CN113005179B - 一种基于dna-多肽探针技术定量核酸的质谱方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物快速检测技术领域,具体涉及一种基于DNA‑多肽探针技术定量核酸的质谱方法,包括如下步骤:以待测核酸的核苷酸序列为基础,设计DNA探针;筛选出特征多肽,并与所述DNA探针构建DNA‑多肽探针;将DNA‑多肽探针与待测核酸杂交;将杂交后的DNA‑多肽探针进行蛋白酶酶解,将DNA‑多肽探针中的特征多肽水解为报告肽;构建报告肽的LC‑MS/MS检测方法;利用构建的LC‑MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测;由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数,实现对待测核酸的定量检测。基于上述方法,将核酸的定量转换为多肽的定量,具有检测效率高、特异性强的优势;此外,通过该方法对肝癌标志物HULC进行检测,更有利于对肝癌进行风险评估。
Description
技术领域
本发明属于生物快速检测技术领域,具体涉及一种基于DNA-多肽探针技术的lncRNA质谱定量的方法和应用。
背景技术
长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。随着研究的逐步深入,lncRNA的功能逐渐被研究者发掘,其与肿瘤的发生发展密切相关。而HULC是在肝癌中发现最早的lncRNA,研究发现HULC在肝癌患者中显著升高,且可参与调控肝癌发生的分子机制,有望成为肝癌诊断的潜在生物学标志物。
目前定量检测lncRNA的方法主要有荧光染料法、Northern印迹分析、微阵分析(microarray)、紫外分光光度法和实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)等。荧光染料法试剂价格高、稳定性较差,Northern印迹和微阵分析分析时间长且动态范围窄,紫外分光光度法灵敏度低只能测定总核酸量,且易受到被检样品中其他杂质的干扰。qRT-PCR是目前核酸拷贝数定量的主要技术,该技术通过在PCR反应体系中加入荧光结合染料(SYBR green I)或荧光标记的探针(如Taq Man Probes),利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程通过标准曲线知模板进行定量分析。qRT-PCR需要的样本较少,但qRT-PCR技术通常需要对目标RNA进行预扩增以及进一步的荧光团标记步骤,而样品间背景的不同将影响PCR的扩增效率和响应,荧光染料的淬灭会影响信号收集从而引入偏差。目前尚无一种可直接特异检测lncRNA的定量方法,因此,开发能够以灵敏和直接的方式提供lncRNAs定量结果的新策略势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法,对核酸的检测具有较高的检测效率和检测特异性;利用本发明构建的核酸质谱定量检测方法对肝癌标志物HULC在肝细胞中的拷贝数进行检测,用于肝癌风险评估,作为本发明的第二个目的。
基于上述目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法,包括如下步骤:
(1)以待测核酸的核苷酸序列为基础,设计DNA探针;筛选出特征多肽,并与DNA探针构建DNA-多肽探针;
(2)将由步骤(1)构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交;
(3)将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解,将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽;
(4)构建报告肽的LC-MS/MS检测方法;
(5)利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测;
(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数,实现对待测核酸的定量检测。
本发明通过待测核酸与DNA-多肽探针的偶联,通过将核酸的定量转移为特征多肽的定量;由于DNA探针与待测核酸的碱基序列互补配对,使得对核酸的检测具有高度特异性;此外,通过HPLC-MS/MS对特征多肽的高效、精准的定量检测,实现对RNA的精准定量,解决了现有RNA定量方法存在的非特异性和精度低的问题。
进一步地,步骤(1)中DNA-多肽探针的具体构建过程如下:
A.将设计的DNA探针合成为5’端含有二硫键修饰的DNA探针;
B.将二硫键修饰的DNA探针中的二硫键进行还原;
