CN102453713A - HULC siRNA及其在制备治疗肝癌的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及HULC siRNA及其在制备治疗肝癌的药物中的用途。特别地，本发明涉及针对HULC的siRNA、表达针对HULC的siRNA的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞、活性成分为所述针对HULC的siRNA或所述表达载体的组合物。本发明还涉及一种用于治疗肝癌的试剂盒，其含有所述针对HULC的siRNA或所述表达载体。本发明还涉及所述针对HULC的siRNA或所述表达载体在制备治疗肝癌的药物中的用途以及HULC作为肝癌的治疗靶点的用途。本发明为肝癌的治疗提供了一种有前景的作用靶点及一类有治疗前景的药物候选物。
Description
技术领域
本发明涉及HULC siRNA、表达针对HULC的siRNA的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞、活性成分为所述针对HULC的siRNA或所述表达载体的组合物。本发明还涉及一种用于治疗肝癌的试剂盒，其含有所述针对HULC的siRNA或所述表达载体。本发明还涉及所述针对HULC的siRNA或所述表达载体在制备治疗肝癌的药物中的用途以及HULC作为肝癌的治疗靶点的用途。
背景技术
肝癌是全球范围内致死率最高的肿瘤之一，而我国又是肝癌的高发国家，每年有超过30万的病人死于肝癌。作为一个多因素的遗传性疾病，肝癌的病因非常复杂，目前肝癌诊疗中存在着早期诊断难、复发转移率高、创新药物和治疗手段少等问题，因此，对肝癌分子发病机制及肝癌诊治新技术、新疗法的研究尤为重要和迫切[1]。miRNA是一种小分子的非编码RNA，它的机制与siRNA类似，与靶mRNA结合后抑制mRNA的翻译。多个研究发现，在肿瘤组织中，miRNA的表达谱发生了明显的变化，它被认为是肿瘤诊断的标志物以及治疗的工具[2]。2009年6月《Cell》杂志报道，美国的Janaiah Kota等人发现将一种在肝癌中低表达的miRNA重新导入小鼠肝癌模型中可以引起肿瘤细胞特异性的凋亡并且无毒性，从而治疗肿瘤[3]。这些通过导入非编码RNA来治疗肝癌的研究成果为肿瘤的治疗提出了新的方向。
非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，是指那些由DNA转录却并不翻译成蛋白的RNA，主要包括snoRNA，miRNA，siRNA，piRNA以及一些长片段的非编码RNA等[4]。这些ncRNA分子通过不同的机制，如RNA-RNA碱基配对，RNA蛋白相互作用，RNA-DNA相互作用等，在细胞调控的各个层面中发挥功能，包括参与染色质修饰、转录调节、剪切加工、RNA稳定性调节等。近来还有研究发现，在一些肿瘤组织 中，ncRNA有着过表达或者低表达的现象。提示在肿瘤的发生发展过程中，它们可能发挥着重要的作用[5，6，7]。细胞增殖、分化以及凋亡的异常导致肿瘤的发生，而ncRNA作为一个重要调控单位，参与调控相关基因的表达，它们的异常表达有可能引起这些现象的发生。随着越来越多肿瘤特异性ncRNA的发现以及对这些ncRNA在肿瘤发生发展中分子机制的深入研究，在不远的将来它们不仅能作为早诊、预后的标志物，甚至可以成为肿瘤治疗的靶位点，帮助人类早日战胜肿瘤。
2007年，研究者们在肝癌中发现了一种明显表达升高的基因，并将它命名为HULC，即Highly Up-reglated in Liver Cancer，其在NCBI上的基因序列号为NR_004855.2。这个基因定位于6p24.3，含有一个内含子和两个外显子，其中内含子长度为1152bp，两个外显子分别为182bp和303bp。HULC基因转录产物经过剪切和加工后形成一个500bp的RNA，具有类似于mRNA的polyA尾结构。但通过序列比对，在现在已知的任何物种的蛋白中都不含这种氨基酸序列。用这72个预测的氨基酸制备抗体，在HULC RNA高表达的肝癌组织中检测，也未能发现目的条带。同时通过体外翻译的实验，也进一步证实了该序列并不编码蛋白，即HULC是一种长片段的非编码RNA[8]。该研究由KatrinPanzitt等人发表在07年Gastroenterology杂志上，另外Matouk等人在2009年的Eur J Gastroenterol Hepatol杂志上发表关于HULC RNA不仅在原发的肝癌组织中高表达，并且在结肠癌肝转移的组织中也检测到其高表达[9]。由于HULC RNA除了在肝癌组织中高表达还能在肝癌病人的血液中检测到其高表达，所以它可以作为一种潜在的肝癌标志物应用到诊断中，甚至在不久的将来有可能会应用到肝癌的治疗中。但截至目前，现有研究仅证明HULC在肝癌或结肠癌肝转移的组织高高表达，尚未知晓该高表达是肝癌发展的结果还是肝癌发展的原因。
