CN101967496A - Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列 - Google Patents
Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101967496A CN101967496A CN2009100090596A CN200910009059A CN101967496A CN 101967496 A CN101967496 A CN 101967496A CN 2009100090596 A CN2009100090596 A CN 2009100090596A CN 200910009059 A CN200910009059 A CN 200910009059A CN 101967496 A CN101967496 A CN 101967496A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- aav virus
- virus
- aav
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
发明提出了一种用携带外源基因和基因调控元件的重组腺相关病毒(AAV)反向感染细胞的技术方法及用于制备AAV病毒阵列。其特征在于将制备好的携带外源基因和基因元件的重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培养支持物(如96孔板)上并晾干，无菌条件下制成易于长期存放的重组AAV病毒阵列。使用时将细胞悬液(可来自悬浮细胞或贴壁细胞)加入重组AAV病毒阵列的孔中，培养12～48hr，细胞被重组AAV病毒感染，重组AAV病毒将携带的外源基因和基因元件带入细胞中发挥作用。该技术可用于细胞内基因表达调控的检测和筛选。
Description
本发明属于生物技术发明领域。具体涉及AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列，将制备好的携带外源基因和基因调控元件的重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培养支持物(如96孔板)上，在无菌条件下制成可以长期存放的重组AAV病毒阵列。将活细胞悬液加入布置了重组AAV病毒阵列的细胞培养孔板中(如96孔板)，预先包被的重组AAV病毒能够有效地感染所加入的细胞，并将重组AAV病毒携带的外源基因(如报告基因)和/或基因元件带入细胞中发挥作用。
背景
将外源基因和/或基因元件导入细胞、使其在细胞中表达或阻断其它基因的表达，是分子生物学中常用的技术方法，称之为转导(transduction)。这个过程往往需要载体(vector)和导入系统(delivery system)来介导。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体两类。非病毒载体通常是借助人工制备或合成的材料如脂质体、壳聚糖、多聚阳离子化合物等将DNA质粒“包裹”成复合物导入细胞中，这个过程通常被称为“转染”(transfection)。而病毒载体则借助病毒天然的感染能力将“搭载”的外源基因和元件序列导入细胞中，这个过程和病毒感染过程相似，也被称为“感染”。
无论是转染方式还是感染方式，通常的基因导入方法都是先将细胞铺入培养板中、再加入DNA复合物或病毒进行“转染”或“感染”；与常规方法在操作顺序上有所不同的是，本发明所述的转导方法是先将所使用的重组病毒预先包被在孔板中，之后再加入细胞来实现感染，因此这样的方法可称作“反向感染”(reverse infection)。为了便于区别，我们把常规方法进行的转导方法称为“正向转染”或“正向感染”。
实际上，“微阵列”(Microarray)技术已经广泛用于生物技术领域。其中最为常见的是DNA Array(基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化稳定性和独特的碱基配对结构，而成为理想阵列材料。比如将多种合成的寡核苷酸(单链DNA)作为探针有序地排列固定在表面经过处理的玻片上制成“微阵列”(芯片)，而将待检测的样品提取核酸，用地高辛标记的随机引物进行扩增和标记后与芯片上的探针杂交，最后显色获得杂交信号。根据信号所在的探针位置来判断样品中有与该探针序列互补的序列。除了DNA外，多肽和蛋白(包括抗体)也被成功地用来制成阵列，用于蛋白检测。阵列(Array)技术的优势是具备高通量的特点，即一次检测能同时获得样品与多个探针作用的信息。传统的Southern杂交、Northern杂交和Western杂交都是将样品经过电泳分离后转印到膜上，而用标记的探针来进行检测。如果把这样的操顺序称为“正向”方式，那么，阵列技术是将已知信息的物质(探针)排布成点阵，而加入被检测的对象进行检测就可称为“反向”方式。
microRNA(miRNA)是长度在18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。它由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被转录。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到达mRNA，进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。有研究人员发现线虫体内的异时性基因lin-4编码的小RNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30％的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌症发生发展中发挥作用的miRNA被称作oncogenic miRNA，即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等。下表罗列出部分microRNA的表达与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后的关系：
基于目前人们对microRNA与肿瘤的关系的理解，可以预见，其在肿瘤诊断中将发挥出相应的作用。
Lu等人采用串珠流式细胞miRNA表达谱分析技术对来自人恶性肿瘤组织的miRNA进行系统表达分析，其中包括结肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌。miRNA表达谱成功对低分化肿瘤进行了分类。研究揭示了miRNA表达水平在癌症诊断中的重要作用[Lu J，Getz G，Miska EA，etal.(2005)MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature.435，834-838]。Bottoni等人则采用芯片技术及RT-PCR分析了垂体腺瘤和正常垂体样本中的全部miRNA，结果发现miRNA表达水平可以区分垂体微腺瘤和垂体巨腺瘤，还有一些miRNA参与细胞增殖与凋亡的过程。miRNA可以作为有效的诊断标志，提高对垂体腺瘤的分类水平[Bottoni A，Zatelli MC，Ferracin M，et al.(2007).Identification of differentially expressed microRNAsby microarray：a possible role for microRNA genes in pituitary adenomas.J Cell Physiol.210，370-377.]。Lee等人采用原位RT-PCR技术，经分析发现miR-221、miR-301和miR-376a的异常表达只在胰腺癌细胞中出现，而没有在良性胰腺肿瘤及正常间质和导管处出现。miRNA的异常表达可以作为胰腺肿瘤发生的研究线索，同时也可能为胰腺癌诊断提供新的生物学标志[Lee EJ，Gusev Y，Jiang J，et al.(2007).Expression profiling identifies microRNAsignature in pancreatic cancer.Int J Cancer.120，1046-1054.]。