C.将二硫键还原后的DNA探针与等量的马来酰亚胺修饰的特征多肽偶联反应,制得DNA-多肽探针。
本发明通过构建DNA-多肽探针,借助DNA-多肽探针中的DNA探针与待测核酸的特异性杂交,形成含有待测核酸的DNA-多肽探针,借助多肽探针中的多肽经水解后能够利用HPLC-MS/MS进行精确定量,使得本发明构建的DNA探针能够将待测核酸的定量转换为多肽的定量,解决现有核酸无法实现精准定量的问题。
进一步地,步骤(2)中DNA-多肽探针与待测核酸的杂交过程如下:
I.将生物素标记的待测核酸与链霉亲和素磁珠重悬孵育形成生物素化待测核酸;
II.将生物素化待测核酸与DNA-多肽探针按照摩尔比1:1混合,进行杂交孵育制得含有待测核酸的DNA-多肽探针。
通过将生物素标记的核酸与链霉亲和素磁珠孵育形成生物素化待测核酸,借助生物素-链霉亲和素放大系统,使得DNA-多肽探针能够与待测核酸按照摩尔比1:1特异性结合,使得将待测核酸的定量转移为DNA-多肽探针上的多肽的定量成为可能。
进一步地,上述待测核酸为lncRNA。
进一步地,上述lncRNA为HULC。
进一步地,上述DNA-多肽探针中DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;DNA-多肽探针中的特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;报告肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
进一步地,基于LC-MS/MS检测报告肽的质谱参数如下:一级质谱m/z为487.3;二级质谱m/z为690.3。
本发明通过对特征多肽报告肽的不同离子对的响应进行分析,选取一级质谱的m/z为487.3,二级质谱m/z为690.3,在进行HPLC-MS/MS检测过程中,色谱图的基线更为平稳,利用对报告肽出峰的面积进行计算时,使得计算结果更为准确,即通过选取上述离子对,有利于提高对特征多肽报告肽的检测精度。
进一步地,步骤(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数的具体换算关系为:待测核酸的拷贝数(copies/L)=3.78×1021×x mol/L,其中,x mol/L表示经LC-MS/MS检测得到的报告肽的摩尔浓度。
上述公式的具体推导过程如下:
以经LC-MS/MS检测得到的报告肽的浓度记为x mol/L,理论上报告肽和探针及HULC的比例是1:1:1,故报告肽的摩尔浓度等同于HULC的摩尔浓度,即当报告肽的检测摩尔浓度为x mol/L时,HULC的摩尔浓度为x mol/L,则由HULC的摩尔浓度x mol/L推导出HULC的拷贝数(copies/L),具体换算关系如下:
HULC的拷贝数(copies/L)=6.02×1023(copies/mol)×103×HULC的摩尔浓度(mol/L)/(HULC碱基数×平均分子量MW)=6.02×1023(copies/mol)×103×HULC的摩尔浓度(mol/L)/(482×330)=3.78×1021(copies/L)×HULC的摩尔浓度(mol/L)=3.78×1021×x mol/L。其中,MW=碱基数*330,HULC碱基数=482。
第二方面,本发明提供了一种利用上述定量核酸的质谱方法在肝癌检测中的应用。
进一步地,上述应用具体为利用基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法对肝细胞中的HULC拷贝数进行检测。
与现有技术相比,本发明的技术效果如下:
(1)本发明基于迈克尔加成反应将巯基修饰的DNA探针与马来酰亚胺修饰的特征多肽进行偶联形成DNA-多肽探针,借助DNA-多肽探针中的DNA探针与待测核酸的碱基序列互补配对,使得对核酸的检测具有高度特异性;借助DNA-多肽探针中的特征多肽经水解后能够利用HPLC-MS/MS进行定量检测,从而将核酸的定量检测转移为特征多肽的定量检测,解决了现有核酸定量方法存在的非特异性和精度不高的问题。
(2)本发明通过将待测核酸进行生物素标记,并将生物素标记的待测核酸与链霉素亲和素磁珠孵育形成生物素化待测核酸,借助生物素-链霉亲和素放大系统,使得DNA-多肽探针能够与待测核酸按照摩尔比1:1特异性结合,使得将待测核酸的定量转移为DNA-多肽探针上的多肽的定量成为可能。
(3)本发明通过构建的对DNA-多肽探针的HPLC-MS/MS的检测方法,对肝细胞内HULC的拷贝数进行定量检测,具有检测特异性高、精度高的优势,更有利于对肝癌进行风险评判。
综上所述,本发明提供的一种基于DNA-多肽探针技术的定量核酸的质谱方法,具有特异性高、准确度高的优势;此外,利用该方法对肝癌标志物HULC进行检测,更有利于对肝癌进行风险评估。
