r 5’gatccaaagtgcttacagtgcaggtag3’ 
hsa-mir24-f   5’aattctgttcctgctgaactgagcca3’ 
hsa-mir24-r   5’gatctggctcagttcagcaggaacag3’ 
hsa-mir21-f   5’aatttcaacatcagtctgataagcta3’ 
hsa-mir21-r   5’gatctagcttatcagactgatgttga3’ 
hsa-mir15-f   5’aattcacaaaccattatgtgctgcta3’ 
hsa-mir15-r   5’gatctagcagcacataatggtttgtg3’ 
hsa-mir16-f   5’aattcgccaatatttacgtgctgcta3’ 
hsa-mir16-r   5’gatctagcagcacgtaaatattggcg3’ 
hsa-mir29b-f  5’aattaacactgatttcaaatggtgcta3’ 
hsa-mir29b-r  5’gatctagcaccatttgaaatcagtgtt3’ 
hsa-mir127-f  5’aattatcagagccctctgagcttcag3’ 
hsa-mir127-r  5’gatcctgaagctcagagggctctgat3’ 
hsa-mir106b-f 5’aattatctgcactgtcagcacttta3’ 
hsa-mir106b-r 5’gatctaaagtgctgacagtgcagat3’ 
hsa-mir98-f   5’aattaacaatacaacttactacctca3’ 
hsa-mir98-r   5’gatctgaggtagtaagttgtattgtt3’ 
hsa-mir224-f  5’aattaacggaaccactagtgacttg3’ 
hsa-mir224-r  5’gatccaagtcactagtggttccgtt3’ 
3)携带12种miRNA靶序列的rAAV2-Gluc病毒构建和病毒制备 
将合成的每种miRNA靶序列的正负链退火后，插入我们已构建好的pAAV2neo-Gluc中Gaussia荧光素酶基因的3’UTR的EcoRI和BglII位点之间，得到携带miRNA靶序列的pAAV2neo-Gluc-miRNAT(见图25)。用Iipofectamine 2000(Invitrogen)将携带miRNA靶序列的pAAV2neo-Gluc-miRNAT质粒转染至BHK21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK21/pAAV2neo-Gluc-miRNAT。按申请号为200910009059.6的申请专利的实施例1的方法制备和纯化各种AAV2-Gluc-miRNAT病毒。 
4)包含12种AAV2-Gluc-miRNAT的AAV病毒阵列制备 
将12种AAV2-Gluc-miRNAT的AAV病毒按顺序编号(具体见表二)。根据编号顺序，将病毒溶液5×105vg/孔点于96孔细胞培养板孔中(见表三示意)，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)。待完全晾干后无菌封存，于4℃保存备用。 
表二12种AAV2-Gluc-miRNAT的AAV病毒编号 
  miRNA   质粒   病毒   病毒编号
  Control   pAAV2neo-Gluc   rAAV2neo-Gluc   (1)
  hsa-mir155   pAAV2neo-Gluc-155T   rAAV2neo-Gluc-155T   (2)
  hsa-let7a   pAAV2neo-Gluc-let7aT   rAAV2neo-Gluc-let7aT   (3)
  hsa-mir17-92   pAAV2neo-Gluc-17T   rAAV2neo-Gluc-17T   (4)
  hsa-mir24   pAAV2neo-Gluc-24T   rAAV2neo-Gluc-24T   (5)
  hsa-mir21   pAAV2neo-Gluc-21T   rAAV2neo-Gluc-24T   (6)
  hsa-mir15   pAAV2neo-Gluc-15T   rAAV2neo-Gluc-15T   (7)
  hsa-mir16   pAAV2neo-Gluc-16T   rAAV2neo-Gluc-16T   (8)
  hsa-mir29b   pAAV2neo-Gluc-29bT   rAAV2neo-Gluc-29bT   (9)
  hsa-mir127   pAAV2neo-Gluc-127T   rAAV2neo-Gluc-127T   (10)
  hsa-mir106b   pAAV2neo-Gluc-106T   rAAV2neo-Gluc-106T   (11)
  hsa-mir98   pAAV2neo-Gluc-98T   rAAV2neo-Gluc-98T   (12)
  hsa-mir224   pAAV2neo-Gluc-224T   rAAV2neo-Gluc-224T   (13)
[0151] 表三12种AAV2-Gluc-mirT的AAV病毒在96孔板中的排列顺序 
Figure BSA00000461224500271
以下为我们之前申请的申请号为200910223723.7的发明专利的背景介绍，是关于”携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途”的。在申请号为200910223723.7的发明中，我们改进并使用了Gluc报告基因以替代申请号为200910009059.6的专利的申请中所使用的luc报告基因。 
申请号为200910223723.7的发明具体涉及用携带了受miRNA调控表达Gluc基因的重组AAV病毒作为检测活细胞中miRNA活性的生物传感器，即”受miRNA调控表达Gluc基因的重组AAV病毒传感器”，其英文可表述为”rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor”。其中，”rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor”中所提及的”(Fluc)”是结构中所包含的内参基因元件。这种生物传感器检测活细胞中miRNA活性所使用的是AAV病毒反向感染技术。 
rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的基因组的组成元件包括： 
AAV ITR-(polyA-Fluc-PGK promoter)-Insulator-(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)-AAV ITR；其中，(polyA-Fluc-PGK promoter)是Fluc的表达单元；(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)是Gluc的表达单元；Gluc是hGluc(人源化的Gluc)，也可以使用天然的Gluc(Gaussia荧光素酶，Gaussia  luciferase，Gluc)。 
rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的作用是：探测活细胞中能与rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor所携带的miRNA靶序列(”miRNA靶序列”简写为”mirT”)相对应的miRNA的活性。 
将已知的所有mirT分别置于Gluc基因与polyA之间，制备成一系列携带基于Gaussia荧光素酶基因的miRNA传感器，构成一个重组AAV病毒库(rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor库)。将该库中全部的或部分的rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor按相同的Fluc表达效率有序包被在细胞培养支持物上(如96孔板或384孔板)，在无菌条件下制成可长期储存放置的重组AAV病毒阵列。 
应用重组AAV病毒阵列时，将活细胞悬液加入预置了rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor阵列的细胞培养孔板中，重组AAV病毒将”反式感染”所加入的细胞，感染了这些病毒的细胞内的Gluc基因将表达并分泌到培养上清中；细胞内源性miRNA将特异性地和rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor中与之互补的mirT相结合，并对Gluc的表达产生不同程度的抑制作用。通过检测细胞培养上清中Gluc酶的活性，可以比较和计算出细胞内各种miRNA的活性水平。 
其背景是：microRNA(miRNA)是长度在18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。miRNA由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被转录产生。这些miRNA通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到达mRNA，进而产生miRNA阻遏翻译或引导miRNA对mRNA进行酶切的功能。 
最近有研究表明，miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。有研究人员发现线虫体内的异时性基因lin-4编码的miRNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30％的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过700多种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌症发生和发展中发挥作用的miRNA被称作oncogenic miRNA，即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等。 
Lu等人采用串珠流式细胞miRNA表达谱分析技术对来自人恶性肿瘤组织的miRNA进行系统表达分析，其中包括结肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌。miRNA表达谱成功对低分化肿瘤进行了分类。研究揭示了miRNA表达水平在癌症诊断中的重要作用[Lu J，Getz G，Miska EA，et al.(2005).Nature.435，834-838]。Bottoni等人则采用芯片技术及RT-PCR分析了垂体腺瘤和正常垂体样本中的全部miRNA，结果发现miRNA表达水平可以区分垂体微腺瘤和垂体巨腺瘤，还有一些miRNA参与细胞增殖与凋亡的过程。miRNA可以作为有效的诊断标志，提高对垂体腺瘤的分类水平[Bottoni A，Zatelli MC，Ferracin M，et al.(2007).J Cell Physiol.210，370-377.]。Lee等人采用原位RT-PCR技术，经分析发现miR221、miR301和miR376a的异常表达只在胰腺癌细胞中出现，而没有在良性胰腺肿瘤及正常间质和导管处出现。miRNA的异常表达可以作为胰腺肿瘤发生的研究线索，同时也可能为胰腺癌诊断提供新的生物学标志[Lee EJ，Gusev Y，Jiang J，et al.(2007).IntJ Cancer.120，1046-1054.]。 
microRNA在癌症预后判断中的作用：Takamizawa等人报道指出，let-7miRNA的表达往往在人肺癌中缺失，而let-7miRNA表达的减少与术后生存期的减短显著相关。此外，let-7miRNA在A549肺腺癌细胞株中的过表达可在体外抑制肺癌细胞的生长。他们的研究结果表明了let-7miRNA表达水平的改变具有潜在临床和生物学作用[Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.(2004).Cancer Res.64，3753-3756.]。Yanaihara等人的研究可以区分肺癌组织和非恶性肿瘤组织的miRNA表达模式。前体miRNA hsa-miR155的高表达和hsa-let-7a-2的低表达与肺腺癌的低生存率相关。他们的研究表明，miRNA不仅可以作为肺癌的诊断学标志，还可以作为预后预测的标志[Yanaihara N，Caplen N，Bowman E，et al.(2006).Cancer Cell.9，189-198]。Roldo等人则发现，miR21在胰腺肿瘤中的过表达与高Ki67增殖指数及出现肝转移高度相关。他们的研究结果表明，miRNA表达水平的改变与恶性肿瘤的进展状态相关[Roldo C，Missiaglia E，Hagan JP，et al.(2006).J Clin Oncol.24，4677-4684.]。此外，Bloomston等人将胰腺癌细胞中的miRNA的表达水平与正常胰腺和慢性胰腺炎组织细胞的miRNA进行比较，结果发现，胰腺癌细胞中miRNA表达水平与后两者不同，可以有效区分开来。miR196a-2的高表达可以用于预测不良预后[Bloomston M，Frankel WL，Petrocca F，et al. (2007).JAMA.297，1901-1908.]。 
某些miRNA表达状态受到癌细胞中表观遗传学改变的控制，比如DNA甲基化和组蛋白修饰。采用染色质修饰药物激活肿瘤抑制性miRNA可以靶向调节癌基因，这一策略也许能在不久的将来成为癌症的新型治疗方法。miRNA可以与基因组学、蛋白质组学中的生物学标志相结合，成为癌症诊断和判断预后的参考指标[Cho WC.(2007).Mol Cancer.6，25.；Cho WC，Cheng CH.(2007).Expert Rev Proteomics.4，401-410.]。尽管每个miRNA可以调控成百个靶向基因，但在癌症研究中鉴别出miRNA的准确靶点仍然是一大难题。此外，由于干细胞可以分化发育成为多种类型的细胞，因而成为研究者们瞩目的焦点。已有研究指出miRNA通路在干细胞分化中起调控作用，而其机制是否可用于癌症的预防与治疗还需要进一步研究[Cho WC.A future of cancer prevention and cures：highlights of the Centennial Meeting of the American Association for Cancer Research.(2007).Ann Oncol.]。miRNA在多种病理过程中的功能的发现，使得对疾病进行分子水平的诊断和预后预测成为可能，对于癌症尤其如此。 
Andrew Fire和Craig Mello因发现RNA干扰现象——双链RNA诱导的基因沉默而获2006年度诺贝尔奖。自从在一些生物体内发现相互作用的反义RNA具有调控功能以来，转录后的基因调节便跻身于主要基因调控机制的行列。miRNA通过碱基互补诱导RNA干扰路径，从而抑制靶向mRNA。数以百计的miRNA的发现使我们对于RNA干扰现象在生物医学上的意义有了全新的认识。研究者的目光开始集中于利用反义寡核苷酸抑制miRNA功能，或者采用小干扰RNA类技术研究miRNA。科学家们致力于揭开miRNA生物学的神秘面纱，挖掘其在疾病治疗方面的应用潜力。对患者进行的有关oncomiR的大型高通量研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的预测。联合基因组学、微RNA组学(miRomics)以及蛋白质组学的高通量靶向分析，有助于我们进一步发现miRNA的调节靶点。 
下表罗列出部分microRNA的表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后的关系： 
  microRNA   肿瘤发生   诊断   预后
  miR9   神经母细胞瘤    
  miR10b   乳腺癌    
[0168] 
  miR15、miR15a   白血病、垂体腺瘤    
  miR16、miR16-1   白血病、垂体腺瘤    
  miR17-5p、miR17-92   肺癌、淋巴瘤    
  miR20a   肺癌、淋巴瘤    
  miR21   乳腺癌、胆管腺癌、头颈癌、白血病、     胰腺癌
  miR29、miR29b   白血病，胆管腺癌    
  miR31   结肠直肠癌    
  miR34a   胰腺癌     神经母细胞
  miR96   结肠直肠癌    
  miR98   头颈癌    
  miR103   胰腺癌    
  miR107   白血病、胰腺癌    
  miR125a、miR125b   神经母细胞瘤、乳腺癌    
  miR128   胶质母细胞瘤    
  miR133b   结肠直肠癌    
  miR135b   结肠直肠癌    
  miR143   结肠癌、宫颈癌    
  miR145   乳腺癌、结肠直肠癌    
  miR146   甲状腺癌    
  miR155   乳腺癌、白血病、胰腺癌     肺癌
  miR181、miR181a、   白血病、胶质母细胞瘤、甲状腺癌    
  miR183   直肠结肠癌    
  miR184   神经母细胞瘤    
  miR196a-2       胰腺癌
  miR221   胶质母细胞瘤、甲状腺癌   胰腺  
  miR222   甲状腺癌    
  miR223   白血病    
  miR301     胰腺  
  miR376     胰腺  
  let-7、let-7a、let-7a-1、   肺癌、结肠癌     肺癌
[0169] 随着miRNA及其调控作用机理的研究和发现，miRNA在生物学及医学中的应用前景越来越宽阔。miRNA检测技术迅速发展。目前，研究组织细胞中miRNA表达差异的方法主要包括基因芯片、QRT-PCR和northern blot等，它们都需从组织细胞中提取RNA，技术、成本较高，费时费力，且不能反映miRNA是否有活性。 
生物传感器法使实时监测活细胞中miRNA活性成为可能。其原理是利用一个报告基因表达质粒，在报告基因的3’UTR区(终止密码子之后，polyA加尾信号之前)插入一个或多个拷贝的、完全或不完全匹配的mirT，构成miRNA传感器质粒(miRNA sensor plasmid)[Miranda，K.C.，Huynh，T.，Tay，Y.et al.2006.Cell，126，1203-1217.]；将该种质粒导入细胞，细胞内源性的miRNA或外源性导入的miRNA若能与其携带的靶序列匹配结合，就会一定程度抑制报告基因的表达；通过检测报告基因的表达可反映细胞中该种miRNA的活性。各种miRNA传感器质粒主要的区别在于所采用的报告基因的种类、表达载体的元件组成、插入的mirT的拷贝数、报告基因表达的检测方法和方式、质粒导入方式等。 