microRNA在癌症预后判断中的作用：Takamizawa等人报道指出，let-7 miRNA的表达往往在人肺癌中缺失，而let-7 miRNA表达的减少与术后生存期的减短显著相关。此外，let-7miRNA在A549肺腺癌细胞株中的过表达可在体外抑制肺癌细胞的生长。他们的研究结果表明了let-7 miRNA表达水平的改变具有潜在临床和生物学作用[Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.(2004).Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lungcancers in association with shortened postoperative survival.Cancer Res.64，3753-3756.]。Yanaihara等人的研究可以区分肺癌组织和非恶性肿瘤组织的miRNA表达模式。前体miRNA hsa-miR-155的高表达和hsa-let-7a-2的低表达与肺腺癌的低生存率相关。他们的研究表明，miRNA不仅可以作为肺癌的诊断学标志，还可以作为预后预测的标志[Yanaihara N，Caplen N，Bowman E，et al.(2006).Unique microRNA molecular profiles inlung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell.9，189-198]。Roldo等人则发现，miR-21在胰腺肿瘤中的过表达与高Ki67增殖指数及出现肝转移高度相关。他们的研究结果表明，miRNA表达水平的改变与恶性肿瘤的进展状态相关[Roldo C，Missiaglia E，Hagan JP，et al.(2006).MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors areassociated with distinctive pathologic features and clinical behavior.J Clin Oncol.24，4677-4684.]。此外，Bloomston等人将胰腺癌细胞中的miRNA的表达水平与正常胰腺和慢性胰腺炎组织细胞的miRNA进行比较，结果发现，胰腺癌细胞中miRNA表达水平与后两者不同，可以有效区分开来。miR-196a-2的高表达可以用于预测不良预后[Bloomston M，Frankel WL，Petrocca F，et al.(2007).MicroRNA expression patterns to differentiatepancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA.297，1901-1908.]。
某些miRNA表达状态受到癌细胞中表观遗传学改变的控制，比如DNA甲基化和组蛋白修饰。采用染色质修饰药物激活肿瘤抑制因子miRNA可以调节靶向癌基因，这一策略也许能在不久的将来成为癌症的新型治疗方法。miRNA可以与基因组学、蛋白质组学中的生物学标志相结合，成为癌症诊断和判断预后的参考指标[Cho WC.(2007).Contribution ofoncoproteomics to cancer biomarker discovery.Mol Cancer.6，25.；Cho WC，Cheng CH.(2007).Oncoproteomics：current trends and future perspectives.Expert Rev Proteomics.4，401-410.]。尽管每个miRNA可以调控成百个靶向基因，但在癌症研究中鉴别出miRNA的准确靶点仍然是一大难题。此外，由于干细胞可以分化发育成为多种类型的细胞，因而成为研究者们瞩目的焦点。已有研究指出miRNA通路在干细胞分化中起调控作用，而其机制是否可用于癌症的预防与治疗还需要进一步研究[Cho WC.(2007).A future of cancer preventionand cures：highlights of the Centennial Meeting of the American Association for CancerResearch.Ann Oncol.doi：10.1093/annonc/mdm335]。miRNA在多种病理过程中的功能的发现，使得对疾病进行分子水平的诊断和预后预测成为可能，对于癌症尤其如此。
Andrew Fire和Craig Mello因发现RNA干扰现象——双链RNA诱导的基因沉默而获2006年度诺贝尔奖。自从在一些生物体内发现相互作用的反义RNA具有调控功能以来，转录后的基因调节便跻身于主要基因调控机制的行列。miRNA通过碱基互补诱导RNA干扰路径，从而抑制靶向mRNA。数以百计的miRNA的发现使我们对于RNA干扰现象的生物医学意义有了全新的认识。研究者的目光开始集中于利用反义寡核苷酸抑制miRNA功能，或者采用小干扰RNA类技术研究miRNA。科学家们致力于揭开miRNA生物学的神秘面纱，挖掘其在疾病治疗方面的应用潜力。对患者进行的有关oncomiR的大型高通量研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的预测。联合基因组学、微RNA组学(miRomics)以及蛋白质组学的高通量靶向分析，有助于我们进一步发现miRNA的调节靶点。
发明概述
本发明的重要目的是建立一种基于AAV病毒载体的高通量反向感染活细胞及检测表达变化的技术方法，尤其是提出一种用luciferase基因作为报告基因测定活细胞内miRNA活性的技术方法。
miRNA是一种长度为22nt(nucleotide)左右(18-25nt)的非编码RNA，广泛存在于植物和后生动物中，调节基因的表达。近年来研究发现miRNA不仅参与调节生物的生长发育过程，还在某些生理病理过程中(如癌症的发生)表达异常。因此，特定细胞或细胞株中的miRNA表达状况的揭示有助于认识生物个体发育过程和某些疾病的发生机制。目前，研究组织细胞中miRNA表达差异方法主要包括基因芯片、QRT-PCR和northern blot等，这些方法都需要从提取组织细胞中的RNA。本发明提出的方法具有可直接检测活细胞中成熟且发挥功能的miRNA活性的优点。
发明详述
将定量的AAV病毒纯品溶液点在细胞培养支持物(如96孔板、384孔板等)上，形成有序的AAV病毒阵列(AAV Array)；使用时将等量的细胞悬液加入AAV阵列中，实现细胞的反向感染；通过分析AAV病毒介导的导入细胞中的外源基因表达情况，获得可供分析的信息。
与正向感染相比，AAV病毒反向感染技术有以下可以被利用的优点：
1)包被了AAV病毒的细胞培养板可以在干燥状态下长期保存(1年以上)而不失去感染活性和效率。
2)有利于对转感染效率的质量控制；
3)AAV病毒对于大多数细胞体外转染都具有较高的转染效率；
4)有利于进行高通量转导细胞。
制备AAV病毒阵列时，AAV病毒与培养板之间的包被不必要进行化学反应交联，只需要自然的吸附和晾干。
AAV病毒是一种无包膜的纳米级颗粒(直径约20nm)，正二十面体对称，结构比较“刚性”，对pH值、温度、盐浓度变化及有机溶剂(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很强的耐受性，因此便于存放。将AAV病毒溶液置于56℃水浴中2小时，其感染活性几乎不下降；而同样的条件处理逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或腺病毒，病毒感染活性都几乎全部丧失。我们曾经利用AAV病毒对有机溶剂的高耐受性发明了一种快速高效纯化AAV病毒的方法(专利号：99123723.4)。其中利用AAV病毒耐受有机溶剂的特性，在粗纯化过程中用三氯甲烷处理细胞悬液以使大量宿主蛋白变性沉淀而除去，进一步用三氯甲烷抽提含有AAV病毒的溶液，弃去有机相而保留水相，获得的AAV病毒纯度可达到80％以上。
我们在研究中发现，纯化的AAV病毒在适当配方的溶液中可以在-70℃保存5年以上，在4℃保存2年以上，在室温下保存6个月以上。说明AAV病毒制品本身具有良好的稳定性。