附图说明
图1为DNA探针的杂交效率评价结果图;
图2为特征多肽报告肽的一级质谱和二级质谱图;
图3为同位素标记的报告肽的一级质谱和二级质谱图;
图4为LC-MS/MS检测DNA-多肽探针酶切前后产物的色谱图;
图5为LC-MS/MS检测DNA-多肽探针与HULC靶序列杂交酶解后的报告肽色谱图(IS:内标报告肽,peptide:报告肽);
图6 LC-MS/MS检测人正常肝细胞和人肝癌细胞株中HULC的表达水平结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例所涉及各原料如无特别说明,均为市售通用产品。
实施例1基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法的构建
本实施例以HULC核酸为例,提供了一种基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法,以待测核酸的核苷酸序列为基础,设计DNA探针;筛选出特征多肽,并与DNA探针构建DNA-多肽探针;将DNA-多肽探针与待测核酸杂交;将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解,使得DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽;构建报告肽的LC-MS/MS检测方法;利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测;由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数,实现对待测核酸的定量检测。具体过程如下:
一、DNA-多肽探针的构建及验证
(一)本实施例所用相关试剂及其配制方法
(1)洗涤缓冲液(2×)
该洗涤缓冲液中含有10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA和2M NaCl,具体配制方法如下:
准确称量157.69mg Tris-HCl,29.225mg EDTA和11.68g NaCl,将其溶解于适量的超纯水中,然后加入100μL DEPC,定容至100mL,充分震荡过夜,然后高压灭菌制得洗涤缓冲液。
(2)RNA solution-A
RAN solution-A中含有DEPC-treated 0.1M NaOH和DEPC-treated 0.05M NaCl,具体配制方法如下:
准确称量0.4g NaOH和292.2mg NaCl,将其溶解于适量的超纯水中,然后加入100μL DEPC,定容至100mL,充分震荡过夜,然后高压灭菌,制得RNA solution-A。
(3)RNA solution-B
RNA solution-B中含有DEPC-treated 0.1M NaCl,具有配制方法如下:
准确称量58404mg NaCl,将其溶解于适量的超纯水中,然后加入100μL DEPC,定容至100mL,充分震荡过夜,然后高压灭菌制得RNA solution-B。
(4)DEPC水
准确量取100mL的超纯水,然后加入100μL DEPC,充分震荡过夜,然后高压灭菌制得DEPC水。
(5)10mg/mL的BSA溶液
准确称取0.1g BSA粉末,将其溶解于10mL的超纯水中,制得浓度为10mg/mL的BSA溶液。
(6)100mM的碳酸氢铵溶液
准确称量395.3mg的碳酸氢铵粉末,将其溶解于适量的超纯水中,定容至50mL。
(7)50mM的乙酸溶液
准确量取143μL冰醋酸,然后加入适量超纯水,定容至50mL。
(8)0.1%TFA溶液
准确量取50μL三氟乙酸,然后加入适量超纯水,定容至50mL。
(9)0.1%FA溶液
准确量取50μL甲酸,然后加入适量超纯水,定容至50mL。
(10)5%甲醇溶液(含0.1%TFA)
准确量取2.5mL的甲醇和50μL甲酸,然后加入适量超纯水,定容至50mL。
(二)DNA探针的设计及筛选
2.1DNA探针的设计原则
(1)DNA探针的核苷酸长度:15~30bp,其有效长度Ln=2(G+C)+(A+T),有效长度Ln一般不大于38bp。
(2)GC含量:应在40%~60%之间。
(3)碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。
(4)探针自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。
2.2DNA探针的设计
以NCBI数据库中HULC(ID:NR.004855)的序列信息为基础,利用Primer 5软件设计了三条与HULC相匹配的HULC-DNA探针,探针的具体信息见表1。为了进一步筛选杂交效率高,特异性好的特异探针,我们分别合成了三条地高辛标记的DNA探针进行了杂交效率的初步评价。