2004年Jennifer H Mansfield等[NATURE GENETICS 36(10)：1079，2004]设计了基于β-半乳糖苷酶(β-galactosase，LacZ)报告基因的miRNA传感器，揭示了miRlet-7，miRlet-7e，miR10a，miR1a，miR196a等的miRNA在脊椎动物胚胎发育过程中的时空表达规律。 
2006年美国专利公布了一种miRNA传感器质粒(miRNA sensor plasmid)的组成及用其检测体内内源性miRNA的方法(Monitoring miRNA expression and function，US20060265771A1)。该专利强调了利用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因来组建传感器质粒的优势：将传感器质粒注射到动物体内后，由于SEAP可分泌入血，因此可通过采集血样来检测其中SEAP的活性，而不需处死动物。为避免注射后动物产生针对SEAP的免疫反应，该专利采用鼠源性SEAP代替人源SEAP。它还公布了用不同启动子构建的miRNA传感器在体内表达持续时间的不同：CMV启动子/增强子介导的表达在肝脏14天内沉默，而在肌肉中则不会。 
各种报告基因被用于miRNA传感器：萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)基因[Christine Esau，et al.The Journal of Biological Chemistry，2004，279，52361-52365.；Yong Zhao，et al.Nature，2005，436，214-220.]、海肾荧光素酶(Renilla luciferase，Rluc)[Margaret S Ebert，et al.Nature Methods， 2007，4，721-726.；Vincent Boissonneault，et al.The Journal of Biological Chemistry，2009，284，1971-1981.]、绿色荧光蛋白(EGFP)[Julius Brennecke，et al.PLoS Biology，2005，3(3)，404-418，e85.]、红色荧光蛋白(RFP)等，在应用中各有缺陷。如检测Fluc和Rluc的活性都需裂解细胞，EGFP和RFP则不易定量。 
Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)是一种新型荧光素酶类报告基因，来源于桡角类海洋生物Gaussia princeps。Gluc酶由185个氨基酸组成，分子量19.9KD.。Gluc酶的编码基因长555bp，是目前所有报告基因中最短的。Gluc酶以单体形式存在，催化底物coelenterazine的氧化反应产生480nm光，该反应不需ATP参与。人源化的Gluc(hGluc)酶在哺乳动物细胞中表达产生的生物荧光信号强度比hRluc(人源化的海肾荧光素酶)至少强100倍以上。Gluc酶有一个16个氨基酸组成的天然信号肽，可有效将Gluc酶分泌到细胞外(＞80％)。故可在不裂解细胞和破坏组织的情况下检测其表达情况。(Codon-Optimized Gaussia Luciferase cDNA for Mammalian Gene Expression in Culture and in Vivo MOLECULAR THERAPY Vol.11，No.3，March 2005)。与分泌型的碱性磷酸酶(SEAP)相比，Gluc酶的检测灵敏度要高20000倍[Badr，C.E.，Hewett，J.W.，et al.PLoS ONE 2，e571(2007)]。且Gluc的检测方法比SEAP更简便和快速。 
申请号为200910223723.7的发明的概述：本发明的技术特征是：1)建立了一种携带基于Gaussia荧光素酶(Gluc)基因的miRNA传感器的重组AAV病毒，替代质粒型miRNA传感器，称为rAAV-Gluc-miRNA传感器(rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor)，用于简便高效地检测和监测活细胞中miRNA活性。所述的rAAV-Gluc-miRNA传感器是由pAAV-(Fluc)-Gluc-mirT质粒包装成重组AAV病毒而来。rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的基因组的组成元件包括：AAVITR-(polyA-Fluc-PGK promoter)-Insulator-(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)-AAV ITR；其中，(polyA-Fluc-PGK promoter)是Fluc的表达单元；(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)是Gluc的表达单元；Gluc是hGluc(人源化的Gluc)，也可以使用天然的Gluc(Gaussia荧光素酶，Gaussia luciferase，Gluc)。2)将已知的所有mirT(如公布在http://www.mirbase.org网 站上各种mirT)分别置于Gluc基因与polyA之间，(mirT的酶切定向插入位点为BglII和EcoRI)，制备成一个携带基于Gluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库，称为rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor库。这个库中的每种重组AAV病毒都携带了一个不同的mirT。当新的miRNA被发现后，可以按同样的技术路线将其制备成相应的rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor补充到库中。3)在AAV病毒的两个ITR之间、Gluc表达盒之外插入了一个独立的萤火虫荧光素酶Fluc基因表达盒，目的是作为AAV病毒定量的内参照。所述的Fluc基因表达盒由启动子、Fluc基因及polyA组成，为避免Gluc表达盒中mirT与Fluc基因表达之间因内源性miRNA调控而相互干扰，在Fluc基因表达盒的一侧或两侧放置绝缘子序列。Fluc基因表达盒的作用是将包装好的各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNAsensor病毒的滴度调整至具有相同的Fluc转染表达效率。4)利用AAV载体可在干燥情况下存放而不失去感染活性的特点，将携带不同的mirT的rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor按需组合成rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor阵列，通过”反向感染”方式导入活细胞中，可更简洁、高效地实现同时检测和监测细胞中多种miRNA活性、绘制miRNA活性谱的目的，也有利于控制误差。5)采用了一种高灵敏度和特异性的分泌型荧光素酶基因，即hGluc基因作为miRNA传感器的报告基因，利用hGluc酶可高效分泌至培养细胞的上清中的特性，在不需要裂解细胞的情况下通过不同时间点连续取出微量培养上清进行hGluc酶活性测定，可实现hGluc表达的动态监测。6)利用hGluc酶在体外培养的细胞上清中可十分稳定地存在的特性(半衰期＞6天)，对测得的hGluc酶活性数据(相对光子数，RLU)进行计算处理，使之能有效消除不同的rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNAsensor在病毒滴度、感染活性方面的差异。本发明可用于活细胞中miRNA活性谱测定，以及用于测定各种干预因素(如各种药物、试剂、理化因素等)对细胞中miRNA活性谱的影响。这种生物传感器检测活细胞中miRNA活性所使用的是AAV病毒反向感染技术。 
申请号为200910223723.7的发明的详述：将外源基因和/或基因元件导入细胞、使其在细胞中表达或阻断其它基因的表达，是分子生物学中常用技术，称为转导(transduction)。这个过程往往需要载体(vector)和导入系统(delivery system)来介导。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体通 常是借助人工制备或合成的材料如脂质体、壳聚糖、多聚阳离子化合物等将DNA质粒”包裹”成复合物导入细胞中，这个过程通常被称为”转染”(transfection)。而病毒载体则借助病毒天然的感染能力将”搭载”的外源基因和元件序列导入细胞中，这个过程和病毒的天然感染过程相似，也被称为”感染”。 
目前各种miRNA传感器都是质粒结构。在应用时需用转染的方法将其导入细胞中才能发挥”探测”miRNA活性的作用。如果要探测细胞中miRNA活性谱，就需要分别转染多种miRNA传感器质粒，这在操作上十分麻烦，而且也不利于控制误差。 
申请号为200910223723.7的发明专利的创新处在于采用AAV为载体来替代质粒携带miRNA，即用AAV病毒型miRNA传感器替代质粒型传感器。这样就由miRNA传感器质粒的转染方式变成了rAAV-miRNA传感器的感染方式，避免了繁琐的质粒转染过程操作及带来的误差。 
之所以选择AAV载体，是考虑到AAV载体是一种”干净”的病毒载体，病毒颗粒中包裹的基因组只有两端的ITR(145个核苷酸)来自AAV病毒，其余基因元件均非AAV病毒来源，包括miRNA传感器组成元件：启动子、Gluc基因、mirT、polyA加尾信号以及作为内参照的Fluc基因表达盒。 
rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的基因组组成元件及构建顺序为：AAV ITR-(polyA-Fluc-PGK promoter)-Insulator-(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)-AAV ITR；其中，(polyA-Fluc-PGK promoter)是Fluc的表达单元；(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)是Gluc的表达单元；Gluc是hGluc(人源化的Gluc)，也可以使用天然的Gluc[Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)]。 
与其它病毒载体如常用的腺病毒载体相比，AAV病毒感染细胞后引起的细胞基因表达变化明显少，尤其是对于致病基因和炎症相关基因的转录谱变化很小(Role of Viral Vectors and Virion Shells in Cellular Gene Expression Molecular Therapy.Vol.9，No.3，March 2004)，AAV病毒载体的使用中所产生的非常少的”背景”这个优点，使得AAV病毒被我们选择做为比较理想的miRNA传感器载体。 
阵列(array)技术已经广泛用于生物技术领域。其中最为常见的是DNA Array(基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化稳定性和独特的碱基配对结构，而成为理想阵列材料。比如将多种合成的寡核苷酸(单链DNA)作为探针有序地排列固定 在表面经过处理的玻片上制成”微阵列”(芯片)，而将待检测的样品提取核酸，用地高辛标记的随机引物进行扩增和标记后与芯片上的探针杂交，最后显色获得杂交信号。根据信号所在的探针位置来判断样品中有与该探针序列互补的序列。除了DNA外，多肽和蛋白(包括抗体)也被成功地用来制成阵列，用于蛋白检测。阵列(Array)技术的优势是具备高通量的特点，即一次检测能同时获得样品与多个探针作用的信息。传统的Southern杂交、Northern杂交和Western杂交都是将样品经过电泳分离后转印到膜上，而用标记的探针来进行检测。如果把这样的操作顺序称为”正向”方式，那么，阵列技术是将已知信息的物质(探针)排布成点阵，而加入被检测的对象进行检测就可称为”反向”方式。 
rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor导入细胞是依靠AAV病毒对细胞的感染性实现的。本发明的rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor可以用”正向感染”或”反向感染”来转导细胞。”正向感染”是指先将细胞接种在培养器皿中，再加入病毒进行感染，研究者常采用此法。”反向感染”(reverse infection)是先将重组病毒预先包被在孔板中，再加入细胞来实现感染。”反向感染”方式有利于制备传感器阵列，实现多个传感器同步导入细胞，极大地简化了操作步骤，也有利于质量控制。本发明中，生物传感器检测活细胞中miRNA活性所使用的是AAV病毒反向感染技术。 
将AAV病毒纯品溶液的滴度用PBS2+溶液调整稀释至Fluc在293细胞中的表达效率一致。表达效率用每ml病毒液中Fluc基因表达活性表示，单位是RLU/ml。将Fluc表达效率相等的各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor包被在细胞培养支持物(如96孔板、384孔板等)上，形成有序的AAV病毒阵列(AAV Array)；使用时将等量的细胞悬液加入AAV阵列中，实现对细胞的反向感染；通过分析感染24～48h的细胞上清中Gluc基因表达活性，与不含miRNA靶序列的对照质粒rAAV-Gluc孔相比较，可以获得细胞中内源性miRNA活性的相对高低的数据，从而绘制出内源性miRNA的活性谱。 
与正向感染相比，AAV病毒反向感染技术有以下可以被利用的优点： 
1)包被了AAV病毒的细胞培养板可在干燥状态下长期保存(1年以上)而不失去感染活性和效率。2)有利于对转感染效率的质量控制；3)AAV病毒对大多数细胞体外转染都具有较高的转染效率；4)有利于高通量转导细胞。5)制备AAV病毒阵列时，AAV病毒在培养板上的”包被”不需化学反应交联，可自然吸附晾干。 
AAV病毒是一种无包膜的纳米级颗粒(直径约20nm)，正二十面体对称，结构比较”刚性”，对pH值、温度、盐浓度变化及有机溶剂(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很强的耐受性，便于存放。将AAV病毒溶液置于56℃水浴中2小时，其感染活性几乎不下降；而同样的条件处理逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或腺病毒，病毒感染活性都几乎全部丧失。我们曾经利用AAV病毒对有机溶剂的高耐受性发明了一种快速高效纯化AAV病毒的方法(专利号：99123723.4)。其中利用AAV病毒耐受有机溶剂的特性，在粗纯化过程中用三氯甲烷处理细胞悬液以使大量宿主蛋白变性沉淀而除去，进一步用三氯甲烷抽提含有AAV病毒的溶液，弃去有机相而保留水相，获得的AAV病毒纯度可达到80％以上。 
我们研究发现，纯化的AAV病毒在适当配方的溶液中可在-70℃保存5年以上，在4℃保存2年以上，在室温保存6个月以上。说明AAV病毒制品具良好的稳定性。 
我们还发现，包被在细胞培养孔板(如96孔板)上的重组AAV病毒阵列可在干燥状态下长期保存(4℃保存1年以上)而不失感染活性。说明AAV病毒在干燥状态下能保持其感染性。与AAV病毒相比，腺病毒虽然也无包膜，结构也相对稳定，但用同样条件包被在细胞培养孔板上，晾干后感染效率比在溶液状况下明显下降，加入细胞后的转染效率在1‰以下。对于有包膜的病毒如逆转录病毒和慢病毒，由于病毒有包膜，导致病毒的稳定性对外界环境变化敏感，亦不能很好地耐受干燥环境，因此用反向转染方法时也只能够在溶液状态下操作，不能晾干保存。AAV病毒能在干燥环境下保持感染活性这个特性使其成为反向感染技术最合适的病毒之一。 
批量生产AAV病毒阵列能长期保存(4℃保存1年以上)。这种预制好的AAV病毒阵列产品，在应用时只要每孔加入等量的细胞就能实现转染，与”正向感染”相比可有效消除因繁琐的转染操作带来的误差，并使应用操作变得简便。 
各种血清型的AAV病毒都可以用于制备AAV病毒阵列。AAV2病毒研究得最多，是最早建立成载体系统的AAV病毒。对其结构和感染特性的研究也最为深入。AAV2的主要细胞受体是硫酸肝素糖蛋白(HSPG)，辅助受体是bFGF1受体、整合素αvβ5。各种血清型的AAV病毒体内外转导效率极不一致。比如对体外培养的BHK21细胞和HEK293细胞，AAV2-EGFP的表达水平明显高于同等用量的AAV1或AAV8病毒，而小鼠肌肉注射时AAV1-EGFP和AAV8-EGFP则比同等剂量的AAV2-EGFP病毒表达水平高20～100倍以上。由于AAV2病毒能有效感染多种体 外培养的细胞，并且用肝素柱能十分有效地获得高纯度的AAV2病毒，因此，AAV2在制备AAV病毒阵列上有优势。另外，对AAV病毒外壳基因进行分子改造，可以获得具有新的感染特性的AAV病毒，用于制备有某种感染特性的AAV病毒阵列。由于AAV病毒对大多数细胞具有感染能力、容量合适、安全性好、稳定性好等优点，因此，本发明采用了腺病毒相关病毒(AAV)载体来导入基因。 
将携带报告基因和mirT的DNA或重组病毒导入细胞中，通过检测报告基因的表达水平，可以反映出细胞相对应的内源性miRNA的活性。导入的DNA的主要结构包括”启动子-报告基因-mirT-polyA”。作用原理是细胞中相对应的内源性miRNA与导入DNA的mirT结合，在RISC作用下使位于其上游的报告基因表达受到抑制。 
本发明提出将反向转染的AAV病毒阵列用做检测各种细胞内miRNA水平和变化的生物传感器。具体方法是，将国际上已经发现的mirT分别置于报告基因Gaussia luciferase(hGluc)基因的3’UTR区，包装成AAV病毒，制备成AAV病毒阵列，在阵列中设不带microRNA靶序列的AAV病毒为对照。用于检测细胞中miRNA活性。hGluc是分泌型的荧光素酶，能够在不裂解细胞的情况下检测荧光素酶的活性，实现miRNA活性的活细胞检测。进一步，可以比较各种因素影响下对细胞中miRNA活性的影响。这些因素包括药物、病毒感染、基因转染、温度和pH值等理化变化。 
人类基因组中miRNA的种类预计在1000种左右。http://www.mirbase.org/网站目前收录了700余种。查找mirT的方法是，登录该网站，进入miRBase Database主页，点击Targets，链接到miRBase Targets Database，点击enter，在显示界面选择miRNA所属物种。点击view，从显示界面中选择该miRNA，再点击其所属的view按钮，显示即为该种miRNA的预测的靶基因，点击view显示该miRNA在这个靶基因中的靶序列。 