我们的研究还发现，包被在细胞培养孔板(如96孔板)上的重组AAV病毒阵列可以在干燥状态下长期保存(4℃保存1年以上)而不失去感染活性。说明AAV病毒在干燥状态下仍能够保持其感染性。与AAV病毒相比，腺病毒虽然也没有胞膜，结构也相对稳定，但用同样的条件包被在细胞培养孔板上，晾干后感染效率比在溶液状况下明显下降，加入细胞后的转染效率在1‰以下。对于有胞膜的病毒如逆转录病毒和慢病毒，由于病毒的胞膜稳定性对外界环境变化敏感，亦不能很好地耐受干燥环境，因此用反向转染方法时也只能够在溶液状态下操作，不能晾干保存。AAV病毒能在干燥环境下保持感染活性这个特性使其成为反向感染技术最合适的病毒之。
为了有效控制细胞培养板上每孔包被的AAV病毒质量、孔间差异、板间差异和生产的批间差异，通过对AAV病毒制备过程进行质量控制和AAV病毒的质量检定，可以批量生产AAV病毒阵列，并能长期保存(4℃保存1年以上)。这种预制好的AAV病毒阵列产品，在应用时只要每孔加入等量的细胞就能实现转染，与“正向感染”相比可以有效消除由于繁琐的转染操作带来的误差，并使应用变得操作简便。
各种血清型的AAV病毒都可以用于制备AAV病毒阵列。AAV2病毒研究得最多，是最早建立成载体系统的AAV病毒。对其结构和感染特性的研究也最为深入。AAV2的主要细胞受体是硫酸肝素糖蛋白(HSPG)，辅助受体是bFGF1受体、整合素αvβ5。各种血清型的AAV病毒体内外转导效率极不一致。比如对体外培养的BHK21细胞和HEK293细胞，AAV2-EGFP的表达水平明显高于同等用量的AAV1或AAV8病毒，而小鼠肌肉注射时AAV1-EGFP和AAV8-EGFP则比同等剂量的AAV2-EGFP病毒表达水平高20～100倍以上。由于AAV2病毒能有效感染多种体外培养的细胞，并且用肝素柱能十分有效地获得高纯度的AAV2病毒，因此，AAV2在制备AAV病毒阵列上有优势。另外，对AAV病毒外壳基因进行分子改造，可以获得具有新的感染特性的AAV病毒，用于制备有某种感染特性的AAV病毒阵列。
将携带报告基因和miRNA靶序列的DNA或重组病毒导入细胞中，通过检测报告基因的表达水平，可以反映出细胞相对应的内源性miRNA的活性。导入的DNA的主要结构包括“启动子-报告基因-miRNA靶序列-polyA”。作用原理是细胞中相对应的内源性miRNA与导入DNA的miRNA靶序列结合在RISC作用下使位于其上游的报告基因表达受到抑制。由于AAV病毒有对大多数细胞有具有感染能力、容量合适、安全性好、稳定性好等优点，因此，本发明采用了腺病毒相关病毒(AAV)载体来导入基因。
本发明提出将反向转染的AAV病毒阵列用做检测各种细胞内miRNA水平和变化的生物传感器。具体方法是，将国际上已经发现的microRNA的靶序列分别置于报告基因荧光素酶(luciferase)基因的3’UTR区，包装成AAV病毒，制备成AAV病毒阵列，在阵列中设不带microRNA靶序列的AAV病毒为对照。用于检测细胞中miRNA活性。采用分泌型的荧光素酶基因，能够在不裂解细胞的情况下检测荧光素酶的活性，实现miRNA活性的活细胞检测。进一步，可以比较各种因素影响下对细胞中miRNA活性的影响。这些因素包括药物、病毒感染、基因转染、温度和pH值等理化变化。
预计人类基因组中microRNA的种类预计在1000种左右。http://microrna.sanger.ac.uk/网站目前收录了695种。查找miRNA靶序列的方法是，登录http://microrna.sanger.ac.uk/，进入miRBase Database主页，点击Targets，链接到miRBase Targets Database，点击enter，在显示界面选择microRNA所属物种。点击view，从显示界面中选择该microRNA，再点击其所属的view按钮，显示即为该种microRNA的预测的靶基因，点击view显示该microRNA在这个靶基因中的靶序列。
将microRNA的靶序列构建到报告基因荧光素酶(luciferase)基因的3’UTR区的策略是：将荧光素酶(luciferase)基因插入AAV病毒载体(如pAAV2neo)中，并在其3’UTR区(polyA序列之前)设计两个不同的限制性酶切位点(如EcoRl和Bg/ll)；将待插入的miRNA靶序列假定为正链，其互补链假定为负链。在正负链的5’端分别设计相应的限制性酶酶切后产生的突出末端序列，正负链退火后形成粘性末端，插入荧光素酶(luciferase)基因的3’UTR区相应的位置，得到在其3’UTR区含有microRNA的靶序的荧光素酶(luciferase)基因。
按所述方法，可以把所有已经发现了的miRNA相应的互补序列作为靶序列，分别插入AAV-luciferase载体中，得到一系列重组AAV-luciferase载体质粒；将这些AAV载体质粒分别制备成AAV病毒，并制备成AAV病毒-miRNA靶序列阵列。可以把制备的所有种类的AAV病毒做成一套全AAV病毒-miRNA靶序列阵列，也可以选择一种或几种或一组相关的miRNA靶序列所在的AAV病毒制备成特定用途的AAV病毒-miRNA靶序列阵列。
除了用于所述的活细胞中miRNA活性检测以外，AAV病毒阵列还可以有多种用途。比如在制备AAV病毒阵列时，可以在同一块培养孔板上包被同一种AAV病毒，用于反向感染不同的细胞并比较其转染效率和生物学反应；也可以在同一块培养孔板上包被不同血清型(如AAV1至11及外壳改造的AAV)的AAV病毒，用于反向感染相同的细胞并比较其转染效率；也可以在同一块培养孔板上包被携带不同外源基因和/或基因元件的AAV病毒，用于反向感染相同的细胞并比较其生物学反应。
运用AAV病毒阵列反向感染技术，制备检测试剂(AAV2-Gluc-miRNAT)，可以用于进行临床肿瘤标本的细胞的基因元件活性的检测。具体的操作流程是：将取自临床的无菌的肝癌组织标本，用胰酶进行消化处理，用含10％胎牛血清的DMEM将经胰酶消化处理后的肿瘤标本的细胞制备成2.5×105/ml的分散的原代肿瘤细胞悬液，以100ul/孔的细胞量接种于“AAV病毒阵列反向感染检测试剂(AAV2-Gluc-miRNAT)”96孔板中，该阵列含有系列梯度的12种AAV2-Gluc-miRNAT，本实验中每种AAV2-Gluc-miRNAT的使用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104等3个剂量梯度，共使用36孔，此外，另外使用3个孔，设为Negative Control孔(不加AAV病毒)。详见实施例7中所述。加入肝癌原代细胞悬液后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，检测AAV2-Gluc-miRNAT介导的Gluc在细胞中的表达情况，其结果可以用于判断肝癌原代细胞对哪些miRNA有反应，可受到哪些元件的调控，并在本发明所描述的检测体系中以可以判读的Gluc的的变化来显示它们的关系的存在。
本发明的最终应用方式将是包含尽可能多的miRNA调节元件及其靶序列的AAV病毒阵列，用于对不同疾病组织、细胞的检测，并最终成为合乎国家、行业标准的诊断试剂盒。
附图说明
图1：重组质粒pAAV2neo-EGFP的图谱，即其结构示意图。见实施例1。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；EGFP是绿色荧光蛋白基因；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因。
图2：重组质粒pAAV2neo-luc的图谱，即其结构示意图。见实施例1。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；luc是萤火虫荧光素酶基因。
图3：BHK21细胞反向感染rAAV2-EGFP病毒实验结果。见实施例3。预制的rAAV-EGFP阵列晾干后4-8℃放置9天。本图中共有9张拍摄了表达绿色荧光蛋白的细胞的照片，所包被的rAAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104、4.0×104、2.0×104、1.0×104、5.0×103、2.5×103、Negative Control(不加AAV病毒)。BHK21细胞按2.5×105/ml，100ul/孔接种。结果表明，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。图3中的9张照片的排列方式为下表所示意。