实验结果如图1显示,三条HULC-DNA探针的杂交效率无明显的差异(P>0.05),依据在HULC 3'端进行生物素标记和链霉亲和素固相化实验,发现HULC-DNA探针2对应的HULC序列靠近HULC的3'端更有利于进行后续的杂交实验。此外,我们通过Blast primer检索HULC-DNA探针2对应的HULC序列(GGGAAGCAUGGCAAAAUAUCAUCAAAACUGA),分析发现:只有两个序列与被检索序列匹配,其中一个是DNA序列,由于本申请研究提取的是RNA,故可将该基因排除,另外一个是HULC的序列(E value:2e-33,Query Cover:100%,Per.Ident:97.67%)。结果显示HULC-DNA探针2对应的序列与HULC具有一致性,且具有较好的特异性。因此,我们将选择HULC-DNA探针2作为构建DNA-多肽探针的基础探针。
表1三条HULC-DNA探针的具体信息
SEQ ID NO. | Sequence(5'to 3') | Length | MW(g/mole) | Tm | GC% |
1 | ACATAATTCAGGGAGAAAGTACAAA | 25 | 8068.16 | 51.1 | 32 |
2 | TTGATGATATTTTGCCATGCTT | 22 | 7049.46 | 47.4 | 31.8 |
3 | GATAACAACATAATTCAGGGA | 21 | 6799.32 | 46.5 | 33.3 |
(三)特征多肽的筛选
3.1特征多肽的筛选必须符合LC-MS/MS的检测要求,总体原则如下:
(1)所选肽段对于目标分析物是唯一的;
(2)肽段长度为6-16个氨基酸;
(3)序列中不含有甲硫氨酸和半胱氨酸等易发生化学修饰的位点;
(4)序列中不含有肽键易酶解断裂的天冬氨酸-甘氨酸序列和脱酰胺的N端谷氨酰胺等特殊序列形式等;
(5)具有良好的质谱离子响应。
3.2特征多肽的筛选流程
(1)根据特征多肽的筛选原则,查找文献资料和Pubmed数据库进行筛选;
(2)Blast-protein数据库检索特征多肽的特异性;
(3)GenePattern(https://cloud.genepattern.org/gp/pages/index.jsf)预测特征多肽的离子化效率(ESP)和等电点(pI)。
基于文献筛选及生物信息学分析,发现GDKAVLGVDPFR肽段具有良好的特异性,通过BlastP的搜索,未发现含有此肽段的蛋白。此外,用GenePattern(https://cloud.genepattern.org/gp/pages/index.jsf)对该肽段的离子化效率(ESP)和等电点(pI)进行预测,结果如下:Sequence ESP_Prediction GDKAVLGVDPFR:0.84038,PI:6.450,说明该肽段在质谱多反应监测器(MRM)中有良好的离子响应。以上结果均显示GDKAVLGVDPFR肽段具有良好的特异性和离子响应,因此,本研究选用此肽段作为构建DNA-多肽探针的特征多肽,按照此肽段的氨基酸序列进行特征多肽的合成,该特征多肽以及相应的报告肽的氨基酸序列如表2所示。
表2特征多肽以及报告肽的氨基酸序列表
利用HPLC对合成的特征多肽进行纯化分析,结果显示,合成的特征肽段的纯度可达99.39%;此外,通过MS质谱对特征多肽进行鉴定显示特征肽段分子量与表2中的理论值相符。
根据上述筛选出的特征多肽的氨基酸序列信息,对特征多肽上的缬氨酸进行了(13C5,15N)同位素标记,合成同位素标记的内标,同位素标记的内标如表3所示。
表3同位素标记的内标信息
利用HPLC对上述合成的同位素标记内标进行纯化分析,结果显示,具有内标的特征多肽的纯度可达97.45%;由MS质谱对具有内标的特征多肽进行鉴定分析,同位素内标的特征多肽分子量与表3中的理论值相符。
3.4特征多肽报告肽的质谱条件筛选及优化
3.4.1质谱检测样本的准备
(1)特征多肽标准品及同位素标记内标的合成:将上述实验筛选的特征多肽交付于生物技术公司合成特征多肽标准品及同位素标记的特征多肽内标。
(2)特征多肽标准品及同位素标记内标的前处理:将合成后的特征多肽标准品及同位素标记内标分别配制成浓度为1mg/mL的特征多肽溶液,用移液枪精确量取5μL上述1mg/mL的特征多肽溶液后加入胰蛋白酶,将特征多肽酶解为报告肽,过夜酶解后,进样检测。
3.4.2报告肽的离子对的选择
(1)首先采用Q Exactive Plus高分辨质谱仪对酶解后的报告肽进行Q1 MS一级离子全扫描,找到与报告肽及同位素标记内标报告肽对应的MS峰,确定母离子;优化后扫描的条件如下:扫描范围(m/z):300~1500,分辨率:70000,最大进样时间(sec):50,毛细管温度(℃):320,喷雾电压(kV):2.1,S-lens RF水平:50。