siRNA是一种双链的小分子RNA，一般长度为21-25个核苷酸，在RNAi(RNA干扰)途径中起作用，进来逐渐成为科学家们研究的热点。《科学》杂志将其列为2002年10大科技突破之首。这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，便会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了[10]。1998年，美国斯坦福大学医学院的安德鲁·法尔等发现了siRNA，并凭借这个惊 人的发现而获得了2006年生理学/医学奖。2004年，美国生物学家、1993年诺贝尔生理学或医学奖获得者菲利普·夏普在《自然》杂志上撰文指出：“RNAi有望成为迄今最有力的实验室工具。”siRNA可以通过化学合成、DNA载体导入以及反转录病毒载体导入的方法导入细胞中，由于siRNA具有高度的序列专一性而使特定基因沉默，功能丧失，目前，siRNA已经被广泛的应用到了特定基因的功能研究中。目前siRNA的获取方式主要有化学合成、siRNA表达载体以及体外转录等。其中化学合成的方法具有操作简便，转染效率高，对细胞的或者组织的毒副作用小，可大规模制备等优势。
由于siRNA能抑制特定基因的表达，应用siRNA进行基因治疗有非常广阔的临床应用前景。心脏病、肝炎、癌症和艾滋病等大都是人类基因变异或病毒入侵造成的，应用siRNA技术可望能关闭某些特殊基因而治愈这些疾病。目前，各大生物技术公司都在积极开发这类药物，并即将进入临床试验阶段。原癌基因是细胞基因组中的正常组成成分，当受到多种因素的作用使其发生变异时，激活成为癌基因，癌基因与细胞异常增殖及癌的发生有关。可以应用siRNA技术来抑制癌基因的mRNA，从而抑制肿瘤生长，同时，还可通过siRNA技术促进癌细胞凋亡、调控细胞周期以及抑制血管生成等方面来治疗癌症。尽管RNAi技术作为肿瘤基因治疗的新型工具仍然存在着许多急待解决的问题，如怎样提高肿瘤细胞的靶向性等等。但随着科学工作者对RNAi研究的不断深入，siRNA技术将会成为一种非常有前景的肿瘤治疗手段。
因此，如果能利用RNAi技术，涉及特异性针对HULC的siRNA，彻底研究清楚HULC和肝癌或结肠癌转移的组织间的关系，将会为肝癌相关的癌症的治疗提供一种有益的途径。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于利用RNAi技术研究清楚HULC与肝癌相关的癌症的关系。
因此，本发明的第一方面涉及一种针对HULC的siRNA。本领域技术人员公知针对HULC的siRNA的获取方法，优选地，所述获取方 法为全化学合成、重组表达或体外转录。优选地，所述的针对HULC的siRNA选自：
siRNA：5’-UAAAGGCUCCAAUUCCAUCAUGAGU-3’(SEQ IDNO.5)或
siRNA-B：5’-UUGAAAUGUCCACGAUCAGAGUUCC-3’(SEQID No.6)。
本发明的第二方面涉及一种表达如上所述的针对HULC的siRNA的表达载体，优选地，所述表达载体为原核表达载体或真核表达表达载体，更优选地，所述表达载体为真核表达载体，最优选地，所述真核表达载体为腺病毒表达载体。
本发明的第三方面涉及一种含有如上所述的表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，最优选地，所述细胞为HepG2细胞。
本发明的第四方面涉及一种活性成分为如上所述的针对HULC的siRNA或如上所述的表达载体的组合物。本领域技术人员公知，在制备所述组合物时，考虑到siRNA或表达载体本身的性质以及所要应用的目的，其还可以另外包含抑制RNA降解的试剂、pH调节剂、赋形剂等药学上可接受的辅料。