申请号为200910223723.7的专利申请的发明先构建了一种通用型miRNA传感器载体pAAV2neo-Gluc-polyA(见图14)。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有酶切位点(BglII和EcoR I)供mirT插入。将待插入的mirT假定为正链，其互补链假定为负链。在正负链的5’端分别设计相应的限制性酶切点的突出末端序列，人工合成正负链，正负链退火后形成具有匹配粘性末端的双链DNA，插入pAAV2neo-Gluc-polyA质粒的Gluc基因与polyA之间的相应酶切位点之间。 
为有效控制细胞培养板上每孔包被的AAV病毒质量、孔间差异、板间差异和生 产的批间差异，通过对AAV病毒制备过程进行质量控制和AAV病毒的质量检定。然而，即使如此还是很难保证制备的各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒具有相同的感染性和表达效率。 
申请号为200910223723.7的专利申请的发明在通用型miRNA传感器载体pAAV2neo-Gluc-polyA的基础上进一步构建了一套携带内参照的通用型miRNA传感器载体pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA(图3)。在AAV载体的启动子上游插入一个做内参照用的Fluc表达盒，用来校正不同rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒的感染性滴度，这可保证不会因rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒的感染性滴度不同而影响对miRNA活性高低的判断。所述的Fluc表达盒是一个组成型表达单位，组成是：PGK启动子-Fluc-SV40late polyA组成；Fluc表达盒的转录方向与Gluc基因的转录方向相反；在Fluc表达盒与Gluc基因表达单位之间用绝缘子(Insulator)序列隔开，目的是使内参照Fluc的表达不受各种mirT插入的影响。 
插入的mirT的拷贝数一个就足以起到调控Gluc表达的目的；也可以插入多个拷贝的mirT以增强调控效果，但一个阵列中各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的mirT拷贝要保持一致。为了构建操作的简便易行，本发明采用了插入单拷贝的mirT来构建miRNA传感器。 
按所述方法，把所有已经发现了的miRNA相应的互补序列作为靶序列，分别插入pAAV2neo-(Fluc)-Gluc载体中，得到一系列pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT重组载体质粒；将这些AAV载体质粒分别制备成rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒，将全部或部分rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒组合制备成AAV病毒-miRNA靶序列阵列(AAV病毒-mirT阵列)。可以把制备的所有种类的AAV病毒做成一套全AAV病毒-mirT阵列，也可以选择一种或几种或一组相关的mirT所在的AAV病毒制备成特定用途的AAV病毒-mirT阵列。 
所述的AAV病毒-mirT阵列可以用于检测细胞培养不同代次的内源性miRNA活性谱的变化。尤其是对于常用的基因工程生产细胞如Vero、CHO、HEK293、BHK21、MDCK等细胞不同代次传代的细胞中内源性miRNA活性谱的变化，有可能成为判定其实质性变化如致瘤性等的特异签名。 
所述的AAV病毒-mirT阵列还可以用于比较加药前后、转染前后、感染病毒前后细胞的内源性miRNA活性谱的变化。 
所述的AAV病毒-mirT阵列还可以用于检测血液中白细胞的内源性miRNA活性谱的变化，与免疫指标结合，成为判断机体免疫状况的新指标。 
所述的AAV病毒-mirT阵列可以用于进行临床肿瘤标本的活细胞中基因元件miRNA活性谱检测。具体的操作流程是：将取自临床的无菌的肝癌组织标本，用胰酶进行消化处理，用含10％胎牛血清的DMEM将经胰酶消化处理后的肿瘤标本的细胞制备成2.5×105/ml的原代肿瘤细胞悬液，加入肝癌原代细胞悬液后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，检测Gluc在细胞中的表达情况，反映出细胞中内源性miRNA活性的高低(通过计算给出miRNA高低分级)，从而有利于肿瘤的诊断、治疗以及预后判断。本发明中所使用的Gluc基因是hGluc基因，基因大小为558bps，也可以用Gluc基因。hGluc基因序列如下： 
5’atgggagtcaaagttctgtttgccctgatctgcatcgctgtggccgaggccaagcccaccgagaacaacgaagacttcaacatcgtggccgtggccagcaacttcgcgaccacggatctcgatgctgaccgcgggaagttgcccggcaagaagctgccgctggaggtgctcaaagagatggaagccaatgcccggaaagctggctgcaccaggggctgtctgatctgcctgtcccacatcaagtgcacgcccaagatgaagaagttcatcccaggacgctgccacacctacgaaggcgacaaagagtccgcacagggcggcataggcgaggcgatcgtcgacattcctgagattcctgggttcaaggacttggagcccatggagcagttcatcgcacaggtcgatctgtgtgtggactgcacaactggctgcctcaaagggcttgccaacgtgcagtgttctgacctgctcaagaagtggctgccgcaacgctgtgcgacctttgccagcaagatccagggccaggtggacaagatcaagggggccggtggtgactaa3’ 
申请号为200910223723.7的专利申请的附图说明： 
图14重组质粒pAAV2neo-Gluc-polyA结构图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例1。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGHpolyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有供mirT定向插入的酶切位点Bgl II和EcoR I。 
图15重组质粒pAAV2neo-Gluc-142T＊3结构示意图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例2。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末 端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；142T＊3是3个hsa-mir142-3p靶序列定向串联后得到的序列，图中标示为紧邻的3个miR142T。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有供3个miR142T定向插入的酶切位点Bgl II和EcoR I。 
图16重组质粒pAAV2neo-Gluc-142T结构示意图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例2。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；miR142T是hsa-mir142-3p靶序列。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有供142T定向插入的酶切位点Bgl II和EcoR I。 
图3重组质粒pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA质粒图谱。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例4。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；PGK promoter是人磷酸甘油酸激酶的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；SV40late poly(A)signal是SV40病毒晚期蛋白表达的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；Fluc是萤火虫荧光素酶基因；Insulator是来源于人类16号染色体上的转录终止序列。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有供mirT定向插入的酶切位点Bgl II和EcoR I。 
图4重组质粒pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT质粒图谱。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例5和6。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；PGK promoter是人磷酸甘油酸激酶的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；SV40late poly(A)signal是SV40病毒晚期蛋白表达的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；Fluc是萤火虫荧光素酶基因；Insulator是来源于人 类16号染色体上的转录终止序列；mirT是某种miRNA的单个靶序列。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有供mirT定向插入的酶切位点BglII和EcoRI。 
图26重组质粒pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-142T质粒图谱。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例5。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；PGK promoter是人磷酸甘油酸激酶的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；SV40late poly(A)signal是SV40病毒晚期蛋白表达的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；Fluc是萤火虫荧光素酶基因；Insulator是来源于人类16号染色体上的转录终止序列；miR142T是hsa-miR142-3p的单个靶序列。在Gluc基因的3’UTR区(Gluc和polyA之间)有供142T定向插入的酶切位点Bgl II和EcoRI。 
图13rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor基因组结构图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例8。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；PGK promoter是人磷酸甘油酸激酶的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；SV40late poly(A)signal是SV40病毒晚期蛋白表达的加尾信号序列；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；Fluc是萤火虫荧光素酶基因；Insulator是来源于人类16号染色体上的转录终止序列；mirT是某种miRNA的单个靶序列。 
图17不同拷贝数的mirT调控效果的比较。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例3。重组质粒pAAV2neo-Gluc-polyA、pAAV2neo-Gluc-142T和pAAV2neo-Gluc-142T＊3在U937细胞培养上清中Gluc活性(RLU值)柱图。结果显示，转染等量的pAAV2neo-Gluc-142T或pAAV2neo-Gluc-142T＊3的细胞培养上清中Gluc活性与转染等量的pAAV2neo-Gluc-polyA的细胞培养上清中Gluc活性差异显著(P＜0.05)。 
图18重组质粒pAAV2neo-EGFP的图谱，即其结构示意图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例11。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末 端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；EGFP是绿色荧光蛋白基因；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因。 
图19重组质粒pAAV2neo-luc的图谱，即其结构示意图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例11。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；luc是萤火虫荧光素酶基因。 
图20BHK21细胞反向感染rAAV2-EGFP病毒实验结果。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例12。预制的rAAV-EGFP阵列晾干后4-8℃放置9天。本图中共有9张拍摄了表达绿色荧光蛋白的细胞的照片，所包被的rAAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104、4.0×104、2.0×104、1.0×104、5.0×103、2.5×103、Negative Control(不加AAV病毒)。BHK21细胞按2.5×105/ml，100ul/孔接种。结果表明，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。图20中的9张照片的排列方式为下表所示意。 
Figure BSA00000461224500431
图21U937细胞反向感染rAAV2-EGFP病毒实验结果。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例12。预制的rAAV-EGFP阵列晾干后4-8℃放置9天。本图中共有9张拍摄了表达绿色荧光蛋白的细胞的照片，所包被的rAAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：2.6×105、1.3×105、6.4×104、3.2×104、1.6×104、8×103、4×103、2×103、Negative Control(不加AAV病毒)。U937细胞按3.0×105/ml，100ul/孔接种。结果表明，U937细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。图21中的9张照片的排列方式为下表所示意。 
Figure BSA00000461224500432
图22重组质粒pAAV2neo-luc-142T结构示意图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例13。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；luc是萤火虫荧光素酶基因；142T是3个hsa-mir142-3p靶序列定向串联后得到的序列。 
图23U937、HEK293T细胞各分别转染pAAV2neo-luc和pAAV2neo-luc-142T重组质粒实验结果。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例14。U937细胞以5×104/孔，HEK293T细胞以1×104/孔接种于96孔细胞培养板中。pAAV2neo-luc和pAAV2neo-luc-142T重组质粒分别以0.1μg/孔转染U937或HEK293T细胞。结果表明，转染24小时和48小时后，转染pAAV2neo-luc-142T的U937细胞萤火虫荧光素酶表达量相当于转染等量pAAV2neo-luc的U937细胞1/30或以下，但转染等量的pAAV2neo-luc或pAAV2neo-luc的HEK293T细胞间，细胞萤火虫荧光素酶表达量未见差异。 
图24rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T介导的反向感染U937、HEK293T和Hela细胞实验结果。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例15。预制的rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T阵列晾干后，4℃放置48小时。阵列中每孔包被5×105vg的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T。U937、HEK293T和Hela细胞按5×104/孔接种。结果表明，反向感染24小时后，反向感染等量的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见差异；Hela细胞与HEK293T细胞情况相似，萤火虫荧光素酶表达量也未见差异。相反，在U937细胞中，反向感染rAAV2-luc-142T的细胞中萤火虫荧光素酶的表达量相当于反向感染等量rAAV2-luc细胞的1/20。 
图25重组质粒pAAV2neo-Gluc-miRNAT结构示意图。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例16。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；AmpR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc 是Gaussia荧光素酶基因；miRNAT是一种mirT。 