酶解后特征多肽报告肽的质谱母离子扫描图谱,如图2所示示,报告肽的母离子离子化碎片信息[M+H]+和[M+2H]2+的质荷比(m/z)分别是974.47和487.27,其中[M+2H]2+(487.27)的离子响应更高,因此选择487.27作为报告肽的母离子进行MS/MS二级离子(子离子)的预测。
(2)然后利用Product Ion MS 2模式对酶解后的报告肽进行二级离子(即子离子)扫描;优化后的扫描条件如下:报告肽母离子:m/z-487.27,扫描范围(m/z):400~1500,分辨率:70000,最大进样时间(sec):50,毛细管温度(℃):320,喷雾电压(kV):2.1,S-lens RF水平:50。酶解后特征多肽报告肽的质谱子离子二级扫描图谱,如图2所示,报告肽子离子的质荷比(m/z)分别是690.35,419.24和175.12。
(3)优化碰撞能量(CE),范围为5~30V,观察报告肽及同位素标记内标报告肽子离子和母离子之间的信号强度,选择信号强度最高的三个子离子为候选子离子;
(4)多重离子反应监测(MRM)的条件优化:确定报告肽及同位素标记内标报告肽的母离子和子离子后,进行MRM的条件优化,包括去族电压(DP:0~300)、碰撞能量(CE:5~150)等。
3.5同位素标记的特征多肽报告肽的质谱条件筛选及优化
(1)采用Q Exactive Plus高分辨质谱仪对同位素内标报告肽的母离子进行扫描,优化后扫描的条件如下:扫描范围(m/z):300~1500,分辨率:70000,最大进样时间(sec):50,毛细管温度(℃):320,喷雾电压(kV):2.1,S-lens RF水平:50。酶解后同位素内标报告肽的质谱母离子扫描图谱显示,报告肽的母离子离子化碎片信息[M+H]+和[M+2H]2+的质荷比(m/z)分别是979.56和490.28,其中[M+2H]2+(490.28)的离子响应更高,因此选择490.28作为同位素内标报告肽的母离子进行MS/MS二级离子(子离子)的预测。
(2)采用Q Exactive Plus高分辨质谱仪对同位素内标报告肽的离子进行二级扫描,优化后扫描的条件如下:同位素内标报告肽母离子:m/z-490.28,扫描范围(m/z):400~1500,分辨率:70000,最大进样时间(sec):50,毛细管温度(℃):320,喷雾电压(kV):2.1,S-lens RF水平:50。酶解后特征多肽报告肽的质谱子离子二级扫描图谱显示如图3所示,报告肽子离子的质荷比(m/z)分别是690.35、419.24和171.12。
(四)DNA-多肽探针的构建
利用上述筛选出的DNA探针和特征多肽,基于迈克尔加成反应构建DNA-多肽探针,具体步骤如下:
(1)根据筛选出的DNA探针序列为TTGATGATATTTTGCCATGCTT,将该DNA探针交付于强耀生物公司合成5’端含有二硫键修饰的DNA探针。
(2)二硫键修饰的DNA探针在接合前需要进行还原,我们以三(2-羧乙基)膦(以下简称:TCEP)为还原剂。
(3)用移液枪准确量取20μL的TCEP磁珠转移到EP管中,以10000rpm/min的速度,离心1min,弃去上清液;其中,20μL的TCEP磁珠悬浮液中含有8mM的TCEP。
(4)用移液枪吸取100μL PBS(含有500mM NaCl,pH7.0)洗涤珠子,然后在10000rpm/min的速度下再次离心1min,弃去上清液。
(5)用移液枪量取100μL 2μM二硫键修饰的DNA探针,加入到上述装有TCEP磁珠的EP管中,二硫键修饰的DNA探针与TCEP磁珠在37℃猛烈摇动孵育2h。
(6)待DNA探针上的二硫键被还原后,将样品在10000rpm/min条件下离心5min,用移液枪吸取上清液转移到新的EP管中,此时,上清液中含有二硫键被还原的DNA探针。
(7)将含有还原DNA探针的上清液加入等摩尔量的20μM马来酰亚胺修饰的特征多肽中,核酸和肽的最终浓度分别为1μM和10μM,偶联反应在37℃剧烈摇动下进行4h。
经上述步骤(1)~(7)制得DNA-多肽探针。
(五)DNA-多肽探针的验证
利用高效液相色谱(HPLC)对未偶联特征多肽的DNA探针、偶联特征多肽的DNA-多肽探针进行检测分析。
仪器:Dionex UltiMate 3000,检测时间:30min,检测波长:260nm,流速:1.0mL/min,进样体积:20μL,色谱柱:DELTA-PAK C4 300A 3.9mm×150mm,色谱柱内径为5μm;色谱柱温:25℃;流动相A:0.1%TFA+乙腈;流动相B:0.1%TFA水相。洗脱条件如表4所示。
表4 HPLC分析DNA探针和DNA-多肽探针的洗脱条件
Time/min | Buffer A | Buffer B |