本发明的第五方面涉及一种用于治疗肝癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如上所述的针对HULC的siRNA或如上所述的表达载体。本领域技术人员公知，在制备所述试剂盒时，考虑到siRNA或表达载体本身的性质以及所要应用的目的，其还可以另外包含抑制RNA降解的试剂、pH调节剂、赋形剂等药学上可接受的辅料。
本发明的第六方面涉及如上所述的针对HULC的siRNA或如上所述的表达载体在制备治疗肝癌的药物中的用途。
本发明的第七方面涉及一种HULC作为肝癌的治疗靶点的用途。优选地，所述治疗靶点选自：
靶序列1：5’-ACTCATGTAGGAATTGGAGCCTTTA-3’(SEQ IDNo.7)，或
靶序列2：5’-GGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA-3’(SEQ ID No.8)。
换言之，在本研究中，我们分别针对在肝癌或结肠癌肝转移的组织中高转录的HULC基因的不同靶位点，委托invitrogen公司化学合成两段siRNA序列。当然，本领域技术人员公知，针对HULC基因可以设计多种siRNA序列，只要这样的siRNA序列可以有效的敲除HULCRNA的表达。这样的siRNA序列也落入本发明的保护范围。我们的研究发现，通过瞬时转染这两种siRNA片段，可以敲除HULC RNA在肝癌细胞系中的内源性RNA高表达，从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭以及抗凋亡能力。通过转染我们设计的siRNA序列，可以明显敲降HULCRNA的表达，并能抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭以及抗凋亡的能力。因此，本发明首次证实HULC RNA表达的敲除与肝癌细胞增殖、侵袭以及抗凋亡的抑制间存在直接对应的关系，HULC完全可以作为肝癌的治疗靶点，本发明的siRNA未来也有望作为一种生物治疗技术应用到肝癌的治疗中。
附图说明
图1是RT-PCR检测293T，EC9706，KYSE150，HCT116，SMMC-7721，HepG2，H446以及H1299共8株细胞系中HULC RNA的表达水平，其中条带深浅代表RNA表达量的高低。HepG2细胞株中HULC RNA表达水平明显升高，故选择其作为敲降HULC RNA的研究对象。
图2是分别转染两种siRNA后，HULC RNA的敲降效率，同时用RT-PCR和real-time PCR检测siRNA的敲降效率，A为RT-PCR验证，其中条带深浅代表RNA表达量的高低；B为real-time PCR验证，分别以HULC RNA在细胞中的含量除以其细胞中GAPDH表达含量后做成柱状图。
图3是转染HULC RNA siRNA的细胞株以及转染阴性对照RNA的生长曲线。
图4是克隆形成实验结果图，A、B分别为显微观察图和柱状统计图。
图5是穿膜实验结果图。其中A是穿过膜的细胞照片，B是统计 后的做成的柱状图。
图6是用不同浓度顺铂处理细胞后，检测其凋亡率。其中HULCsiRNA转染的细胞在40μM浓度下其凋亡率与阴性对照siRNA转染的细胞有明显差异。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1、HULC RNA高表达细胞系的筛选
利用RT-PCR的方法，筛选出HULC RNA高表达细胞系HepG2(电泳图见图1)。在293T，EC9706，KYSE150，HCT116，SMMC-7721，HepG2，H446以及H1299共8种肿瘤细胞系(均为商业化的细胞系)中，HepG2细胞系HULC的RNA表达量非常高(见图1)。
RT-PCR及所采用的引物如下：
HULC：上游引物：5’-AACCTCCAGAACTGTGAT-3’(SEQ IDNO.1)
下游引物：5’-CATAATTCAGGGAGAAAG-3’(SEQ ID NO.2)
产物大小：216bp
GAPDH：上游：5-GCT GAG AAC GGG AAG CTT GT-3(SEQ IDNO.3)
下游：5-GCC AGG GGT GCTAAG CAG TT-3(SEQ IDNo.4)