图27rAAV-(Fluc)-Gluc和rAAV-(Fluc)-Gluc-142T检测细胞内miR142-3p活性。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例10。结果显示，两种病毒分别反向感染HEK293细胞后，细胞培养上清中hGluc活性未见差异。但两种病毒分别反向感染K562、U937、P815和SP2/0，细胞培养上清中hGluc活性差异显著，且差异为SP2/0＞K562＞U937、P815。 
图28rAAV-(Fluc)-Gluc和rAAV-(Fluc)-Gluc-142T在检测细胞内活性比较。见申请号为200910223723.7的发明专利的实施例10。结果显示，rAAV-(Fluc)-Gluc和rAAV-(Fluc)-Gluc-142T在同种细胞中的荧光素酶表达未见差异。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例： 
以下实施例对本发明的rAAV-Gluc-miRNA传感器(rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNAsensor)及rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor阵列技术作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例1通用型miRNA传感器载体pAAV2neo-Gluc-polyA质粒构建 
以pGluc-Basic(购自NEB公司)为模板，设计并合成引物，以获得Gluc基因： 
引物1(Primer 1)：5’cttggtaccagccaccatgggagt3’ 
引物2(Primer 2)：5’ccggaattccggccgcttagtcac3’ 
下划线标记为限制性酶切位点，用于将PCR产物克隆入pAAV2neo表达质粒，引物1中的酶切位点为KpnI，引物2为EcoRI。具体的PCR过程为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(DV805A)回收纯化，于KpnI和EcoRI(NEB)双酶切体系中消化2至3h，并同时用相同的双酶切体系消化pAAV2neo质粒载体。然后用T4DNA Ligase(NEB)连接回收纯化后的酶切产物和载体片段，连接产物转化DH5  a MAXEfficiency感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切测序鉴定正确，获得pAAV2neo-Gluc-polyA(附图14)。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例2pAAV2neo-Gluc-142T＊3及重 组质粒pAAV2neo-Gluc-142T质粒构建 
1)含3个hsa-mir142-3p靶序列串联序列的pAAV2neo载体构建 
从http://www.mirbase.org/网站搜索得到hsa-mir142-3p的序列：5’uguaguguuuccuacuuuaugga3’，根据waston-crick碱基配对法则推断出has-mir142-3p完全互补的mirT：5’tccataaagtaggaaacactaca3’。设计并合成以下两条序列： 
序列一(Seq 1)：5’gaattcgtagactccataaagtaggaaacactacagtagacggatcca 3’ 
序列二(Seq 2)：5’ggatccgtctactgtagtgtttcctactttatggagtctacgaattca 3’ 
将序列一和序列二退火后，插入pMD18T simple vector(购自Takara)中，得到pT-mir142-3pT。以pT-mir142-3pT为模板，以5’gagcggataacaatttcacacagg3’和5’cgccagggttttcccagtcacgac3’为引物，PCR扩增得到含有hsa-mir142-3p完全互补的靶序列的片段。该片段Accl酶切后的混合物与Accl酶切并去磷处理的pT-mir142-3pT载体片段连接，筛选得到3个hsa-mir142-3p完全互补靶序列的克隆(pT-3mir142-3pT)。将含3个hsa-mir142-3p完全互补靶序列插入pAAV2neo，得到含有hsa-mir142-3p靶序列的pAAV2neo载体。 
2)携带3个hsa-mir142-3p靶序列串联序列的pAAV2neo-Gluc-142T＊3质粒构建 
以pGluc-Basic(购自NEB公司)为模板，设计并合成引物(与申请号为200910223723.7的发明专利的实施例1中引物1、引物2相同)： 
引物1(Primer 1)：5’cttggtaccagccaccatgggagt3’ 
引物2(Primer 2)：5’ccggaattccggccgcttagtcac3’ 
下划线标记为限制性酶切位点，用于将PCR产物克隆入pAAV2neo表达质粒，引物1中的酶切位点为KpnI，引物2为EcoRI。具体的PCR过程为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(DV805A)回收纯化，于KpnI和EcoRI(NEB)双酶切体系中消化2至3h，并同时用相同的双酶切体系消化携带3个has-mir142-3p靶序列的pAAV2neo载体。然后用T4DNA Ligase(NEB)连接回收纯化后的酶切产物和载体片段，连接产物转化DH5  a MAX Efficiency感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切测序鉴定正确，获得pAAV2neo-Gluc-142T＊3(附图15)。 
3)携带单个hsa-mir142-3p靶序列的pAAV2neo-Gluc-142T质粒构建 
同理从http://www.mirbase.org/网站搜索得到hsa-mir142-3p的序列：5’uguaguguuuccuacuuuaugga3’，根据waston-crick碱基配对法则推断出hsa-mir142-3p完全互补的靶序列：5’tccataaagtaggaaacactaca3’。同时假定hsa-mir142-3p完全互补的靶序列为正链，hsa-mir142-3p序列为负链。在正链的5’端设计EcoRI酶切后产生的突出末端”5’aatt3’”，负链的5’端设计BglII酶切后产生的突出末端”5’gatc3’”，合成以下142T(为hsa-mir142-3p的mirT)的两条序列： 
序列三(Seq 3)：5’aatttccataaagtaggaaacactaca3’ 
序列四(Seq 4)：5’gatctgtagtgtttcctactttatgga3’ 
将序列三和序列四退火后得到产物插入pAAV2neo-Gluc-polyA质粒的EcoRI和BglII之间，获得pAAV2neo-Gluc-142T(见附图16)。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例3一个拷贝的mirT与3个拷贝的mirT调控效果的比较 
U937细胞以5000/孔的密度接种于96孔细胞培养板。随即，用Iipofectamine2000(invitrogen)将重组质粒pAAV2neo-Gluc-polyA、pAAV2neo-Gluc-142T和pAAV2neo-Gluc-142T＊3以0.1μg每孔转染至U937细胞内，每种质粒重复三次。转染48h后，每孔取20μl细胞培养上清，用Gaussia luciferase Assay Kit(NEB)测定细胞培养上清中Gluc活性，获得RLU(Relative Light Unit)值。试验结果(见图17)显示，转染等量的pAAV2neo-Gluc-142T或pAAV2neo-Gluc-142T＊3的细胞培养上清中Gluc活性与转染等量的pAAV2neo-Gluc-polyA的细胞培养上清中Gluc活性差异显著(P＜0.05)。但转染pAAV2neo-Gluc-142T和pAAV2neo-Gluc-142T＊3间无明显差异(P＞0.05)，表明mirT为一个或三个拷贝对靶基因的调控效果没有明显差异。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例4通用型miRNA传感器载体pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA质粒构建 
1)Insulator-PGK-Fluc-SV40late polyA表达框的获得： 
设计并合成引物： 
引物3(Primer 3)：5’cagggtaccattctaccgggtagg3’ 
引物4(Primer 4)：5’attggatcctcgaaaggcccggag3’ 
下划线标记处为限制性酶切位点，引物3中的酶切位点为Kpnl，引物4为EcoRI；将PGK(human phosphoglycerase kinase)启动子定向插入pGL4.14[Luc2/hugro]vector(Promega)，获得包含insulatorPGK-Fluc-SV40late polyA表达框的质粒pGL4.14-PGK。具体过程为： 
PCR扩增PGK启动子，过程为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(DV805A)回收纯化，于Kpnl和EcoRI(NEB)双酶切体系中消化2至3h，并同时用相同的双酶切体系消化pGL4.14[Luc2/hugro]vector。然后用T4DNA Ligase(NEB)连接回收纯化后的酶切产物和载体片段，连接产物转化DH5  a MAX Efficiency感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切测序鉴定正确，获得pGL4.14-PGK。 
2)insulatorPGK-Fluc-SV40late polyA表达框插入pAAV2neo-Gluc-polyA表达载体： 
以pGL4.14-PGK为模板，设计并合成以下引物： 
引物5(Primer 5)：5’gaactcgagtggacaggccgcaat3’ 
引物6(Primer 6)：5’caactcgaggagcgcccaatacgc3’ 
下划线标记处为限制性酶切位点，引物5、6中的酶切位点均为Xhol，将insulatorPGK-Fluc-SV40late polyA表达框插入pAAV2neo-Gluc-polyA表达载体。具体过程为：PCR扩增insulatorPGK-Fluc-SV40late polyA表达框，过程为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(DV805A)回收纯化，于Kpnl和EcoRI(NEB)双酶切体系中消化2至3h，并同时用相同的双酶切体系消化pAAV2neo-Gluc-polyA载体。然后用T4DNA Ligase(NEB)连接回收纯化后的酶切产物和载体片段，连接产物转化DH5 a MAX Efficiency感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切测序鉴定正确，获得重组质粒pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA(见图3)。该重组质粒包装成重组病毒后，此rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的基因组的组成元件包括：AAV ITR-(polyA-Fluc-PGK promoter)-Insulator-(CMV promoter-Gluc-mirT -polyA)-AAV ITR；其中，(polyA-Fluc-PGK promoter)是Fluc的表达单元；(CMV promoter-Gluc-mirT-polyA)是Gluc的表达单元；Gluc是hGluc(人源化的Gluc)，也可以使用天然的Gluc(Gaussia荧光素酶，Gaussia luciferase，Gluc)。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例5一组免疫相关的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA质粒构建 
1)15种免疫相关miRNA的选取及靶序列的获得 
依据参考文献(Letizia Venturini，Karin Battmer，et al.Blood，2007，109，4399-4405.David Baltimore，Mark P Boldin，et al.Nature immunology，2008，9(8)，839-845.Changchun Xiao and Klaus Rajewsky.Cell，2009，136，26-36.)，选取15种免疫系统发育、分化和病变相关的miRNA。从http://www.mirbase.org/网站查找获取这15种与免疫系统发育、分化和病变相关的miRNA的成熟miRNA序列，并根据waston-crick碱基配对法则推断出15种miRNA完全互补的序列作为靶序列。 
2)序列合成 
合成上述这15种与免疫系统发育、分化和病变相关的miRNA的成熟miRNA序列及其靶序列如下： 
在每种成熟miRNA序列的5’端设计一个末端序列”5’AATT3’”，这个序列经过EcoR I酶切后将产生一个突出末端； 
在每种miRNA完全互补靶序列的5’端设计一个末端序列”5’GATC3’”，这个序列经过Bgl II酶切后将产生一个突出末端。 
依照此设计原则合成以下序列： 
hsa-mir15a-f   5’aattcacaaaccattatgtgctgcta3’ 
hsa-mir15a-r   5’gatctagcagcacataatggtttgtg3’ 
hsa-mir16-f    5’aattcgccaatatttacgtgctgcta3’ 
hsa-mir16-r    5’gatctagcagcacgtaaatattggcg3’ 
hsa-mir17-5p-f 5’aattctacctgcactgtaagcactttg3’ 
hsa-mir17-5p-r 5’gatccaaagtgcttacagtgcaggtag3’ 
hsa-mir17-3p-f 5’aattctacaagtgccttcactgcagt3’ 
hsa-mir17-3p-r   5’gatcactgcagtgaaggcacttgtag3’ 
hsa-mir18a-f     5’aattctatctgcactagatgcacctta3’ 
hsa-mir18a-r     5’gatctaaggtgcatctagtgcagatag3’ 
hsa-mir19a-f     5’aatttcagttttgcatagatttgcaca3’ 
hsa-mir19a-r     5’gatctgtgcaaatctatgcaaaactga3’ 
hsa-mir20a-f     5’aattctacctgcactataagcacttta3’ 
hsa-mir20a-r     5’gatctaaagtgcttatagtgcaggtag3’ 
hsa-mir19b-f     5’aatttcagttttgcatggatttgcaca3’ 
hsa-mir19b-r     5’gatctgtgcaaatccatgcaaaactga3’ 
hsa-mir92a-f     5’aattacaggccgggacaagtgcaata3’ 
hsa-mir92a-r     5’gatctattgcacttgtcccggcctgt3’ 
hsa-mir146a-f    5’aattaacccatggaattcagttctca3’ 
hsa-mir146a-r    5’gatctgagaactgaattccatgggtt3’ 
hsa-mir146b-5p-f 5’aattagcctatggaattcagttctca3’ 
hsa-mir146b-5p-r 5’gatctgagaactgaattccataggct3’ 
hsa-mir150-f     5’aattcactggtacaagggttgggaga3’ 
hsa-mir150-r     5’gatctctcccaacccttgtaccagtg3’ 
hsa-mir155-f     5’aattacccctatcacgattagcattaa3’ 
hsa-mir155-r     5’gatcttaatgctaatcgtgataggggt3’ 
hsa-mir181a-f    5’aattactcaccgacagcgttgaatgtt3’ 
hsa-mir181a-r    5’gatcaacattcaacgctgtcggtgagt3’ 
hsa-mir223-f     5’aatttggggtatttgacaaactgaca3’ 
hsa-mir223-r     5’gatctgtcagtttgtcaaatacccca3’ 
3)与免疫相关的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA质粒构建将上述每种miRNA序列和其靶序列退火后所形成的DNA片段，插入到已构建好的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA中Gluc基因的3’UTR的酶切位点中，得到携带每种mirT的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA(见图4)。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例6一组肿瘤相关的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA质粒构建 
1)15种肿瘤相关miRNA的选取及靶序列的获得 
依据参考文献(M.Osaki，et al.，Biomarkers，2008，13(7-8)，658-670.Mary Dillhoff，et al.Journal of surgical research，2009，154，349-354.Massimo Negrini，et al.Current Opinion in Cell Biology，2009，(21)，470-479.)，选取15种与肿瘤发生、迁移和进程相关的miRNAs。从http://www.mirbase.org/网站查找获取15种miRNA的成熟miRNA序列，根据waston-crick碱基配对法则，推断出这15种miRNA完全互补的序列作为靶序列。 
2)序列合成 
合成上述这15种与肿瘤发生、迁移和进程相关的miRNA的成熟miRNA序列及其靶序列如下： 
在每种成熟miRNA序列的5’端设计一个末端序列”5’AATT3’”，这个序列经EcoRI酶切后将产生一个突出末端； 
在每种miRNA完全互补靶序列(mirT)的5’端设计一个末端序列”5’GATC3’”，这个序列经BglII酶切后将产生一个突出末端。 