0 | 5% | 95% |
20 | 95% | 5% |
30 | 100% | 0% |
HPLC分析结果显示,DNA探针在耦联特征多肽前在260nm处的出峰时间约4.4min,而DNA探针耦联特征多肽后在260nm处的出峰时间往后延迟到6.9min。
(六)LC-MS/MS对酶切前后的DNA-多肽探针的检测
(1)用移液枪准确吸取20μL 10μM的DNA-多肽探针于EP管中,加入1μL 1μg/μL的胰蛋白酶,然后加入29μL 100mM碳酸氢铵溶液,轻轻震荡混匀。
(2)将EP管转移静置于孵箱中,37℃过夜酶解。
(3)待酶解结束后,用移液枪准确量取0.5μL三氟乙酸,加入到上述溶液中轻轻混匀,终止酶解反应。
(4)酶解后报告肽样本的SPE除盐,步骤如下:
a.C18柱子的活化:用移液枪吸取750μL乙腈加入到SPE-C18柱中,使乙腈充分浸润柱子的固相填料,乙腈的流速尽量控制在1~2mL/min,也可让其自然滴落,弃去滤液,重复活化操作3次。
b.C18柱子的平衡:用移液枪吸取750μL 0.1%TFA加入到SPE-C18柱中,使0.1%TFA充分浸润柱子的固相填料,控制0.1%TFA的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,弃去滤液,重复操作3次。
注意:加载样本前柱子保持湿润状态,不要抽干平衡液。
c.样本的加载:用移液枪吸取样本转移到活化后的SPE-C18柱子中,控制样本的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,待样本完全滤过SPE-C18柱后,将滤过后的样本溶液再次转移到SPE-C18柱中,待样本完全滤过后弃去滤液。样本重复过柱两次可以确保SPE-C18柱子可以完全吸附样本,提高萃取效率。
d.SPE-C18柱的冲洗:用移液枪吸取750μL 5%甲醇溶液(含0.1%TFA)加入到SPE-C18柱中,使5%甲醇溶液(含0.1%TFA)充分浸润柱子的固相填料,控制5%甲醇溶液(含0.1%TFA)的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,弃去滤液,重复操作3次;最后抽干SPE-C18柱子固相填料里的缓冲液,尽量让SPE-C18柱的固相填料保持干燥的状态。
e.样本的洗脱:用移液枪吸取750μL乙腈加入到SPE-C18柱中,使乙腈充分浸润柱子的固相填料,控制乙腈的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,收集滤液。
(5)样本的浓缩:将上述收集的滤液转移到新的EP管中,然后将EP管放入真空旋转浓缩仪中将乙腈抽干,使样本变成粉末状态。
(6)样本的复溶:用移液枪吸取50μL 0.1%TFA加入到上述EP管中,轻轻用移液枪反复吹打混匀,使样本充分溶解。
(7)上样:在进样瓶瓶壁进行编号,用移液枪将复溶后的样本转移到进样瓶中,避免产生气泡,轻轻混匀,盖紧瓶盖,将进样瓶放入仪器样本盘中。
(8)程序的编辑:在质谱仪上对进样的程序进行设定,然后依次打开质谱控制模块和液相模块进行仪器的平衡,待仪器稳定后开始进样。
将DNA-多肽探针酶解前后的产物进行LC-MS/MS检测,LC-MS/MS结果如图4所示,DNA-多肽探针在酶解前未出现色谱峰,而酶解后的DNA-多肽产物则出现明显的色谱峰。以上结果表明,迈克尔加成反应成功地将DNA探针和特征多肽耦联构建了DNA-多肽探针。
二、DNA-多肽探针与待测核酸杂交、酶解制得用于LC-MS/MS检测的报告肽
(一)DNA-多肽探针与待测核酸杂交
1.DynabeadsTM磁珠的洗涤及预处理
(1)轻轻摇晃瓶子,将试剂瓶中的磁珠重新悬浮,如可采用可涡旋30秒或倾斜旋转5分钟的方式,使得磁珠重新悬浮。
(2)根据磁珠结合能力计算所需磁珠的量,具体用量参见表2,用移液枪吸取10μL磁珠转移到EP管中。
(3)加入100μL 1×洗涤缓冲液,用移液枪轻轻吹打,使磁珠重新悬浮。此操作重复3次。
(4)将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,弃上清。
(5)从磁力架中取出EP管,用移液枪吸取100μL溶液A(solution-A),加入到EP管中,轻轻吹打混匀,使磁珠重新悬浮。清洗两次,时间2分钟。
(6)将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,弃上清。
(7)从磁力架中取出EP管,用移液枪吸取100μL溶液B(solution-B),加入到EP管中,轻轻吹打混匀,使磁珠重新悬浮。清洗两次,时间2分钟。
(8)将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,弃上清。