产物大小：299bp
RT(逆转录)的条件：各取5μg细胞总RNA用SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit完成cDNA第一链合成。
PCR条件：取1μl逆转录合成的cDNA第一链作为模板，25ulPCR 反应体系，退火温度为55度，30个循环，扩增目标基因。PCR反应产物10μl上样于1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例2、HULC siRNA的敲除效率
分别针对该基因不同的靶位点，委托invitrogen公司化学合成下述两段siRNA序列：
siRNA-A：5’-UAAAGGCUCCAAUUCCAUCAUGAGU-3’(SEQID NO.5)(仅指正义链)
siRNA-B：5’-UUGAAAUGUCCACGAUCAGAGUUCC-3’(SEQID No.6)(仅指正义链)。
通过用HULC siRNA转染HepG2细胞系，并利用RT-PCR以及real-time PCR方法验证其敲降效率。
上述siRNA-A和siRNA-B所针对的HULC中的靶点序列分别如下：
靶序列1：5’-ACTCATGTAGGAATTGGAGCCTTTA-3’(SEQ IDNo.7)，或
靶序列2：5’-GGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA-3’(SEQ IDNo.8)。
转染条件：
①将2μM siRNA稀释于500μl无血清RPMI-1640培养基中，轻轻混匀；再取4μl RNAi MAX(购自invitrogen公司)稀释于上述500μlRPMI-1640无血清培养基中，混匀，室温孵育20分钟。
②消化HepG2细胞，将细胞种入上述含有复合物的培养皿中，并使细胞在转染24小时后密度在大约30-50％之间。
RT-PCR反应以及引物同上。
real-time PCR(实时荧光定量PCR)引物同上，反应条件同上。应用ABI 7300thermocycler实时荧光定量PCR仪完成，实验获得的数据使用ABI公司的System SDS software软件进行分析。
在siA、siB及siNC(购自invitrogen公司，为通用阴性对照，货号为12935-300)。在本实验中，该序列的转染不会敲降HULC以及任何其他的基因，从而起到阴性对照的作用。)转染细胞后，HULC RNA 的表达量分别占作为内标的GAPDH mRNA表达量的0.052±0.003％、0.039±0.001％以及0.162±0.001％。表明这两种siRNA片段都能够有效的敲降HULC表达水平，敲降效率分别达到68.1％和76.1％(见图2，A-B)。
实施例3、HULC siRNA对细胞生长速度的影响
将HepG2细胞以每孔5×103个种入24孔板中，分别转染对照siNC、siA及siB，然后在1、2、3、4、5天消化细胞计数(每天平行设置3孔取平均数)。以细胞培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。结果发现转染HULC siRNA的细胞系与转染的阴性对照的细胞株相比，细胞生长速度明显减慢，生长曲线呈显著减慢上升趋势(见图3)。
实施例4、HULC siRNA对细胞株克隆形成能力的影响
克隆形成实验
①取生长状态良好的细胞(约80％融合度)，用胰蛋白酶消化成单个，接种细胞于六孔板(购自corning公司)中，每孔500个，设三个平行皿。
②将培养皿置37℃5％CO2培养箱中14天，至克隆形成。
③克隆固定和染色：倒去培养基，用PBS洗涤两次，加入70％的甲醇固定，铺满培养皿表面，固定10分钟。弃去固定液，待稍干燥后(约5分钟)加入0.5％的结晶紫染色液(甲醇配制)，染色约20分钟，在镜下检查染色程度，在克隆着色足够时用水洗去残余染液，以每团细胞数大于50个时作为一个克隆进行计数，并检查克隆大小。克隆形成试验表明转染HULC siRN的细胞株克隆形成能力明显低于转染阴性对照的细胞株(见图4，A-B)。
实施例5、HULC siRNA对细胞株穿透能力的影响
穿膜实验(Transwell)
使用corning costar的Transewll小室检测细胞的侵袭能力
①将Matrigel稀释至250μg/ml，包被8μm聚碳酯膜，37℃5％CO2 孵育30分钟待用。