依照上述设计原则合成以下配对序列： 
hsa-let-7d-f    5’aattaactatgcaacctactacctct3’ 
hsa-let-7d-r    5’gatcagaggtagtaggttgcatagtt3’ 
hsa-mir10b-f    5’aattcacaaattcggttctacagggta3’ 
hsa-mir10b-r    5’gatctaccctgtagaaccgaatttgtg3’ 
hsa-mir21-f     5’aatttcaacatcagtctgataagcta3’ 
hsa-mir21-r     5’gatctagcttatcagactgatgttga3’ 
hsa-mir34a-f    5’aattacaaccagctaagacactgcca3’ 
hsa-mir34a-r    5’gatctggcagtgtcttagctggttgt3’ 
hsa-mir34b-f    5’aattatggcagtggagttagtgattg3’ 
hsa-mir34b-r    5’gatccaatcactaactccactgccat3’ 
hsa-mir34c-5p-f 5’aattgcaatcagctaactacactgcct3’ 
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3)肿瘤相关的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA质粒的构建 
将每种配对序列-f和-r(即，miRNA序列与它的靶序列)退火后，插入我们已构建好的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA中Gluc基因的3’UTR，得到携带每种mirT的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA(图4)。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例7rAAV病毒制备 
将携带不同mirT的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT-polyA质粒分别转染至BHK-21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株的BHK-21。按文献方法(伍志坚，吴小兵等，一种高效的重组腺伴随病毒生产系统，中国科学(C辑)37(5)：423-430)制备重组AAV2病毒；用”氯仿处理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法(吴小兵等，一种快速和高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通报45(19)：2070-2075)纯化获得粗提液；进一步用肝素柱纯化获得rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒制品。-70℃保存。 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例8用Fluc表达作为内参照校正各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的感染滴度 
按申请号为200910223723.7的发明专利的实施例7方法制备出一系列rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒(见表四)。用点杂交方法测定其基因组滴度(vg/ml)。在24孔板上接种HEK293细胞，2×105cells/well。次日按2×1010vg/well加入各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒，36h后去上清，裂解细胞，测定Fluc的表达值(RLU/well)。结果见表五。将各测定值除以rAAV-(Fluc)-Gluc的测定值作为校正参数，计算出各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的感染滴度。结果提示，经过内参照Fluc的校正，可以获得各种rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor的”真实”感染滴度。 
表四系列rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒列表 
Figure BSA00000461224500531
Figure BSA00000461224500551
表五系列rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor病毒的感染滴度列表 
Figure BSA00000461224500552
Figure BSA00000461224500561
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例9rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor阵列制备 
1、rAAV-(Fluc)-Gluc-mirT病毒制备 
用lipofectamine 2000(lnvitrogen)将pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-PolyA(图4)和携带每种mirT的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT(见图4)质粒分别转染至BHK21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK21/pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-PolyA和BHK21/携带每种mirT的pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT。用携带AAV2repcap基因的单纯疱疹病毒HSV1-RC(moi1～5)感染这些载体细胞株，60～72hr收集细胞和培养上清。用”氯仿处理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法纯化获得粗提品；进一步用肝素柱纯化获得rAAV2-(Fluc)-Gluc病毒精纯品和携带每种mirT的rAAV2-(Fluc)-Gluc-mirT病毒精纯品。 
2、用准备好病毒制备AAV病毒阵列 
将制备好的病毒按顺序编号，具体顺序编号见表六(免疫相关miRNAs)、表八(肿瘤相关miRNAs)。 
根据编号顺序点样制备与免疫相关miRNAs的AAV病毒阵列，阵列排布见表七(免疫相关miRNAs)。 
根据编号顺序点样制备与肿瘤相关miRNAs的AAV病毒阵列，阵列排布见表九(肿瘤相关miRNAs)。 
AAV病毒阵列的点样制备的具体方法：将病毒溶液5×105vg/孔，点样于96孔细胞培养板孔中，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)。待完全晾干后，于4℃保存备用。 
表六与免疫相关的miRNAs的对应的mirT的质粒和病毒的列表编号 
Figure BSA00000461224500562
表七与免疫相关miRNAs的AAV病毒阵列排布 
Figure BSA00000461224500572
Figure BSA00000461224500581
表八与肿瘤相关miRNAs的对应的mirT的质粒和病毒的列表编号 
Figure BSA00000461224500582
表九与肿瘤相关miRNAs的AAV病毒阵列排布 
申请号为200910223723.7的专利申请的实施例10rAAV-(Fluc)-Gluc-142T检测U937、K562、HEK293、P815和SP2/0细胞中miRNA活性 
按校正后的基因组滴度，将制备好的rAAV-(Fluc)-Gluc、rAAV-(Fluc)-Gluc-142T病毒按照一定的顺序，分别以5×108vg/孔，反向包被点样于96孔细胞培养板孔中，每种病毒各点15孔，即对于某种病毒，每种细胞有3个复孔。在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)。待完全晾干后，每孔加入5×104个细胞(培养液为10％FBS/DMEM)，于37℃孵箱中，5％CO2培养。48hr后，每孔取20μl细胞培养上清，用Gaussia luciferase Assay Kit(NEB)检测细胞培养上清中Gaussia荧光素酶活性，获得RLU(Relative Light Unit)值。试验结果见图27。同时将每孔中细胞用1×PBS2-清洗三次，然后加入50μl的1×细胞裂解液(RLB)，反复冻融三次，混匀，获得细胞裂解液。取20μl细胞裂解液，用Luciferase Assay system(Promega)检测细胞裂解液中荧光素酶活性，试验结果见图28。 
从图28可以看出，rAAV-(Fluc)-Gluc和rAAV-(Fluc)-Gluc-142T在同种 细胞中的荧光素酶表达未见差异。这说明校正后的基因组滴度真实地反映了病毒的感染和表达活性，使通过检测同种细胞两种反向病毒分别感染后细胞培养上清中Gaussia荧光素酶活性差异，推测该种细胞内miR142-3p活性成为可能。在此基础上，我们检测细胞培养上清中的Gaussia荧光素酶活性，结果如图27所示。从图27可知，两种病毒分别反向感染HEK293细胞后，细胞培养上清中Gaussia荧光素酶活性未见差异。但两种病毒分别反向感染K562、U937、P815和SP2/0，细胞培养上清中Gaussia荧光素酶活性差异显著，而且这种差异为SP2/0＞K562＞U937、P815。这表明HEK293细胞中miR142-3p活性较低或无活性，而K562、U937、P815和SP2/0等造血干细胞来源细胞中miR142-3p活性较高。这与miR142-3p主要在造血干细胞来源细胞中表达相一致。 
到此，本案的背景介绍结束。 
发明概述 
本发明的第一个技术特征是建立了一种基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法miRNA Asensor Array，具体地说，即携带miRNA活性检测单元的AAV载体组成miRNA活性检测阵列miRNA Asensor Array，通过细胞反向感染方法进行miRNA Asensor Array的检测，而过程中，只需要检测报告基因表达水平的比较，即可得出被检测细胞的miRNA活性谱。应用miRNA Asensor Array除了可以检测细胞miRNA活性谱以外，还可以鉴定细胞种类和来源、检测各种因素对细胞miRNA活性谱的影响、研究miRNA作用调节机制等。该方法简单、方便和快捷地实现了细胞内miRNA活性的高通量检测，为细胞miRNA活性谱的制作、细胞内miRNA活性谱影响因素的研究提供了新的选择。 
本发明的第二个技术特征是miRNA Asensor Array由多种miRNA Asensor按照一定顺序预先包被于细胞培养板上，无菌晾干制备而成，可在2-8℃保存一年以上，方便miRNA Asensor Array的运输和使用。 
本发明的第三个技术特征是每个单独的miRNA Asensor在基因结构上均由包含两个独立的表达框：Gluc表达框和Fluc表达框，两个表达框之间被绝缘子序列隔开；其中Gluc表达框用于检测细胞内的miRNA活性，Fluc表达框用于校正不同miRNAAsensor之间的转导效率差异。 
在Gluc表达框中，Gluc基因的3’UTR插入了单个的、与某种miRNA完全互补的靶序列，该靶序列可被细胞内源性的相对应的这种miRNA识别、结合，并可因此抑制受该靶序列表达调控的Gluc基因的表达，通过检测Gluc基因的表达水平，可指示该被检测细胞内这种miRNA的活性。 
而在Fluc表达框中则不携带miRNA靶序列，不能被内源的miRNA识别、结合，因此Fluc的表达水平并不能指示细胞内的miRNA活性，这个指标是用于校正不同种类的AAV病毒对细胞的转导效率的差异和误差的。 
而在miRNA Asensor Array阵列中，组成miRNA Asensor分为携带miRNA靶序列的和不携带miRNA靶序列的两类，miRNA活性检测时，通过检测比较这两类miRNA Asensor报告基因差异得出miRNA活性。 
因此，本发明的第四个技术特征是利用Fluc的表达水平来指示miRNA Asensor的转导效率，用转导系数来表示miRNA Asensor转导效率的高低，转导系数的计算方法是将特定的miRNA Asensor(如不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor：Control Asensor)的转导系数设定为1，其余的miRNA Asensor的转导系数则为特定细胞中某种miRNA Asensor的Fluc表达水平与特定miRNA Asensor的Fluc表达水平的比值。而且，由于miRNA Asensor Array制备过程中AAV病毒制备和点样过程的标准化操作流程，因此同一批次(相同的病毒和相同点样流程)制备的miRNA AsensorArray具有相同的转导系数。这样就可以有效地量化miRNA Asensor转导效率的高低，校正因不同miRNA Asensor转导效率差异而导致的miRNA Asensor Array测量误差。这不仅简化了miRNA活性测定的操作过程，还避免因反复测定Fluc表达水平导致的测量误差。 
本发明的第五个技术特征是miRNA Asensor Array中的miRNA Asensor均为AAV2病毒载体，这是因为AAV2病毒载体不仅对pH值、热和盐浓度变化以及有机溶剂具有很强的耐受性，而且能够高效地转导多种细胞，同时AAV病毒载体基因组中仅包含AAV病毒基因两端的ITR序列，不携带其他AAV病毒编码基因，降低了因病毒载体转导而导致的细胞miRNA活性的变化。 
当然，使用AAV2病毒载体携带miRNA做为Asensor Array高通量miRNA活性检测方法的这种选择，并不意味着排斥和取消了其它血清型的AAV病毒载体的选择和使用，当检测特定的细胞时，可以根据该细胞对AAV的血清型的易感性选择合 适的血清型的AAV来携带miRNA做为Asensor Array，如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其任意两种型别的嵌合病毒等。 
本案所述的高通量miRNA活性检测方法，其特征在于，可用于检测全部明确成熟序列的miRNA的活性，miRNA包括天然的和人工设计的且无物种限制。 
本案所述的高通量miRNA活性检测方法的应用，其特征在于，通过检测细胞miRNA活性谱，筛选获得细胞特定时空条件下的特征miRNA活性谱，利用特征miRNA活性谱推测细胞的一系列特征(如来源、种类、生理特征等)或评价外界因素(如药物、转基因、环境变化等)对细胞的作用效果。 
发明详述 
miRNA在诸多的生理病理过程中发挥重要作用，因此了解细胞内miRNA的表达水平和活性水平具有重要的作用和意义。虽然已有多种miRNA表达水平的检测方法，但仍然缺乏一种有效的miRNA活性高通量检测方法。本发明以miRNA抑制基因表达的原理为基础，利用AAV病毒载体稳定高、转导细胞谱广和对转导细胞影响小等特点，建立了一种高通量的miRNA活性检测方法miRNA Asensor Array，应用该方法我们检测了细胞的miRNA活性谱、比较分析了一些外界因素(如转基因、药物)对细胞miRNA活性谱的影响以及检测得出了特定细胞的特征miRNA活性谱。 
高通量miRNA活性谱检测方法的建立必须以高效的高通量细胞转导方法为基础。其原因是miRNA活性检测方法以miRNA抑制细胞内基因表达的原理为基础，为了检测细胞内某种miRNA的活性需要构建该种miRNA的活性检测Sensor，即在3’UTR区携带检测miRNA单个和多个靶序列的报告基因的载体。然后将该载体转染检测细胞，测定报告基因的表达水平，并与转染3’UTR区不携带检测miRNA靶序列的报告基因的载体的细胞报告基因的表达水平比较，分析得出细胞内该检测miRNA的活性。如果高通量地检测多种miRNA的活性，就需要构建多种miRNA的活性检测Sensor并把其导入检测细胞中。这需要高效的高通量外源基因细胞导入方法。高效的高通量细胞转导方法的建立又与以miRNA活性检测Sensor的载体类型相关。载体通常分为病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体通常是借助人工制备或合成的材料如脂质体、壳聚糖、多聚阳离子化合物等将DNA质粒”包裹”成复合物导入细胞中，这个过程通常被称为”转染”(transfection)。而病毒载体则借助病毒 天然的感染能力将”搭载”的外源基因和元件序列导入细胞中，这个过程和病毒感染过程相似，也被称为”感染”(infection)。 
目前多数miRNA活性检测Sensor都是质粒结构。在应用时需要用转染的方法将其导入细胞中才能发挥”探测”miRNA活性的作用。如果要探测细胞中miRNA活性谱，就需要分别转染多种miRNA传感器质粒，这在操作上十分麻烦，而且也不利于控制误差。 
本发明的创新之处在于采用AAV为载体来替代质粒载体携带miRNA活性检测元件(即本发明中miRNA Asensor的Gluc表达单元)，也就是说用AAV病毒型miRNA活性检测Sensor(miRNA Asensor)替代质粒型miRNA活性检测Sensor(miRNA Dsensor)。这样miRNA活性检测Sensor的导入方式就由质粒型miRNA活性检测Sensor的转染方式变成了miRNA Asensor的感染方式，避免了繁琐的质粒转染过程操作及带来的误差。 
之所以选择AAV载体，是考虑到AAV载体是一种”干净”的病毒载体，病毒颗粒中包裹的基因组只有两端的ITR(145个核苷酸)来自AAV病毒，其余基因元件包括miRNA活性传感器元件，包括启动子、Gluc基因、miRNA靶序列、polyA加尾信号以及作为内参照的Fluc基因表达盒。与其它病毒载体如常用的腺病毒载体相比，AAV病毒感染细胞后引起的细胞基因表达变化明显少，尤其是对于致病基因和炎症相关基因的转录谱变化很小(Stilwell JL，Samulski RJ.Role ofviral vectors and virion shells in cellular gene expression.Molecular Therapy，2004，9(3)：337-346.)，使得AAV病毒成为比较理想的miRNA传感器载体。 