图4：U937细胞反向感染rAAV2-EGFP病毒实验结果。见实施例3。预制的rAAV-EGFP阵列晾干后4-8℃放置9天。本图中共有9张拍摄了表达绿色荧光蛋白的细胞的照片，所包被的rAAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：2.6×105、1.3×105、6.4×104、3.2×104、1.6×104、8×103、4×103、2×103、Negative Control(不加AAV病毒)。U937细胞按3.0×105/ml，100ul/孔接种。结果表明，U937细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。图4中的9张照片的排列方式为下表所示意。
图5：重组质粒pAAV2neo-luc-142T结构示意图。见实施例4。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨苄青霉素抗性基因；luc是萤火虫荧光素酶基因；142T是3个hsa-mir142-3p靶序列定向串联后得到的序列。
图6：U937、HEK293T细胞各分别转染pAAV2neo-luc和pAAV2neo-luc-142T重组质粒实验结果。见实施例5。U937细胞以5×104/孔，HEK293T细胞以1×104/孔接种于96孔细胞培养板中。pAAV2neo-luc和pAAV2neo-luc-142T重组质粒分别以0.1μg/孔转染U937或HEK293T细胞。结果表明，转染24小时和48小时后，转染pAAV2neo-luc-142T的U937细胞萤火虫荧光素酶表达量相当于转染等量pAAV2neo-luc的U937细胞1/30或以下，但转染等量的pAAV2neo-luc或pAAV2neo-luc的HEK293T细胞间，细胞萤火虫荧光素酶表达量未见差异。
图7：rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T介导的反向感染U937、HEK293T和Hela细胞实验结果。见实施例6。预制的rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T阵列晾干后，4℃放置48小时。阵列中每孔包被5×105vg的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T。U937、HEK293T和Hela细胞按5×104/孔接种。结果表明，反向感染24小时后，反向感染等量的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见差异；Hela细胞与HEK293T细胞情况相似，萤火虫荧光素酶表达量也未见差异。相反，在U937细胞中，反向感染rAAV2-luc-142T的细胞中萤火虫荧光素酶的表达量相当于反向感染等量rAAV2-luc细胞的1/20。
图8：重组质粒pAAV2neo-Gluc-miRNAT结构示意图。见实施例7。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH polyA是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；AmpR是氨苄青霉素抗性基因；Gluc是Gaussia荧光素酶基因；miRNAT是一种miRNA靶序列。
以下实施例对本发明的AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。
实施例1AAV2-EGFP病毒和AAV2-luc病毒的制备
将EGFP基因和firefly luciferase基因分别插入AAV载体pAAV2neo中，获得重组质粒pAAV2neo-EGFP和pAAV2neo-luc(图1、图2)。用lipofectamine 2000(Invitrogen)分别转染至BHK21细胞中，加G418 800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK-21/pAAV2neo-EGFP和BHK21/pAAV2neo-luc。按文献方法(伍志坚，吴小兵等，一种高效的重组腺伴随病毒生产系统，中国科学(C辑)37(5)：423-430)制备重组AAV2病毒；用“氯仿处理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法(吴小兵等，一种快速和高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通报45(19)：2070-2075)纯化获得粗提液；进一步用肝素柱纯化获得AAV2病毒精纯液(rAAV2-EGFP病毒和rAAV2-luc病毒)。
实施例2重组AAV病毒的质量控制
为了有效控制反向感染的AAV病毒阵列对应于细胞培养板上包被的AAV病毒的孔间差异、板间差异和批间差异，须对AAV病毒制备过程进行质量控制，并对AAV病毒进行质量检定，确保AAV病毒的质量符合标准。
用于反向感染的AAV病毒阵列的AAV病毒，其质量标准和检定方法包含以下几个方面的内容：结构鉴定、基因组滴度(vg)、颗粒滴度(vp)、比活(vp/vg)、血清型鉴定、纯度、目的基因表达活性、酸碱度、无菌检查等。
1)PCR法鉴定重组AAV的基因片段(结构鉴定)
重组AAV基因组中含有ITR序列、CMV立早启动子、目的基因及bGH polyA。采用4对引物分别扩增ITR及ITR与CMV启动子连接区；CMV及CMV与目的基因连接区；目的基因及目的基因与bGH polyA连接区；bGH polyA及bGH polyA与ITR连接区以鉴定重组AAV病毒基因组DNA，阳性对照以包装病毒对应质粒DNA为模板，阴性对照以ddH2O为模板。将病毒于100℃煮沸10min，暴露出模板DNA，扩增时50ul体系加样4μl。引物量为30pmol，反应总体积50μl。
AAV病毒样品经PCR扩增后进行琼脂糖电泳，其迁移率应与对照相一致。
2)基因组滴度(vg)
采用DNA斑点杂交法。
材料：Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)；
方法：按Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒(Cat.No.1093657)的方法进行。以地高辛标记CMV/目的基因为探针，以系列稀释的AAV病毒包装质粒为标准对照，将样品的杂交信号与标准对照进行比较、定量。
3)颗粒滴度(vp)
AAV病毒的颗粒滴度是在AAV病毒满足一定纯度要求(SDS-PAGE纯度≥90％)的条件下，通过测定AAV病毒的蛋白浓度，以经验公式折算，得到其颗粒滴度。
病毒蛋白浓度测定方法按Pierce公司的BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书进行。
对AAV2病毒而言，以蛋白浓度(mg/ml)折算颗粒滴度(vp)的经验公式为：
vp(vp/ml)＝蛋白浓度(mg/ml)×1.33×1014
4)比活(vp/vg)
基因组滴度代表的是AAV病毒溶液中，目的基因被包装进了病毒的病毒量；颗粒滴度代表的是病毒溶液中病毒颗粒的总的病毒量，包括含有与不含有目的基因的病毒。将AAV病毒的基因组滴度与颗粒滴度结合起来，根据vp与vg的比值，才能更有效地综合判断AAV病毒的质量。
用于反向感染的AAV病毒阵列的AAV病毒的比活vp/vg控制在10～20之间。
5)血清型鉴定
由于不同血清型的SDS-PAGE电泳条带的大小具有特征性，通过对AAV病毒进行SDS-PAGE电泳，通过其电泳条带的大小与标准品比较，可对AAV病毒的血清型进行鉴别。进一步用特异性的抗体加以验证。
分离胶12％，浓缩胶5％(配制方法见分子克隆第二版)，恒流20mA，电泳约1h。电泳完毕，置于染色盘中，用考马斯亮蓝R250振荡染色2h，之后用脱色液脱色1h。加入的样品量为10μg。2型AAV病毒外壳蛋白电泳后应形成3个特征性条带，其大小分别约为87kD，72kD，62kD。
6)纯度
按5)相同的SDS-PAGE方法对AAV病毒进行SDS-PAGE电泳，重组AAV病毒的三种外壳蛋白总量应达到总蛋白量的90.0％以上。
7)目的基因表达活性
AAV病毒最主要的质量指标，包装到病毒中去的目的基因的表达活性，直接影响到反向感染的AAV病毒阵列的应用。EGFP和LUC是两个在反向感染的AAV病毒阵列中通用报告基因，它们的表达活性检测方法如下：
A、EGFP的检测：