(9)从磁力架中取出EP管,用移液枪吸取20μL1×洗涤缓冲液和1μL 10mg/mL BSA溶液加入到EP管中,轻轻吹打混匀,使磁珠重新悬浮。
(10)将EP管放置于摇床上,轻轻震荡摇晃,室温封闭2h。
(11)将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,弃上清。
(12)加入100μL 1×洗涤缓冲液,用移液枪轻轻吹打,使磁珠重新悬浮。此操作重复3次。
2.生物素化核酸和磁珠结合
(1)往洗涤和封闭后的磁珠中加入20μL 1×洗涤缓冲液,使其重新悬浮,磁珠的最终浓度为5μg/μL。
(2)加入10μL(2μM)生物素标记的RNA(20pmol),再加入10μL的DEPC水,NaCl浓度从2M降低到1M时,链霉亲和素和生物素结合效率最高。
(3)提前将RNA酶抑制剂(Thermo,AM 7006)静置于60度金属浴中活化10min,然后吸取1μL RNA酶抑制剂加入到上述EP管中。
(4)将EP管放入核酸杂交箱中旋转,37度下孵育30min(磁珠说明书上说只需要15-20分钟即可)。注:孵育时间取决于核酸长度,短寡核苷酸(30个碱基)最多需要10分钟;高达1kb(1000个碱基对)的DNA片段需要15分钟。
(5)将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,弃上清。
(6)加入100μL 1×洗涤缓冲液,用移液枪轻轻吹打,使磁珠重新悬浮。此操作重复3次。
3.DNA-多肽探针与生物素化LncRNA杂交
DNA-多肽探针与生物素化LncRNA的杂交体系如表5所示。具体杂交过程如下:
表5 DNA-多肽探针与生物素化LncRNA的杂交体系成分表
试剂名称 | 浓度 | 体积/μL |
链霉素亲和素磁珠 | 10μg/μL | 10 |
生物素化RNA | 2μM | 10 |
DNA-多肽探针 | 10μM | 2 |
BSA封闭液 | 10μg/μL | 1 |
(1)往上述EP管中加入18μL Hybridization buffer和2μL(10μM)DNA-多肽探针,用移液枪轻轻吹打,使磁珠重新悬浮。
(2)提前将RNA酶抑制剂(Thermo,AM 7006)静置于60度金属浴中活化10min,然后吸取1μL RNA酶抑制剂加入到上述EP管中。
(3)将EP管放入核酸杂交箱中旋转,55度下过夜孵育,约16h。
(4)将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,弃上清。
(5)加入100μL 1×洗涤缓冲液,用移液枪轻轻吹打,使磁珠重新悬浮。此操作重复3次。
(二)DNA-多肽探针的酶解、纯化
1.胰蛋白酶水解DNA-多肽探针的特征多肽
(1)往上述EP管中加入49μL 100mM碳酸氢铵溶液和1μL 0.1μg/μL的胰酶,用移液枪轻轻吹打,使磁珠重新悬浮。
(2)将EP管放入核酸杂交箱中旋转,37度下过夜孵育,约16h。
(3)待酶解结束后,将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,转移至新的EP管中。
(4)往装有磁珠的EP管中加入100μL 100mM的碳酸氢铵溶液轻轻洗涤磁珠,将EP管放在磁力架上静置1分钟,然后用移液枪轻轻吸取上清,转移至新的EP管中。该操作重复洗涤2次。
(5)往上述EP管中加入2.5μL的三氟乙酸终止胰酶的水解作用。
(6)用移液枪吸取2μL 100ng/mL的同位素内标报告肽溶液加入到上述EP管中,轻轻吹打混匀。
2.固相萃取(Solid phase extraction,SPE)进行样本除盐
(1)C18柱子的活化:用移液枪吸取750μL乙腈加入到SPE-C18柱中,使乙腈充分浸润柱子的固相填料,乙腈的流速尽量控制在1~2mL/min,也可让其自然滴落,弃去滤液,重复活化操作3次。
(2)C18柱子的平衡:用移液枪吸取750μL 0.1%TFA加入到SPE-C18柱中,使0.1%TFA充分浸润柱子的固相填料,控制0.1%TFA的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,弃去滤液,重复操作3次。
注意:加载样本前柱子保持湿润状态,不要抽干平衡液。
(3)样本的加载:用移液枪吸取样本转移到活化后的SPE-C18柱子中,控制样本的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,待样本完全滤过SPE-C18柱后,将滤过后的样本溶液再次转移到SPE-C18柱中,待样本完全滤过后弃去滤液。样本重复过柱两次可以确保SPE-C18柱子可以完全吸附样本,提高萃取效率。