阵列(array)技术已经广泛用于生物技术领域。其中最为常见的是DNA Array(基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化稳定性和独特的碱基配对结构，而成为理想阵列材料。比如将多种合成的寡核苷酸(单链DNA)作为探针有序地排列固定在表面经过处理的玻片上制成”微阵列”(芯片)，而将待检测的样品提取核酸，用地高辛标记的随机引物进行扩增和标记后与芯片上的探针杂交，最后显色获得杂交信号。根据信号所在的探针位置来判断样品中有与该探针序列互补的序列。除了DNA外，多肽和蛋白(包括抗体)也被成功地用来制成阵列，用于蛋白检测。阵列(Array)技术的优势是具备高通量的特点，即一次检测能同时获得样品与多个探针作用的信息。传统的Southern杂交、Northern杂交和Western杂交都是将样品经过 电泳分离后转印到膜上，而用标记的探针来进行检测。如果把这样的操作顺序称为”正向”方式，那么，阵列技术是将已知信息的物质(探针)排布成点阵，而加入被检测的对象进行检测就可称为”反向”方式。 
miRNA Asensor导入细胞是依靠AAV病毒对细胞的感染性实现的。本发明的miRNA Asensor可以用”正向感染”和”反向感染”两种方式转导细胞。所述的”正向感染”，是指先将细胞接种在培养器皿中，再加入病毒进行感染，即研究者通常的做法。而”反向感染”(reverse infection)指的是先将所使用的重组病毒预先包被在孔板中，之后再加入细胞来实现感染。“反向感染”方式有利于制备传感器阵列，实现多个传感器同步导入细胞，极大地简化了操作步骤，也有利于质量控制。 
在本发明中，我们将制备好的多种纯品miRNA Asensor用“经过组分修订的”PBS2+溶液调整稀释至相同的物理滴度(以viral genome/mL(vg/mL)表示)后，按照一定的顺序把这些miRNA Asensor点样于96孔细胞培养板，放置于无菌操作台中过夜晾干，于2-8℃保存，制备获得了用于细胞miRNA活性谱检测的阵列：miRNA Asensor Array。虽然miRNA Asensor以相同的物理滴度接种，但由于点杂交法测定miRNA Asensor的物理滴度准确性不高以及miRNA Asensor间的品质差异，因此miRNA Asensor间的转导效率差异较大。为此，本发明在miRNA Asensor的基因组中加入了Fluc表达框，该表达框不仅转录方向与用于miRNA活性检测的Gluc表达框相反，而且两者之间还被绝缘子序列隔开，降低了非相关转录激活顺式元件的影响。我们用miRNA Asensor中Fluc的表达水平来表示miRNA Asensor的转导效率，进一步我们提出了转导系数(Transduction coefficient，TC)的概念，用转导系数表示miRNA Asensor间的转导效率的高低，校正miRNA Asensor间的转导效率差异。在本发明中，我们通过计算所使用115种miRNA Asensor的转导系数(表2)，并有效地校正了miRNA Asensor间的转导效率差异。而且由于miRNA Asensor Array制备过程中的标准化操作流程，极大地降低了同一批次制备的miRNA AsensorArray间的差异，因此可以合理的认为同一批次制备的miRNA Asensor Array具有相同的转导系数，避免转导系数的反复测定，简化了利用miRNA Asensor Array检测细胞miRNA活性谱的过程。这也是本发明的一个重要创新之处。 
同时，miRNA AsensorArray采用了反向感染技术，因此使用时具有以下优点： 
1)miRNA Asensor Array可以在干燥状态下长期保存(1年以上)而不失去感染 活性和效率； 
2)有利于对转导效率的质量控制； 
3)有利于进行高通量转导细胞。 
4)制备miRNA Asensor Array时，miRNA Asensor与培养板之间的包被不必要进行化学反应交联，只需要自然的吸附和晾干。 
miRNA Asensor Array以AAV病毒载体为运载工具。AAV病毒是一种无包膜的纳米级颗粒(直径约20nm)，正二十面体对称，结构比较”刚性”，对pH值、温度、盐浓度变化及有机溶剂(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很强的耐受性，因此便于存放。将AAV病毒溶液置于56℃水浴中2小时，其感染活性几乎不下降；而同样的条件处理逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或腺病毒，病毒感染活性都几乎全部丧失。我们曾经利用AAV病毒对有机溶剂的高耐受性发明了一种快速高效纯化AAV病毒的方法(专利号：99123723.4)。其中利用AAV病毒耐受有机溶剂的特性，在粗纯化过程中用三氯甲烷处理细胞悬液以使大量宿主蛋白变性沉淀而除去，进一步用三氯甲烷抽提含有AAV病毒的溶液，弃去有机相而保留水相，获得的AAV病毒纯度可达到80％以上。 
我们在研究中发现，纯化的AAV病毒在适当配方的溶液中可以在-70℃保存5年以上，在4℃保存2年以上，在室温下保存6个月以上。说明AAV病毒制品本身具有良好的稳定性。 
我们的研究还发现，包被在细胞培养孔板(如96孔板)上的重组AAV病毒阵列可以在干燥状态下长期保存(4℃保存1年以上)而不失去感染活性。说明AAV病毒在干燥状态下仍能够保持其感染性。与AAV病毒相比，腺病毒虽然也没有胞膜，结构也相对稳定，但用同样的条件包被在细胞培养孔板上，晾干后感染效率比在溶液状况下明显下降，加入细胞后的转染效率在1‰以下。对于有胞膜的病毒如逆转录病毒和慢病毒，由于病毒的胞膜稳定性对外界环境变化敏感，亦不能很好地耐受干燥环境，因此用反向转染方法时也只能够在溶液状态下操作，不能晾干保存。AAV病毒能在干燥环境下保持感染活性这个特性使其成为反向感染技术最合适的病毒之一。 
批量生产AAV病毒阵列能长期保存(4℃保存1年以上)。这种预制好的AAV病毒阵列产品，在应用时只要每孔加入等量的细胞就能实现转导，与”正向感染”相 比可以有效消除由于繁琐的转染操作带来的误差，并使应用变得操作简便。 
各种血清型的AAV病毒都可以用于制备AAV病毒阵列。AAV2病毒研究得最多，是最早建立成载体系统的AAV病毒。对其结构和感染特性的研究也最为深入。AAV2的主要细胞受体是硫酸肝素糖蛋白(HSPG)，辅助受体是bFGF1受体、整合素αvβ5。各种血清型的AAV病毒体内外转导效率极不一致。比如对体外培养的BHK21细胞和HEK293细胞，AAV2-EGFP的表达水平明显高于同等用量的AAV1或AAV8病毒，而小鼠肌肉注射时AAV1-EGFP和AAV8-EGFP则比同等剂量的AAV2-EGFP病毒表达水平高20～100倍以上。由于AAV2病毒能有效感染多种体外培养的细胞，并且用肝素柱能十分有效地获得高纯度的AAV2病毒，因此，AAV2在制备AAV病毒阵列上有优势。另外，对AAV病毒外壳基因进行分子改造，可以获得具有新的感染特性的AAV病毒，用于制备有某种感染特性的AAV病毒阵列。 
本发明中，考虑到AAV2病毒具有一定的泛嗜性，对多种细胞均具有较高的感染效率，我们选择了AAV2病毒载体携带miRNA活性检测元件。如果某种血清型AAV对某种细胞转导效率更高，为了更有效地检测该种细胞中的miRNA活性，也可特定地制备以该种血清型AAV病毒载体为运载工具的miRNA活性检测阵列，如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其任意两种型别的嵌合病毒等。 
在成功建立miRNA Asensor Array的基础上，我们首先利用miRNA Asensor Array检测12种细胞的miRNA活性谱，结果表明miRNA Asensor Array能够有效地检测细胞的miRNA活性；然后我们利用miRNA Asensor Array比较了HEK293和HEK293T细胞的miRNA活性谱，发现相比于HEK293，HEK293T中miR21、let7a活性降低，miR17-5p活性上升。这表明外源基因的导入可能会导致细胞内miRNA活性的改变。接下来，利用miRNA Asensor Array测定细胞中具有相同seed sequence(种子序列)的miRNA活性，以Let7家族为例，结果表明miRNA Asensor Array 不能有效地检测出具有相同seed sequence的一类miRNA中每个miRNA的单独活性，检测出的miRNA活性为具有相同seed sequence的一类miRNA多个miRNA活性的加和，这与实际上的生理情况一致。因为miRNA主要通过seed sequence识别靶序列，因此具有相同seed sequence的miRNA可以识别同一靶序列，抑制其表达。最后，我们利用miRNA Asensor Array探索了化学物质作用前后细胞miRNA活性谱 的变化。miRNA Asensor Array有效地检测出了K562细胞在TPA(Phorbol12-myristate 13-acetate)诱导前后miRNA活性谱的变化。因此miRNA Asensor Array不仅可以应用细胞miRNA活性谱的制作，了解细胞内的miRNA活性情况，还可以用于探索某些因素(如转基因、药物等)对细胞miRNA活性谱的影响。同时，由于不同种类或具有不同生理病理特征的细胞均呈现出特定的miRNA活性谱，因此通过检测细胞的miRNA活性谱还可以判断细胞的种类和鉴定细胞的生理病理特征。更进一步，检测特定的miRNA活性谱，还可以用于筛选药物、判断某些因素(如小分子物质是否能够有效地诱导终末分化细胞重新编程成为干细胞)对某些生理过程的作用。 
miRNA Asensor Array用Gluc表达框探测细胞中的miRNA活性。Gluc(Gaussia luciferase)是一种新型荧光素酶类报告基因，来源于桡角类海洋生物Gaussia princeps。Gluc酶由185个氨基酸组成，分子量为19.9KDa.。Gluc酶的编码基因长555bp，是目前所有报告基因最短的。Gluc酶以单体形式存在，催化底物coelenterazine的氧化反应产生480nm光，该反应不需要ATP参与。人源化的Gluc(hGluc)酶在哺乳动物细胞中表达产生的生物荧光信号强度比hRluc至少强100倍以上。Gluc酶有一个16个氨基酸组成的天然信号肽，可以有效地将Gluc酶分泌到细胞外(80％以上)。因此可以在不裂解细胞和破坏组织的情况下检测到其表达情况。(Tannous BA，Kim DE，Fernandez JL，et al.Codon-Optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.Molecular Therapy，2005，11(3)：435-443.)。与分泌型的碱性磷酸酶(SEAP)相比，Gluc酶的检测灵敏度要高20000倍(Badr CE，Hewett JW，Breakefield XO and Tannous BA.A highly sensitive assay for monitoring the secretory pathway and ER stress.PLoS ONE 2，e571(2007))。并且Gluc的检测方法比SEAP更简便和快速。Gluc的这些特点都有利于miRNA Asensor Array用于细胞内miRNA活性谱的高通量检测。 
总之，本发明提出了一种以AAV载体为基础的高通量的细胞内miRNA活性谱的检测方法miRNA Asensor Array，该方法可以方便、简单和快捷地高通量检测细胞内的miRNA活性谱。而且利用该方法通过检测特定的多种miRNA活性鉴定细胞的种类、生理病理特征以及评价某些外界因素的作用。最终，该方法可能发展成一种检测、诊断试剂盒。 
附图说明：
图1miRNA Asensor Array检测细胞miRNA活性谱流程图。见实施例1。该图示意了利用miRNA AsensorArray检测细胞内miRNA活性谱的过程。图中AAV2ITR为腺相关病毒2型(Adeno-associated virus type 2，AAV2)的反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)的缩写；pA′和pA为不同的polyA加尾信号序列；PCMV和PCAG分别为CMV和CAG启动子的缩写；Insulator表示绝缘子序列；miRT为miRNA target的缩写，本发明中为与miRNA序列完全互补的序列；Fluc为萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)的缩写；Gluc为Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase)的缩写；G418为新霉素基因的筛选药物；rHSV1-AAV2repcap表示的为AAV2病毒制备过程中所用的辅助病毒；miRNA Asensor为miRNA sensor based AAV vector的缩写。 
图2miRNA Asensor Array特异地检测细胞内miRNA活性。图中pri-miRNA为primary precursor miRNA的缩写，即miRNA表达转录过程中产生的初始物；pre-miRNA表示的是pri-miRNA经Dicer(RNase III)加工后的带有发卡结构的前体miRNA分子；miRNA表示成熟的miRNA分子；miRISC为miRNA inducing silencing complex的缩写。 
图3pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA质粒图谱。见实施例2。 
pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA质粒为不携带miRNA靶序列的miRNA Dsensor。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；SV40late poly(A)signal是SV40病毒晚期蛋白表达的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；Fluc是萤火虫荧光素酶基因；Insulator是来源于人类16号染色体上的转录终止序列。 
图4pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-mirT质粒图谱。见实施例2。该图谱表示的是携带miRNA靶序列的miRNA Dsensor的结构。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；PGK promoter是人磷酸甘油酸激酶的启动子；BGH polyA是牛 生长激素基因的加尾信号序列；SV40late poly(A)signal是SV40病毒晚期蛋白表达的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；Fluc是萤火虫荧光素酶基因；Insulator是来源于人类16号染色体上的转录终止序列，mirT是某种miRNA的单个靶序列。 
图5miRNA Asensor基因组结构示意图。见实施例2。图A为不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor的基因组结构示意图；图B为携带miRNA靶序列的miRNA Asensor的基因组结构示意图。图中AAV2ITR为腺相关病毒2型(Adeno-associated virus type 2，AAV2)的反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)的缩写；pA′和pA为不同的polyA加尾信号序列；PCMV和PCAG分别为CMV和CAG启动子的缩写；Insulator表示绝缘子序列；miRT为miRNA target的缩写，本发明中为与miRNA序列完全互补的序列；Fluc为萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)的缩写；Gluc为Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase)的缩写。 
图6miRNA Asensor表达特征。图中RLU为相对光强度单位(Relative light unit)的缩写；Fluc为萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)的缩写；Gluc为Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase)的缩写。图A表示的是96孔中BHK21细胞随着感染miRNAAsensor病毒基因组(viral genome)不断增加时，细胞培养上清中的Gluc活性变化；图B表示的是96孔中BHK21细胞随着感染miRNA Asensor病毒基因组(viral genome)不断增加时，细胞裂解物中的Fluc活性变化；图C表示的是96孔中BHK21细胞随着感染miRNA Asensor病毒基因组(viral genome)不断增加时，细胞中Gluc和Fluc活性相关性。 
图7miRNA Asensor Array的优化。图中RLU为相对光强度单位(Relative light unit)的缩写；Relative inhibiting fold指的是相对抑制倍数，用于表示miRNA活性，相对抑制倍数值越大miRNA活性越高，反之亦然。图A表示的是当96孔中每孔加入的miRNA Asensor的基因组量不变时，随着BHK21细胞接种量的变化，检测到的Gluc总活性的变化；图B表示的是当96孔中每孔加入的mIRNA Asensor的基因组量不变时，随着BHK21细胞接种量的变化，同一细胞数量下每种miRNA Asensor感染BHK21细胞后表达的Gluc活性占该细胞数量下Gluc总活性的比例；图C表示的是在相同的miRNA Asensor基因组量和细胞数量下，随着检测时间的不同，HEK293细胞中检测到的miRNA总活性的变化；图D表示的是在相同的miRNA Asensor基因组量和细胞数量下，随着检测时间的不同，HEK293细胞中检测到的每种miRNA活性占所有检测miRNA总活性的比例。 
图812种细胞miRNA活性谱。图中Relative inhibiting fold指的是相对抑制倍数，用于表示miRNA活性，相对抑制倍数值越大miRNA活性越高，反之亦然。图A表示的是BJ、HepG2、Huh7/CD81、HEK293、HEK293T、BEAS-2B、HeLaS3、U937、K562、C2C12、BHK21和Vero细胞115种miRNA活性谱；图B表示的是12种细胞中miR-199a-2-3p活性比较；图C表示的是12种细胞中miR-143活性比较；图D表示的是12种细胞中miR-21活性比较；图E表示的是12种细胞中miR-221和miR-222活性比较；图F表示的是12种细胞中miR-142-3p和miR-142-5p活性比较；图G表示的是12种细胞中miR-122和miR-194活性比较。 