对AAV病毒，按不同血清型，用其对应的敏感细胞作为受试细胞。对AAV2而言，用BHK21细胞作为受试细胞。
将BHK21细胞按1×105/孔接种到24孔细胞培养板中，过夜培养16～18小时，根据AAV病毒的基因组滴度，按MOl＝1×105加入一定量AAV病毒感染细胞，24小时后于荧光显微镜下观察荧光细胞，荧光细胞占总细胞的比例应大于80％。
B、LUC的检测：
对AAV病毒，按不同血清型，用其对应的敏感细胞作为受试细胞。对AAV2而言，用BHK21细胞作为受试细胞。
将BHK21细胞按1×105/孔接种到24孔细胞培养板中，过夜培养16～18小时，根据AAV病毒的基因组滴度，按MOl＝1×105加入一定量AAV病毒感染细胞，24小时后，直接吸取细胞培养上清用于LUC检测。
8)酸碱度
AAV病毒制品的pH值应为7.0-8.0。直接用精密pH试纸测量。
9)无菌检测
AAV病毒应无菌，检测方法按现行《中国药典》(三部)附录XIIA进行，应符合规定。
实施例3AAV病毒包被96孔板和反向转染实验
为了测试AAV病毒包被在细胞培养板上并在干燥状态下的感染活性，我们将纯化的AAV-EGFP制备成系列梯度稀释的病毒溶液，以5μl/well点在96孔细胞培养板的孔中，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)，制备成反向感染的AAV病毒阵列，然后无菌封闭细胞培养板，置于2～8℃保存。一定的时间点将反向感染的AAV病毒阵列用于贴壁细胞(BHK21)和悬浮细胞(U937)的反向感染，以检测其保存的稳定性。下面是实验是AAV病毒阵列放置9天后进行的。
将BHK21细胞在消化后用含10％胎牛血清的DMEM制备成2.5×105/ml的细胞悬液，以100ul/孔的细胞量接种于反向感染的AAV病毒阵列，该阵列含有系列梯度的AAV2-EGFP，本实验中所使用的AAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：3.2×105、1.6×105、8.0×104、4.0×104、2.0×104、1.0×104、5.0×103、2.5×103、Negative Control(不加AAV病毒)。加入细胞后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，于荧光显微镜下观察AAV-EGFP介导的EGFP在细胞中的表达情况，并拍照，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP后24小时的荧光显微镜照片见说明书附图中的图3。结果表明，BHK21细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。
U937细胞是悬浮细胞，不需消化。将U937细胞轻轻从培养瓶壁吹下，收集细胞悬液，离心，置换培养上清为新鲜的含10％胎牛血清的DMEM，调整细胞悬液中细胞浓度为3.0×105/ml，以100ul/孔的细胞量接种于反向感染的AAV病毒阵列，该阵列含有系列梯度的AAV2-EGFP，本实验中所使用的AAV-EGFP的用量(vg/cell)分别为：2.6×105、1.3×105、6.4×104、3.2×104、1.6×104、8×103、4×103、2×103、Negative Control(不加AAV病毒)。加入细胞后，轻敲细胞培养板的边缘，使病毒阵列的病毒与接种的细胞混匀，放置于37℃、5％CO2培养箱培养。感染后24小时及48小时，于荧光显微镜下观察AAV-EGFP介导的EGFP在细胞中的表达情况，并拍照。U937细胞反向感染rAAV-EGFP24小时的荧光显微镜照片见说明书附图中的图4。结果表明，U937细胞反向感染rAAV-EGFP的24小时后，细胞仍能被rAAV-EGFP有效感染并表达绿色荧光蛋白，转染效率和表达水平(绿色的亮度)与病毒用量呈正相关。
实施例4携带hsa-mir142-3p靶序列的rAAV2-luc病毒构建和病毒制备
设计并合成以下两条序列：
Seq1：5’gaattcgtagactccataaagtaggaaacactacagtagacggatcca 3’
Seq2：5’ggatccgtctactgtagtgtttcctactttatggagtctacgaattca 3’
将Seq1和Seq1退火后，插入pMD18T simple vector(购自Takara)中，得到pT-mir142-3pT。以pT-mir142-3pT为模板，以5’gagcggataacaatttcacacagg3’和5’cgccagggttttcccagtcacgac3’为引物，PCR扩增得到含有hsa-mir142-3p靶序列的片段。该片段Accl酶切后的混合物与Accl酶切并去磷处理的pT-mir142-3pT载体片段连接，筛选得到3个hsa-mir142-3p靶序列的克隆(pT-3mir142-3pT)。将含3个hsa-mir142-3p靶序列的片段插入pAAV2neo，得到含有3个hsa-mir142-3p靶序列的pAAV2neo载体。
将firefly luciferase基因插入含3个hsa-mir142-3p靶序列串联序列的pAAV2neo载体中，获得pAAV2neo-luc-142T(图5)。用lipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒pAAV2neo-luc-142T转染至BHK21细胞中，加G418800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK21/pAAV2neo-luc-142T。用实施例1所述方法制备重组AAV2病毒，命名为rAAV2-luc-142T。
实施例5用U937细胞检测pAAV2neo-luc-142T中hsa-mir142-3p靶序列的功能
文献报道，U937细胞中hsa-mir142-3p有较高的内源性表达。因此本实验用U937细胞来测试所构建的pAAV2neo-luc-142T中hsa-mir142-3p靶序列的功能。以HEK293T细胞为阴性对照。将U937、HEK293T细胞分别接种于96孔细胞培养板(DMEM，10％FBS)，其中U9375×104/孔，HEK293T 1×104/孔，各12孔。每种细胞分为4组，每组3个孔，具体转染实验分组见表一。
表一：
用lipofectamine 2000(Invitrogen)将重组质粒pAAV2neo-luc、pAAV2neo-luc-142T分别以0.1μg/孔转染至U937和HEK293T细胞中。转染24h和48h后，用luciferase assay system(Promega)检测细胞中萤火虫荧光素酶表达情况，试验结果如图5所示。
由图6所示结果可见，分别转染等量pAAV2neo-luc、pAAV2neo-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见明显差异；相反，U937细胞间则差异显著，转染pAAV2neo-luc-142T的U937细胞萤火虫荧光素酶的表达量相当于转染等量pAAV2neo-luc的U937细胞的1/30或以下，且这种差异不随时间变化。由于内源性的hsa-mir142-3p在HEK293T细胞中不表达(或极低表达)，而U937细胞中高表达，因此U937细胞中萤火虫荧光素酶的表达降低表明所构建的pAAV2neo-luc-142T中hsa-mir142-3p靶序列可被hsa-mir142-3p识别并被有效抑制。
实施例6AAV病毒介导的反向感染方法比较不同细胞中hsa-mir142-3p的表达活性
将纯化的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T溶液5×105vg/孔点于96孔细胞培养板孔中，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)，制成含rAAV2-luc和rAAV2-luc-142T阵列。阵列4℃放置48h后，将HEK293T、U937、Hela细胞接种于其孔中(DMEM，10％FBS，5×104/孔)，每种细胞各接种6孔。即对于每种病毒，一种细胞接种3孔。反向感染24h后，用luciferase assay system(Promega)检测细胞中萤火虫荧光素酶表达水平，试验结果如图7所示。