②取生长状态良好的细胞(约80％融合度)，用胰蛋白酶消化，将200μl 1×104个细胞种植于每个Transwell小室的上层。
③将800μl含有纤维连接蛋白(5μg/ml)的RPMI1640完全培养基，加入到Transwell小室的下层。
④将Transwell小室置于37℃5％CO2培养箱中，培养10小时。
⑤用棉签刮去上室中的细胞。
⑥以75％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗。
⑦显微镜下计数聚碳酯膜下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。
Transwell检测表明低表达HULC RNA后细胞株穿透能力明显低于转染阴性对照RNA的细胞株(见图5，A-B)，说明敲降HULC RNA可抑制肿瘤细胞的恶性度以及肿瘤细胞的转移能力。
实施例6、HULC siRNA对细胞凋亡能力的影响
流式细胞仪检测细胞凋亡
胰蛋白酶消化处理培养细胞并重悬，1000rpm离心5分钟，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞三次，加入1ml预冷的10％甲醛，室温作用10分钟。离心收集细胞，用PBS洗两次。细胞沉淀用1ml预冷的含3％血清和70％乙醇的PBS于-20℃固定过夜，离心收集细胞，用PBS洗细胞沉淀。加入200μl RNase A(1mg/ml)，37℃水浴30分钟。再加入800μl碘化丙啶染色液(50μg/ml)，混匀，置4℃避光30分钟。使用荧光激活细胞分选器(Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS)(Becton-Dickinson，USA)检测，记录激发波长488nm处的红色荧光，每份标本均检测10000个细胞结果用细胞周期拟合软件DNAMultiCycle进行分析。
细胞凋亡实验表明，低表达HULC RNA后细胞抵抗顺铂引起的凋亡能力明显减弱，特别在高浓度(40μM)的条件下，具有统计学意义(见图6)。
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Claims (10)
1.一种针对HULC的siRNA。
2.根据权利要求1所述的针对HULC的siRNA，其选自：
siRNA-A：5’-UAAAGGCUCCAAUUCCAUCAUGAGU-3’(SEQID NO.5)或
siRNA-B：5’-UUGAAAUGUCCACGAUCAGAGUUCC-3’(SEQID No.6)。
3.根据权利要求1或2所述的针对HULC的siRNA，其特征在于其采用化学合成、重组表达或体外转录方法获得。
4.一种表达权利要求1或2所述的针对HULC的siRNA的表达载体，优选地，所述表达载体为原核表达载体或真核表达表达载体，更优选地，所述表达载体为真核表达载体，最优选地，所述真核表达载体为腺病毒表达载体。
5.一种含有权利要求4所述的表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，最优选地，所述细胞为HepG2细胞。
6.一种活性成分为如权利要求1或2所述的针对HULC的siRNA或如权利要求4所述的表达载体的组合物。
7.一种用于治疗肝癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如权利要求1或2所述的针对HULC的siRNA或如权利要求4所述的表达载体。
8.根据权利要求1或2所述的针对HULC的siRNA或如权利要求4所述的表达载体在制备治疗肝癌的药物中的用途。
9.一种HULC作为肝癌的治疗靶点的用途。
10.根据权利要求9所述的HULC作为肝癌的治疗靶点的用途，其特征在于所述治疗靶点选自：
靶序列1：5’-ACTCATGTAGGAATTGGAGCCTTTA-3’(SEQ IDNo.7)，或
靶序列2：5’-GGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA-3’(SEQ IDNo.8)。
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