图9细胞let7家族活性谱。图中Relative inhibiting fold指的是相对抑制倍数，用于表示miRNA活性，相对抑制倍数值越大miRNA活性越高，反之亦然；2ΔCt指的是2的ΔCt次方，用于表示细胞中miRNA的相对表达量的高低，其值越高表示细胞中miRNA的表达量越高；ΔCt值为在QRT-PCR中人源细胞中U6RNA的Ct值与某种miRNA的Ct值的差值。图A表示的是多种细胞中let7家族活性谱；图B表示的是let7家族成员序列比较分析，红色字体标记的为let7家族成员共有的种子序列，黑色字体标记的为let7家族成员相同的序列，非红色彩色字体标记的为let7家族成员的差异序列；图C表示的是HEK293细胞中let7家族的活性谱；图D表示的是HEK293细胞中let7家族的相对表达量。 
图10HEK293和HEK293T细胞miRNA活性谱比较。图中Relative inhibiting fold指的是相对抑制倍数，用于表示miRNA活性，相对抑制倍数值越大miRNA活性越高，反之亦然；2ΔCt指的是2的ΔCt次方，用于表示细胞中miRNA的相对表达量的高低，其值越高表示细胞中miRNA的表达量越高；ΔCt值为在QRT-PCR中人源细胞中U6RNA的Ct值与某种miRNA的Ct值的差值。图A表示的是HEK293和HEK293T细胞中的miRNA活性谱；图B表示的是HEK293和HEK293T细胞中的miR-21、miR-17-5p和let-7a的活性；图C表示的是HEK293和HEK293T细胞中的miR-21、miR-17-5p和let-7a的表达量。 
图11TPA诱导前后K562细胞miRNA活性谱比较。图中Relative inhibiting fold指的是相对抑制倍数，用于表示miRNA活性，相对抑制倍数值越大miRNA活 性越高，反之亦然。图A表示的是TPA诱导前后K562细胞的miRNA活性谱；图B表示的是TPA诱导前后K562细胞中变化较大的miRNA及其活性；图C表示的TPA诱导前后K562细胞的形态变化，展示的为可见光下的细胞形态照相结果。 
图12P19细胞miRNA活性谱。图中Relative inhibiting fold指的是相对抑制倍数，用于表示miRNA活性，相对抑制倍数值越大miRNA活性越高，反之亦然。 
以下实施例对本发明的基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。 
实施例1miRNA Asensor Array检测细胞内miRNA活性谱流程 
miRNA Asensor Array检测细胞内miRNA活性谱流程如图1所示。 
该流程可以分为4个阶段： 
I.miRNA Asensor的制备； 
II.miRNA Asensor Array的制备； 
III.检测细胞接种miRNA Asensor Array并培养； 
IV.Gluc活性检测和数据分析得出细胞miRNA活性谱。 
阶段I和II分别详见实施例2和实施例4。阶段III中不同的细胞生长速度以及AAV病毒的感染效率都存在差异，因此可能不同细胞的接种量和培养时间不同。阶段IV中Gluc活性检测时应注意标准化操作，降低因操作带来的测量误差。 
实施例2miRNA Asensor制备 
先解释3个概念： 
miRNA Asensor：携带Fluc和Gluc两种荧光素酶基因的AAV病毒miRNA传感器。 
miRNA Asensor Array：miRNA Asensor按照一定顺序包被于细胞培养板上，无菌晾干后形成的可用于高通量细胞内miRNA活性谱检测的阵列。 
miRNA Dsensor：携带Fluc、Gluc两种荧光素酶基因的miRNA传感器的质粒，该质粒同时携带AAV2病毒的两个反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)，该质粒用于转染BHK21细胞后筛选获得AAV病毒包装所需的细胞株，而用该细胞株可以最终生产出用于miRNA Asensor制备的AAV病毒。 
1、miRNA Asensor包装过程中所用质粒miRNA Dsensor的制备 
I、不携带miRNA靶序列的miRNA Dsensor质粒构建 
a、insulator-PGK-Fluc-SV40late polyA表达框的获得 
以pPGK-E1(本实验室构建并保存)为模板，设计并合成引物： 
Primer 7：5’cagggtaccattctaccgggtagg3’ 
Primer 8：5’attggatcctcgaaaggcccggag3’ 
下划线标记处为限制性酶切位点，Primer 7中的酶切位点为KpnI，Primer 8为BamHI；将PGK(human phosphoglycerase kinase)启动子定向插入pGL4.14[Luc2/hugro]vector(Promega)，获得包含insulator-PGK-Fluc-SV40late polyA表达框的质粒pGL4.14-PGK。具体过程为： 
PCR扩增PGK启动子，过程为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(DV805A)回收纯化，于KpnI和BamHI(NEB)双酶切体系中消化2至3h，并同时用相同的双酶切体系消化pGL4.14[Luc2/hugro]vector。然后用T4DNA Ligase(NEB)连接回收纯化后的酶切产物和载体片段，连接产物转化DH5aMAX Efficiency感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切测序鉴定正确，获得pGL4.14-PGK。 
b、insulator-PGK-Fluc-SV40late polyA表达框插入pAAV2neo-Gluc-polyA表达载体 
以pGL4.14-PGK为模板，设计并合成以下引物： 
Primer 9：5’gaactcgagtggacaggccgcaat3’ 
Primer 10：5’caactcgaggagcgcccaatacgc3’ 
下划线标记处为限制性酶切位点，Primer 9和Primer 10中的酶切位点均为XhoI，将insulatorPGK-Fluc-SV40late polyA表达框插入pAAV2neo-Gluc-polyA表达载体(田文洪，董小岩，王刚等.一种利用分泌型荧光素酶基因表达变化检测活细胞中miRNA活性的新方法.生物工程学报，2010，26(6)：809-816.)。具体过程为：PCR扩增insulator-PGK-Fluc-SV40late polyA表达框，过程为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (DV805A)回收纯化，于XhoI(NEB)单酶切体系中消化2至3h，并同时用相同的单酶切体系消化pAAV2neo-Gluc-polyA载体。然后用T4DNA Ligase(NEB)连接回收纯化后的酶切产物和载体片段，连接产物转化DH5a MAX Efficiency感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切测序鉴定正确，获得pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA，即不携带miRNA靶序列的miRNA Dsensor。 
2、携带miRNA靶序列的miRNA Dsensor的构建 
选择115种miRNA，从miRNA数据库网站(www.mirbase.org)上查询获得miRNA的序列，并将其中的U替换为T。然后根据Waston-Crick碱基互补配对原则推断出miRNA完全互补的靶序列。同时，在每种成熟miRNA序列5’端引入EcoRI酶切后产生突出末端序列”5’AATT3’”，称之为序列1；在每种miRNA完全互补靶序列5’端引入BglII酶切后产生突出末端序列”5’GATC3’”，称之为序列2。设计并合成每种miRNA的序列1和序列2，退火后，形成接头，插入pAAV2neo-(Fluc)-Gluc-polyA的EcoRI和BglII两限制性酶切位点之间，获得115种携带miRNA靶序列的miRNA Dsensor。115种miRNA Dsensor的名称见表十。 
表十115种miRNA Dsensor的名称 
Figure BSA00000461224500741
3、miRNA Dsensor包装成miRNA Asensor 
将携带不同miRNA靶序列的miRNA Dsensor分别转染至BHK21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株。按文献方法(伍志坚，吴小兵等，一种高效的重组腺伴随病毒生产系统，中国科学(C辑)37(5)：423-430)制备重组AAV2病毒；用”氯仿处理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法(吴小兵等，一种快速和高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通报45(19)：2070-2075)纯化获得粗提液；进一步用肝素柱纯化获得rAAV-(Fluc)-Gluc-miRNA sensor即miRNA Asensor病毒制品。-70℃保存。获得miRNA Asensor的基因组结构分别如图5A、图5B所示，其中图5A表示的是不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor的基因组结构示意图，图5B表示的是携带miRNA靶序列的miRNA Asensor的基因组结构示意图。从miRNA Asensor的基因组结构示意图可知，miRNA Asensor基因组中包含两个独立的表达单元，即Fluc和Gluc表达单元，且两个单元之间被绝缘子序列隔开，降低两个表达单元之间的相互影响。同时，miRNA Asenor除了还包含AAV2的ITR序列外，不再携带任何其他相关序列，最大限度地降低了外源序 列对宿主细胞的影响，这也是AAV载体携带miRNA sensor的优点之一。 
实施例3miRNA Asensor表达特性研究 
为了了解miRNA Asensor中Fluc和Gluc基因的表达特性，将不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor以5×108vg/well为起浓度，以1.6×107vg/well为终浓度，2倍比稀释，共6个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个复孔，反向包被于96孔细胞培养板，无菌晾干。然后将BHK21细胞以5×104每孔接种，37℃5％CO2孵箱中培养24h后，分别检测细胞中的Gluc和Fluc活性。Gluc和Fluc的检测方法如下： 
Gluc检测方法：采用Gaussia luciferase Asaay kit(New England Biolabs，Cat.No.E3300)，参见Gaussia luciferase Asaay kit说明书。具体过程为：取20μL细胞培养上清，加入50μLGaussia荧光素酶检测底物，混匀后，立即放入发光计数仪中收集光子10s，得到RLU(Relative Light Unit)值。 
Fluc检测方法：采用Luciferase Assay system(Promega，Cat.No.E4550)，参见Luciferase Assay system说明书。具体过程为：将细胞用1×PBS2-清洗三次，然后加入适量的1×细胞裂解液(RLB)，反复冻融三次，混匀，获得细胞裂解液。取20μL细胞裂解液加入100μL荧光素酶检测底物，混匀后，立即放入发光计数仪中收集光子10s，得到RLU(Relative Light Unit)值。 
Gluc和Fluc的检测结果分别如图6A、B所示。从图6A可知，BHK21细胞表达Gluc活性与细胞感染miRNA Asensor基因组数量成幂函数变化；从图6B可知，BHK21细胞表达Fluc活性与细胞感染miRNA Asensor基因组数量也成幂函数变化。这表明Fluc和Gluc呈现相似的表达规律。进一步，BHK21细胞表达Gluc和Fluc活性成线性相关(图6C)。miRNA Asensor的表达规律表明利用Fluc计算miRNA Asensor的转导系数(见实施例5)来校正miRNA Asensor间的转导效率差异是合理和可行的。 
实施例4miRNA Asensor Array制备 
制备的miRNA Asensor采用DNA斑点杂交法测定其物理滴度。按Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)的方法进行。以地高辛标记CMV/目的基因为探针，以系列稀释的AAV病毒包装质粒为标准对照，将样品的杂交信号 与标准对照进行比较、定量。根据定量的miRNA Asensor滴度，用PBS2+将miRNAAsensor稀释成相同的物理滴度，然后利用Liquidator 96Manual Benchtop Pipetting System(RAININ)将各种miRNA Asensor以等量的体积反向包被于96孔细胞培养板中，于操作工作台中无菌晾干，2-8℃保存备用。 
实施例5miRNA Asensor Array转导系数的确定 
虽然miRNA Asensor以相同的量反向包被于96孔细胞培养板，但由于DNA斑点杂交法本身精确度不高，因此等量的miRNA Asensor间感染相同细胞后细胞Fluc表达活性存在差异。由于miRNA Asensor中Gluc和Fluc体现出相似的表达规律且Gluc和Fluc活性线性相关(见实施例3)，因此我们提出用转导系数(Transduction Coefficient，TC)来表示miRNA Asensor的转导效率高低。具体的方法是：测定每种miRNA Asensor中Fluc的表达活性用于表示每种miRNA Asensor的转导效率，将不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor的转导效率定义为一个转导系数单位，其余miRNA Asensor的转导系数为其本身表达Fluc活性与不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor表达Fluc活性的比值。本发明实施例中使用的115种miRNA Asensor的转导系数如表十一所示。 
表十一本发明实施例中使用的115种miRNA Asensor的转导系数 
Figure BSA00000461224500761
                                    TC，Transductioncoefficient 
由于miRNA Asensor Array标准化的制备过程，因此同一批次制备的miRNA  Asensor Array可视为具有相同的转导系数。进而利用miRNA Asensor Array测定细胞miRNA活性谱时，只需测定Gluc活性即可，避免了测定Fluc活性，不仅简化了操作过程，还降低因Fluc多次测定而带来的测量误差，提高了miRNA Asensor Array检测细胞miRNA活性谱的简便性和准确性。 
实施例6miRNA Asensor Array的优化 
我们制备了包含31种miRNA Asensor的miRNA Asensor Array，以该miRNA Asensor Array为例，探索了不同的检测细胞数和检测时间对miRNA Asensor Array功能的影响。首先，我们将不同数量的BHK21细胞接种于miRNA Asensor Array，48h后检测细胞培养上清中的Gluc活性。各种miRNA Asensor表达Gluc活性的堆积图如图7A所示，各种miRNA Asensor表达Gluc活性占所有表达Gluc总活性的比例如图7B所示。从图7A的结果可知，随着细胞数量的增加，Gluc的表达活性先增加后下降，但在不同的细胞数量下，每种miRNA Asensor表达Gluc活性占所有表达Gluc总活性的比例却无明显差异(见图7B)。这表明miRNA Asensor Array具有较宽的细胞数量适宜范围，但为了提高方法检测的灵敏度需要选择适宜的检测细胞数量。然后，我们将HEK293细胞以相同数量接种于miRNA Asensor Array，不同的时间点(24h、36h、48h、60h和72h)分别检测细胞培养上清中Gluc活性。不同时间点各种miRNA Asensor检测到的HEK293细胞中相应miRNA活性(用Relative inhibiting fold表示)堆积图如图7C所示，每种miRNA活性占所有miRNA总活性的比例如图7D所示。从图7C可知，随着miRNA Asensor感染时间的增加，检测到的miRNA总活性呈现先增加后下降的趋势，但是相同时间每种miRNA活性占总活性的比例却未见明显差异。这表明miRNA Asensor Array对检测时间没有明显的限制。 
实施例712种细胞miRNA活性谱测定 
利用miRNA Asensor Array，我们检测了BJ、HepG2、Huh7/CD81、HEK293、HEK293T、BEAS-2B、HeLaS3、U937、K562、C2C12、BHK21和Vero细胞115种miRNA活性谱，检测结果如图8A所示。从图8A可知，不同的细胞呈现不同的miRNA活性谱，这种差异主要体现在检测miRNA活性的总量大小和每种miRNA 在不同细胞中的活性差别。进一步，我们分析比较了几种差异明显的miRNA的活性，分别如图8B、C、D、E、F和G所示。 
图8B显示的是miR-199a-2-3p在不同细胞中的活性差异，从该图可知miR-199a-2-3p在BJ、C2C12和BHK21细胞中较高，在其余检测细胞中均较低，这与Hou等(Hou J，Lin L，Zhou W.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma.Cancer Cell，2011，19：232-243.)报道的miR-199a-2-3p主要在肝脏中表达高不一致。虽然没能在HepG2和Huh7/CD81中检测到miR-199a-2-3p活性可能与miRNA Asensor Array的检测灵敏度相关，但我们在BJ、C2C12和BHK21细胞中检测较高的miR-199a-2-3p活性，这表明miR-199a-2-3p可能不只在肝细胞中特异性表达，在其他非肝细胞中也存在较高水平的表达。 
图8C显示的是miR-143在12种检测细胞中活性。从该图可知，miR-143在BJ和C2C12细胞中活性较高，在其余检测细胞中均活性较低。这与miR-143在肌肉和表皮中表达水平较高相一致(Elia L，Quintavalle M，Zhang J，et al.The knockout of miR-143and miR-145alters smooth muscle cell maintenance and vascular homeostasis in mice：correlates with human disease.Cell Death Differ.，2009，16(12)：1590-1598.)。 