从图7的结果看，反向感染等量的rAAV2-luc或rAAV2-luc-142T的HEK293T细胞间，萤火虫荧光素酶表达量未见差异；Hela细胞与HEK2g3T细胞情况相似，萤火虫荧光素酶表达量也未见差异。相反，在U937细胞中，反向感染rAAV2-luc-142T的细胞中萤火虫荧光素酶的表达量相当于反向感染等量rAAV2-luc细胞的1/20。结果表明，hsa-mir142-3p在HEK2g3T和Hela细胞中低表达，在U937细胞中高表达。这与hsa-mir142-3p主要在造血细胞系、造血干细胞、T细胞和B细胞中高表达相一致(changzheng Chen，et al.MicroRNAmodulate hematopoietic lineage differatiation.science 303，83(2004))。
实施例7携带12种miRNA靶序列的AAV病毒阵列制备
1)12种miRNA靶序列的选取及靶序列的获得
参考Yu Wang等的报道(Yu Wang et al.J.Cell.Mol.Med.13(1)：12-23，2008.)，选取12种凋亡途径相关的肿瘤细胞中异常表达miRNA为研究对象。从http://microrna.sanger.ac.uk/网站查找获取这12种miRNA主要的成熟miRNA序列，根据waston-crick碱基配对法则推断出其miRNA完全互补的序列作为相应的靶序列。
2)序列合成
在每种miRNA靶序列5’端设计EcoRl酶切产生的突出末端，假定为该种miRNA靶序列正链；在每种miRNA的5’端设计Bglll酶切产生的突出末端，假定为该种miRNA靶序列负链。依照此设计原则合成以下每种miRNA靶序列的正负链。
hsa-mir155-f 5’aattacccctatcacgattagcattaa3’
hsa-mir155-r 5’gatcttaatgctaatcgtgataggggt3’
hsa-let7a-f 5’aattaactatacaacctactacctca3’
hsa-let7a-r 5’gatctgaggtagtaggttgtatagtt3’
hsa-mir17-92f 5’aattctacctgcactgtaagcactttg3’
hsa-mir17-92r 5’gatccaaagtgcttacagtgcaggtag3’
hsa-mir24-f 5’aattctgttcctgctgaactgagcca3’
hsa-mir24-r 5’gatctggctcagttcagcaggaacag3’
hsa-mir21-f 5’aatttcaacatcagtctgataagcta3’
hsa-mir21-r 5’gatctagcttatcagactgatgttga3’
hsa-mir15-f 5’aattcacaaaccattatgtgctgcta3’
hsa-mir15-r 5’gatctagcagcacataatggtttgtg3’
hsa-mir16-f 5’aattcgccaatatttacgtgctgcta3’
hsa-mir16-r 5’gatctagcagcacgtaaatattggcg3’
hsa-mir29b-f 5’aattaacactgatttcaaatggtgcta3’
hsa-mir29b-r 5’gatctagcaccatttgaaatcagtgtt3’
hsa-mir127-f 5’aattatcagagccctctgagcttcag3’
hsa-mir127-r 5’gatcctgaagctcagagggctctgat3’
hsa-mir106b-f 5’aattatctgcactgtcagcacttta3’
hsa-mir106b-r 5’gatctaaagtgctgacagtgcagat3’
hsa-mir98-f 5’aattaacaatacaacttactacctca3’
hsa-mir98-r 5’gatctgaggtagtaagttgtattgtt3’
hsa-mir224-f 5’aattaacggaaccactagtgacttg3’
hsa-mir224-r 5’gatccaagtcactagtggttccgtt3’
3)携带12种miRNA靶序列的rAAV2-Gluc病毒构建和病毒制备
将合成的每种miRNA靶序列的正负链退火后，插入我们已构建好的pAAV2neo-Gluc中Gaussia荧光素酶基因的3’UTR的EcoRl和Bglll位点之间，得到携带miRNA靶序列的pAAV2neo-Gluc-miRNAT(图8)。用lipofectamine 2000(Invitrogen)将携带miRNA靶序列的pAAV2neo-Gluc-miRNAT质粒转染至BHK21细胞中，加G418 800μg/ml选择培养10～15天得到稳定的载体细胞株BHK21/pAAV2neo-Gluc-miRNAT。按实施例1的方法制备和纯化各种AAV2-Gluc-miRNAT病毒。
4)包含12种AAV2-Gluc-miRNAT的AAV病毒阵列制备
将12种AAV2-Gluc-miRNAT的AAV病毒按顺序编号(具体见表二)。根据编号顺序，将病毒溶液5×105vg/孔点于96孔细胞培养板孔中(见表三示意)，在超净工作台中(保持一定风速)无菌状态下自然放置直至晾干(4～8hr)。待完全晾干后无菌封存，于4℃保存备用。
表二12种AAV2-Gluc-miRNAT的AAV病毒编号
| miRNA | 质粒 | 病毒 | 病毒编号 |
| Control | pAAV2neo-Gluc | rAAV2neo-Gluc | (1) |
| hsa-mir155 | pAAV2neo-Gluc-155T | rAAV2neo-Gluc-155T | (2) |
| hsa-let7a | pAAV2neo-Gluc-let7aT | rAAV2neo-Gluc-let7aT | (3) |
| hsa-mir17-92 | pAAV2neo-Gluc-17T | rAAV2neo-Gluc-17T | (4) |
| hsa-mir24 | pAAV2neo-Gluc-24T | rAAV2neo-Gluc-24T | (5) |
| hsa-mir21 | pAAV2neo-Gluc-21T | rAAV2neo-Gluc-24T | (6) |
| hsa-mir15 | pAAV2neo-Gluc-15T | rAAV2neo-Gluc-15T | (7) |
| hsa-mir16 | pAAV2neo-Gluc-16T | rAAV2neo-Gluc-16T | (8) |
| hsa-mir29b | pAAV2neo-Gluc-29bT | rAAV2neo-Gluc-29bT | (9) |
| hsa-mir127 | pAAV2neo-Gluc-127T | rAAV2neo-Gluc-127T | (10) |
| hsa-mir106b | pAAV2neo-Gluc-106T | rAAV2neo-Gluc-106T | (11) |
| hsa-mir98 | pAAV2neo-Gluc-98T | rAAV2neo-Gluc-98T | (12) |
| hsa-mir224 | pAAV2neo-Gluc-224T | rAAV2neo-Gluc-224T | (13) |
表三12种AAV2-Gluc-mirT的AAV病毒在96孔板中的排列顺序
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | (1) | (1) | (1) | (2) | (2) | (2) | (3) | (3) | (3) | (4) | (4) | (4) |
| B | (5) | (5) | (5) | (6) | (6) | (6) | (7) | (7) | (7) | (8) | (8) | (8) |
| C | (9) | (9) | (9) | (10) | (10) | (10) | (11) | (11) | (11) | (12) | (12) | (12) |
| D | (13) | (13) | (13) | |||||||||
| E | ||||||||||||
| F | ||||||||||||
| G | ||||||||||||
| H |
名词及缩写词解释
1、AAV：adeno-associated virus，腺相关病毒。
2、ITR：inverted terminal repeat，倒转末端重复。