图8D显示的是miR-21在12中检测细胞中活性。从该图可知，miR-21除了在HEK293T细胞中活性较低外，在其余细胞中均活性较高。这表明miR-21多种不同来源细胞中均具有较高的活性。虽然多数文献报道miR-21在多种肿瘤发生中发挥重要作用并表达高(Si M-L，Zhu S，Wu H，et al.miR-21-mediated tumor growth.Oncogene，2006，1-5.；Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al.microRNA-21regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer.Gastroenterology，2007，133(2)：647-658.；Asangani IA，Rasheed SAK，Nikolova DA，et al.microRNA-21(miR-21)post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal cancer.Oncogene，2008，27：2128-2136.)，但我们的测定结果表明miR-21可能在正常细胞中也具有较高的表达水平，只是在肿瘤细胞中表达水平更高，进一步提示miR-21可能具有重要的生理功能，正因为如此其表达量的变化(增加或减少)才 会导致多种疾病(如肿瘤)的发生。 
图8E显示的是miR-221和miR-222在12种检测细胞中活性。从该图可知，miR-221和miR-222在BJ、BEAS-2B、HEK293、HEK293T、C2C 12、BHK21和Vero细胞中活性较高，其中在BJ细胞中活性最高，而在HepG2、Huh7/CD81、K562和U937中则较低，其中在U937和K562中几乎没有检测到miR-221和miR-222活性。 
图8F显示的是miR-142-3p和miR-142-5p在12种检测细胞中活性。从该图可知，miR-142-3p和miR-142-5p在K562和U937细胞中较高，在其余细胞中均较低。这与miR-142主要在造血干细胞系来源细胞中表达相一致(Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation.Science，2004，303(5654)：83-86.)。值得注意的是，miR-142-3p和miR-142-5p在K562和U937细胞中的表达活性差异不大，这表明pre-miRNA中的5’和3’端序列均可能被加工产生成熟的具有功能的miRNA分子，但miRNA加工成熟过程中pre-miRNA中5’和3’端序列的选择机制仍然需要进一步阐明。 
图8G显示的是miR-122和miR-194在12种检测细胞中活性。从该图可知，miR-122主要在Huh7/CD81中活性较高，在其余检测细胞中均较低；miR-194则主要在Huh7/CD81和HepG2中活性较高，在其余检测细胞中均较低。miR-122是公认的肝脏特异性表达的miRNA(Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，et al.Identification oftissue-specific microRNAs from mouse.Current Biology，2002，12：735-739.；Chang J，Nicolas E，Marks D，et al.miR-122，a mammalian liver-specific microRNA is processed from hcr mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transpoter CAT-1.RNA Biology，2004，1(2)：106-113.)，因此许多肝脏来源的细胞(如Huh7)也具有较高的miR-122活性。但HepG2作为一种肝癌组织来源细胞系却未检测到miR-122活性，这与Jopling等报道一致(Jopling CL，Yi ，Lancaster A，et al.Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA.Science，2005，309：1577-1581.)。特异性地在Huh7/CD81和HepG2中检测到miR-194活性，这也与Meng等报道一致(Meng Z，Fu X，Chen X，et al.miR-194is a marker of hepatic epithelial cells and suppresses metastasis of liver cancer cells in mice.Hepatology，2010，52(6)：2148-2157.)。 
从这些结果可知，利用miRNA Asensor Array获得的细胞miRNA活性谱检测结 果与许多研究报道的结果一致，表明了miRNA Asensor Array能够有效地检测细胞中的miRNA活性。而且，利用miRNA Asensor Array检测细胞miRNA活性谱不仅简单方便，还可高通量地实现miRNA活性检测，为细胞miRNA活性的高通量筛选提供了有效的工具。 
实施例8细胞中let7家族活性测定 
为了探索miRNA Asensor Array对具有相同seed sequence的miRNA家族活性的检测特点，我们利用miRNA Asensor Array检测了12种细胞中的let7家族各个成员的活性。检测结果如图9A所示。从该图可知，不仅let7家族中每个成员在不同的细胞间存在差异，而且每种细胞的let7家族活性谱变化趋势也存在差异，如BHK21和BJ细胞中let7家族中各个成员活性均较高，但两种细胞中let7家族活性变化趋势则存在差异，BJ细胞中let-7i在let7家族中活性最低，而BHK21细胞中则相对较高。进一步，我们分析了let7家族中各个成员间的序列差异，结果如图9B所示。从图9B可知，let-7a是let7家族最保守的成员，因为其成熟序列中的每个碱基都是let7家族中所有成员该位置出现频率最高的碱基；let-7i则可能是let7家族中最不保守的成员之一，因为其低频率碱基出现了3次，次数最多；其余的家族成员保守性，根据低频率碱基出现的次数，排序如下：let-7c＝let-7e＝let-7f＞let-7b＝let-7d＝let-7g。然后，我们选择HEK293细胞，利用TaqMan MicroRNA Assays(Ambion)试剂盒检测HEK293细胞中let7家族中各个成员的相对拷贝数，具体的检测过程参见TaqMan MicroRNA Assays说明书，检测结果如图9D所示。从图9D可知，let-7e在HEK293细胞中的相对拷贝数最高，let-7a次之，let-7g最低。将HEK293细胞中的let7家族相对拷贝数(图9D)与其活性(图9C)比较发现，let7家族成员活性与其拷贝数并不一致。如let-7C的相对拷贝数较低(图9D)，而其活性则在let7家族中最高。之所以出现这种差异，其原因是：每种miRNA Asensor均携带单拷贝的某种miRNA完全互补的靶序列，细胞内源的miRNA通过识别并结合其靶序列来抑制Gluc的表达，检测并与不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor比较Gluc表达情况从而推测细胞中某种miRNA活性。在细胞内miRNA识别并结合的靶序列并不需要完全互补，理论上只要靶序列中包含某种miRNA的seed sequence，该靶序列就能被该种miRNA识别并抑制Gluc的表达，因此根据let7家族成员序列保守性分析结果(图9B)可 知，let7家族成员中的任何一个成员的miRNA Asensor均能够被该家族的所有成员识别并抑制其Gluc的表达，let7家族成员中任何一个成员的miRNA Asensor检测到的miRNA活性均为该家族所有成员对该miRNA Asensor作用的综合。 
实施例9HEK293和HEK293T细胞miRNA活性谱比较 
利用miRNA Asensor Array，我们检测并分析比较了HEK293和HEK293T细胞miRNA活性谱。HEK293和HEK293T细胞miRNA活性谱检测结果如图10A所示。尽管HEK293和HEK293T细胞miRNA活性谱差别不大，但是相比HEK293，HEK293T中某些miRNA活性出现了较大的变化，我们选择几种活性变化较大的miRNA(图10B)：let-7a、miR-21和miR-17-5p。为了验证这种差异的可靠性，我们利用TaqMan MicroRNA Assays(Ambion)试剂盒检测HEK293和HEK293T细胞中let-7a、miR-21和miR-17-5p的相对拷贝数，结果见图10C。从图10C可知，两种细胞中同种miRNA的相对拷贝数与其活性对应关系一致，但同种细胞不同miRNA之间其相对拷贝数与活性的对应关系并不完全一致，如HEK293和HEK293T细胞中miR-21的活性均高于let-7a，但这两种细胞中miR-21的相对拷贝数却均低于let-7a。这可能是因为miRNA的活性除了miRNA拷贝数外，还受到其他多种因素(如miRNA的定位、miRNA的稳定性和miRSIC中其他蛋白因子等)的影响。 
由于HEK293T细胞来源于HEK293细胞，相比于HEK293，HEK293T的差别为能够稳定的表达SV40病毒的大T抗原，因此比较分析HEK293和HEK293T细胞的miRNA活性谱为SV49病毒大T抗原对细胞表达miRNA的影响提供了线索。从我们的实验结果可知，SV40病毒大T抗原的表达能够导致HEK293T细胞中miR-21和let-7a表达下降，miR-17-5p的上升。但SV40病毒大T抗原调控细胞内miRNA表达的机制需要进一步研究。 
实施例10TPA诱导前后K562细胞miRNA活性谱比较 
药物作用前后细胞内miRNA活性可能会发生变化。利用miRNA Asensor Array，我们检测并分析比较了TPA作用前后K562细胞内的miRNA活性谱变化。我们以TPA终浓度为16nmol/L的细胞培养基(DMEM，10％FBS)培养K562细胞72h后，光学显微镜下观察发现K562细胞变大且贴壁生长(图11C)。同时我们检测了TPA 诱导前后K562细胞的miRNA活性谱，选择诱导前后miRNA活性升高或降低50％的miRNA进行作图，具体作图结果为图11A。然后我们进一步比较所有选择miRNA的活性变化(图11B)。从图11A、B结果可知，TPA诱导K562细胞中miR-34a、miR-221和miR-222活性明显升高，这与Navarro等(Navarro F，Gutman D，Meire E，et al.miR-34a contributes to megakaryocytic differentiation of K562cells independently ofp53.Blood，2009，114(10)：2181-2192.)报道的一致；相反，miR-144、miR-32和miR-106a活性则显著下降。 
实施例11P19细胞miRNA活性谱测定 
利用miRNA Asensor Array，我们检测小鼠胚胎肿瘤细胞(embryonal carcinoma cells，EC cells)P19中的miRNA活性谱。检测结果如图12所示。从图12的结果可知，P19细胞中let7家族和miR-21活性较低。由于胚胎肿瘤细胞属于多能胚胎干细胞，在多能胚胎干细胞中let7家族和miR-21活性均较低(Marson A，Levine SS，Cole MF，et al.Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry ofembryonic stem cells.Cell，2008，134：521-533.)，数据显示，我们的检测结果与预期的一致。 
名词解释： 
微小RNA(miRNA)：是一种存在于动植物体内的，长度为22nt左右的非编码RNA。它通过降解靶mRNA或抑制其翻译调节细胞内的基因表达，在细胞的生长、分裂、分化和凋亡以及某些疾病(如癌症)的发生和进程中发挥重要的调节作用。 
传感器(sensor)：通常指一种将某种物理现象转换成可被仪器定量测定或检测的装置。本专利中是指将细胞内miRNA活性转换为荧光素酶活性变化的重组AAV病毒库。 
miRNA活性：由于细胞中miRNA发挥作用时，不仅受到细胞中miRNA表达水平的影响，还受到miRNA在细胞中定位、稳定性和miRSIC中其他蛋白组成因子的影响，因此细胞中miRNA的表达水平不完全等同于细胞中发挥作用的miRNA水平，本发明中将细胞中发挥作用的miRNA水平定义miRNA活性。miRNA活性主要从 功能上研究细胞内miRNA。 
miRISC：miRNA inducing silencing complex的缩写，是由多种蛋白因子和miRNA形成的复合物，miRNA通过形成miRISC识别并结合基因3’UTR中miRNA靶序列，抑制该基因的表达。 
AAV病毒：adeno-associated virus，腺相关病毒。 
反向感染：一种病毒感染细胞的操作方式，与常规的先将细胞接种于培养板中，再加入病毒实现感染不同，反向感染是先将病毒在无菌条件下包被于培养板中，再加入细胞实现病毒感染。 
miRNA Dsensor：携带Fluc、Gluc两种荧光素酶基因的miRNA传感器的质粒，该质粒同时携带AAV2病毒的两个反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)，该质粒用于转染BHK21细胞后筛选获得AAV病毒包装所需的细胞株，而用该细胞株可以最终生产出用于miRNA Asensor制备的AAV病毒。 
miRNA Asensor：携带Fluc和Gluc两种荧光素酶基因的AAV病毒miRNA传感器。 
miRNA Asensor Array：miRNA Asensor按照一定顺序包被于细胞培养板上，无菌晾干后形成的可用于高通量细胞内miRNA活性谱检测的阵列。 
转导系数：transduction coefficient，本发明中提出用于表示miRNA Asensor转导效率高低的参数，其计算方法是用Fluc的表达活性表示miRNA Asensor的转导效率，将不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor的转导效率定义为1个转导系数单位，其余miRNA Asensor转导系数为该miRNA Asensor表达Fluc活性与不携带mIRNA靶序列的miRNA Asensor表达Fluc活性的比值。 
Relative inhibiting fold：相对抑制倍数，本发明中用于表示细胞内miRNA活性，其计算方法是先计算出不携带miRNA靶序列的miRNA Asensor表达Gluc活性与携带miRNA靶序列的miRNA Asensor表达Gluc活性的比值，再乘以该种携带miRNA靶序列的miRNA Asensor转导系数。 
AAV：adeno-associated virus，腺相关病毒。 
ITR：inverted terminal repeat，倒转末端重复。 
AAV2病毒：2型AAV病毒(adeno-associated virus serotype 2)。 
Gluc：Gaussia luciferase的缩写，来源于海洋桡角类动物Gaussia princeps，本发明中采用Gluc基因根据哺乳动物密码子偏爱性、mRNA稳定性进行过密码子优化，可 在哺乳动物细胞中高效表达，Gluc还具有灵敏度、易分泌和检测不依赖于ATP等特点，作为一种新型荧光素酶基因可用于多种体内体外实验。 
Fluc：Firefly luciferase的缩写。 
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Claims (9)

1.一种基于AAV载体的、用于高通量地检测活细胞的miRNA活性的miRNA活性检测阵列的检测技术方法。
2.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNAAsensor，其特征在于，其基因组中包含Fluc和Gluc两个独立的表达框，且表达框间被绝缘子序列分隔，其中Fluc表达框用于校正不同miRNAAsensor间的转导效率差异，Gluc表达框用于探测细胞内miRNA活性。
3.根据权利要求2，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，病毒感染校正单元中的Fluc的表达水平与Gluc的表达水平有平行线性关系，miRNA活性检测单元中的Gluc的表达水平与miRNA活性有平行线性关系。
4.根据权利要求1，为校正miRNA Asensor间的转导效率差异，我们以Fluc的表达水平来表示miRNA Asensor的转导效率的高低，提出了转导系数(Transductioncoefficient，TC)的概念，用转导系数表示miRNAAsensor间的转导效率的高低，这样，可以有效地量化miRNA Asensor转导效率的高低，校正因不同miRNA Asensor转导效率差异而导致的miRNAAsensor Array测量误差。
5.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNA AsensorArray，其特征在于，其组成miRNA Asensor分为携带miRNA靶序列的和不携带miRNA靶序列的两类，在进行miRNA活性检测时，通过检测比较这两类miRNAAsensor报告基因Gluc的表达的差异得出miRNA活性。
6.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中所使用的miRNA AsensorArray，其特征在于，由于其标准化的制备过程，同一批次制备的组成相同的miRNAAsensorArray具有相同的转导系数，因此应用其检测细胞内miRNA活性时只需检测Gluc表达活性即可，不必每次检测均测定转导系数。
7.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，用于携带miRNA活性检测单元的AAV病毒包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及其任意两种型别的嵌合病毒。
8.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，可用于检测全部明确成熟序列的miRNA的活性，miRNA包括天然的和人工设计的且无物种限制。
9.根据权利要求1，miRNA活性检测阵列的检测技术方法中，通过检测细胞miRNA活性谱，筛选获得细胞特定时空条件下的特征miRNA活性谱，利用特征miRNA活性谱推测细胞的一系列特征(如来源、种类、生理特征等)或评价外界因素(如药物、转基因、环境变化等)对细胞的作用效果。
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