3、AAV2病毒：2型AAV病毒(adeno-associated virus serotype 2)。
4、pAAV2neo质粒：是一种携带了AAV2病毒ITR的质粒DNA。所述的AAV载体质粒一般由AAV2 ITR、启动子、目的基因或阻断序列、ployA、AAV2 ITR以及E.coli质粒骨架组成。质粒骨架上携带了neo基因的表达单位。
5、pAAV2neo-Gluc-miRNAT：pAAV2neo-Gluc-miRNA Target，Target为靶序列。
6、异时性基因：heterochronic gene，在线虫发育过程中扮演着重要角色，它们的准时表达决定了胚胎中每一个细胞的特征，从而让胚胎发育成正常的成体线虫。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120>AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列
<160>24
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir155-f
<400>1
aattacccct atcacgatta gcattaa 27
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir155-r
<400>2
gatcttaatg ctaatcgtga taggggt 27
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-let7a-f
<400>3
aattaactat acaacctact acctca 26
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-let7a-r
<400>4
gatctgaggt agtaggttgt atagtt 26
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir17-92f
<400>5
aattctacct gcactgtaag cactttg 27
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir17-92r
<400>6
gatccaaagt gcttacagtg caggtag 27
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir24-f
<400>7
aattctgttc ctgctgaact gagcca 26
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir24-f
<400>8
gatctggctc agttcagcag gaacag 26
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir21-f
<400>9
aatttcaaca tcagtctgat aagcta 26
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir21-r
<400>10
gatctagctt atcagactga tgttga 26
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir15-f
<400>11
aattcacaaa ccattatgtg ctgcta 26
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir15-r
<400>12
gatctagcag cacataatgg tttgtg 26
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir16-f
<400>13
aattcgccaa tatttacgtg ctgcta 26
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir16-r
<400>14
gatctagcag cacgtaaata ttggcg 26
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir29b-f
<400>15
aattaacact gatttcaaat ggtgcta 27
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir29b-r
<400>16
gatctagcac catttgaaat cagtgtt 27
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir127-f
<400>17
aattatcaga gccctctgag cttcag 26
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir127-r
<400>18
gatcctgaag ctcagagggc tctgat 26
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir106b-f
<400>19
aattatctgc actgtcagca cttta 25
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir106b-r
<400>20
gatctaaagt gctgacagtg cagat 25
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir98-f
<400>21
aattaacaat acaacttact acctca 26
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir98-r
<400>22
gatctgaggt agtaagttgt attgtt 26
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir224-f
<400>23
aattaacgga accactagtg acttg 25
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hsa-mir224-r
<400>24
gatccaagtc actagtggtt ccgtt 25
Claims (9)
1.本发明所述的AAV病毒反向感染技术，其技术特征是将重组AAV病毒预先包被在细胞培养支持物上，在加入活细胞悬液时，所包被的AAV病毒能有效感染加入的细胞(反向感染)，既使病毒在支持物上被晾干后仍保持其感染细胞的能力。
2.依据权利要求1，被预先包在细胞培养支持物上的重组AAV病毒，是被预先设计分布成为AAV病毒阵列，其特征在于将一种或多种重组腺相关病毒(AAV)有序地包被在细胞培养支持物上、晾干制备成可存放的重组AAV病毒阵列产品，所包被的重组AAV病毒在存放过程中仍保持感染细胞的能力。
3.依据权利要求2，本发明所述的AAV病毒阵列，在使用中，将使后加入的待检测的活细胞被预先所包被的重组AAV病毒反向感染，发生反向感染之后，被重组AAV病毒带入细胞中的基因和基因元件将在细胞中产生的导入基因和基因元件的表达和调控作用；
4.依据权利要求2，本发明所述的AAV病毒阵列，其技术特征在于将定量的重组AAV病毒无菌条件下包被在细胞培养支持物上，如96孔板和/或384孔板等，加入待检测的细胞，细胞可以被预包被的AAV病毒有效地感染，并且被AAV载体携带的基因和基因元件可进入细胞并表达和表现生物学功能；
5.依据权利要求2，本发明所述的AAV病毒阵列，是一种可长期保存的产品，其技术特征是将一种或多种重组AAV病毒有序地排列在细胞培养支持物上，如96孔板，384孔板，晾干后无菌封口，4℃存放。
6.依据权利要求1和2，本发明所述的重组AAV病毒，其特征在于基因组携带了报告基因，此报告基因为绿色荧光蛋白基因；
7.依据权利要求1和2，本发明所述的重组AAV病毒，其特征在于基因组携带了报告基因，此报告基因为荧光索酶基因；
8.依据权利要求1和2，本发明所述的重组AAV病毒的基因组中的特征在于，在绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因的3’非编码区携带了miRNA靶序列，miRNA靶序列的插入位置是荧光索酶编码区之后，polyA加尾信号之前；
9.依据权利要求3，本发明所述的AAV病毒阵列，其特征在于由多种携带了不同miRNA靶序列的重组AAV病毒组成，命名为AAV病毒-miRNA靶序列阵列，其用途是同时检测活细胞中多种miRNA的表达活性及其表达活性的动态变化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100090596A CN101967496A (zh) | 2009-02-16 | 2009-02-16 | Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100090596A CN101967496A (zh) | 2009-02-16 | 2009-02-16 | Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101967496A true CN101967496A (zh) | 2011-02-09 |
Family
ID=43546718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100090596A Pending CN101967496A (zh) | 2009-02-16 | 2009-02-16 | Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101967496A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104603272A (zh) * | 2012-07-06 | 2015-05-06 | 宝生物工程株式会社 | 能够产生腺伴随病毒载体的细胞 |
| WO2019126222A1 (en) * | 2017-12-18 | 2019-06-27 | Spark Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus (aav) vector lipid nanoparticle compositions and methods of use |
-
2009
- 2009-02-16 CN CN2009100090596A patent/CN101967496A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104603272A (zh) * | 2012-07-06 | 2015-05-06 | 宝生物工程株式会社 | 能够产生腺伴随病毒载体的细胞 |
| US9422576B2 (en) | 2012-07-06 | 2016-08-23 | Takara Bio Inc. | Cell capable of producing adeno-associated virus vector |
| WO2019126222A1 (en) * | 2017-12-18 | 2019-06-27 | Spark Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus (aav) vector lipid nanoparticle compositions and methods of use |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | miR-27a regulates the growth, colony formation and migration of pancreatic cancer cells by targeting Sprouty2 | |
| Sun et al. | MicroRNA-31 activates the RAS pathway and functions as an oncogenic MicroRNA in human colorectal cancer by repressing RAS p21 GTPase activating protein 1 (RASA1) | |
| Xiong et al. | Effects of microRNA‐29 on apoptosis, tumorigenicity, and prognosis of hepatocellular carcinoma | |
| Zhang et al. | MicroRNA-26a promotes anoikis in human hepatocellular carcinoma cells by targeting alpha5 integrin | |
| Loftus et al. | miRNA expression profiling in migrating glioblastoma cells: regulation of cell migration and invasion by miR-23b via targeting of Pyk2 | |
| Ma et al. | MicroRNA-200c overexpression inhibits chemoresistance, invasion and colony formation of human pancreatic cancer stem cells | |
| CN104818334B (zh) | 与肺腺癌转移相关的微小rna | |
| CN107805663B (zh) | Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用 | |
| Chen et al. | Downregulated pseudogene CTNNAP1 promote tumor growth in human cancer by downregulating its cognate gene CTNNA1 expression | |
| CN109593848B (zh) | 一种肿瘤相关序列、长链非编码rna及其应用 | |
| CN104208723B (zh) | miR-638在抗急性髓系白血病中的应用 | |
| CN110066875B (zh) | 一种长链非编码RNA lncLCIR-1作为肺癌分子标志物的应用 | |
| CN102453713A (zh) | HULC siRNA及其在制备治疗肝癌的药物中的用途 | |
| CN108342390B (zh) | 用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码rna及制备、用途 | |
| CN102719556A (zh) | 基于AAV载体的高通量miRNA活性检测方法及其应用 | |
| CN106350520B (zh) | 一种白血病相关的环状circRNA-008488基因及其用途 | |
| CN111378664B (zh) | 一种环状rna及其应用 | |
| CN101967496A (zh) | Aav病毒反向感染技术及aav病毒阵列 | |
| CN108034655A (zh) | 一种长非编码rna及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用 | |
| CN107190005A (zh) | lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用 | |
| CN106995857B (zh) | 生物标记物ensg00000267416在癌症中的应用 | |
| CN104774966A (zh) | 肺腺癌miRNA标记物 | |
| CN105457041B (zh) | miR-26a在非小细胞肺癌中的应用 | |
| CN109486816A (zh) | 一种用于肿瘤治疗的多聚核苷酸及其应用 | |
| CN102061311A (zh) | 携带基于hGluc基因的miRNA传感器的重组AAV病毒库及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110209 |