(4)SPE-C18柱的冲洗:用移液枪吸取750μL 5%甲醇溶液(含0.1%TFA)加入到SPE-C18柱中,使5%甲醇溶液(含0.1%TFA)充分浸润柱子的固相填料,控制5%甲醇溶液(含0.1%TFA)的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,弃去滤液,重复操作3次;最后抽干SPE-C18柱子固相填料里的缓冲液,尽量让SPE-C18柱的固相填料保持干燥的状态。
(5)样本的洗脱:用移液枪吸取750μL乙腈加入到SPE-C18柱中,使乙腈充分浸润柱子的固相填料,控制乙腈的流速在1~2mL/min,也可让其自然滴落,收集滤液。
(6)样本的浓缩:将上述收集的滤液转移到新的EP管中,然后将EP管放入真空旋转浓缩仪中将乙腈抽干,使样本变成粉末状态。
(7)样本的复溶:用移液枪吸取50μL 0.1%TFA加入到上述EP管中,轻轻用移液枪反复吹打混匀,使样本充分溶解。
三、构建报告肽的LC-MS/MS检测方法
利用LC-MS/MS对复溶后的样本进行检测,具体检测方法如下:
1.上样:在进样瓶瓶壁进行编号,用移液枪将复溶后的样本转移到进样瓶中,避免产生气泡,轻轻混匀,盖紧瓶盖,将进样瓶放入仪器样本盘中。
2.程序的编辑:在质谱仪上对进样的程序进行设定,然后依次打开质谱控制模块和液相模块进行仪器的平衡,待仪器稳定后开始进样。
特征多肽报告肽的流动相以及流动相的洗脱条件:
检测时间:5min;
流速:0.3mL/min,进样体积:10μL;
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH,C18 2.1mm×100mm,1.7μm,色谱柱温:40℃;
流动相A:0.1%TFA水相;流动相B:0.1%TFA+乙腈。
表6特征多肽报告肽的洗脱梯度条件
Time/min | Buffer A | Buffer B |
0 | 95% | 5% |
1.0 | 95% | 5% |
2.5 | 10% | 90% |
3.4 | 10% | 90% |
3.5 | 95% | 5% |
5.0 | 95% | 5% |
表7特征多肽报告肽的质谱检测条件
3.按照上述表6和表7中色谱和质谱条件对DNA-特征多肽探针酶切后的报告肽进行检测,得到报告肽的摩尔浓度,然后利用如下公式计算得到待测核酸HULC的拷贝数,具体公式为:待测核酸HULC的拷贝数(copies/L)=3.78×1021×报告肽的摩尔浓度(mol/L);每组平行做2个样本,每个样本检测2次,每组实验一共得到4个检测结果。
待检测结束后,使用MassLynx V4.1软件对样本检测的色谱峰数据进行积分处理。杂交效率等结果均采用色谱峰的面积比(面积比=报告肽的峰面积/同位素内标肽段的峰面积)进行评价或比较。
本实施例通过生物素化的HULC靶序列与链霉亲和素磁珠结合后,加入DNA-多肽探针与RNA进行杂交,然后将特征多肽进行胰蛋白酶酶解得到报告肽,最后借助LC-MS/MS检测报告肽,报告肽的浓度高低可代表RNA的水平。利用上述LC-MS/MS检测条件,对报告肽的检测结果,如图5所示,LC-MS/MS可以同时检测到特征多肽以及同位素标记报告肽的离子响应。此外,LC-MS/MS对特征多肽不同离子对的响应不一样,m/z 487.3>419.3的响应比m/z487.3>690.3的响应高;但不管在高浓度还是低浓度情况下,m/z 487.3>690.3的的基线均比m/z 487.3>419.3平稳。从以上结果来看,我们成功构建了基于DNA-多肽探针的LC-MS/MS技术定量RNA的检测方法,且初步确定了m/z 487.3>419.3用作HULC的定性分析,而m/z487.3>690.3可用作HULC的定量分析。
综上所述,本发明基于HPLC-MS/MS构建的对HULC进行定量检测的色谱和质谱条件如下:
(1)色谱条件:特征肽段的流动相以及流动相的洗脱条件:
检测时间:5min;
流速:0.3mL/min,进样体积:10μL;
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH,C18 2.1mm×100mm,1.7μm,色谱柱温:40℃;
流动相A:0.1%TFA水相;流动相B:0.1%TFA+乙腈,流动相的梯度洗脱条件如表6所示。
(2)质谱条件如表7中Peptide-2所示条件对HULC进行定量检测。
实施例2基于构建的核酸质谱定量方法在肝细胞中HULC拷贝数检测中的应用
本实施例以五种不同的肝细胞为待测样品,对其中HULC拷贝数进行检测。所用的五种肝细胞依次为正常肝细胞L02、正常肝细胞7702、肝癌细胞SK-Hep1、肝癌细胞HepG2、肝癌细胞7721。
参照实施例1中DNA-多肽探针的构建方法、DNA-多肽探针与待测核酸杂交、酶解制得特征多肽报告肽以及基于实施例1构建的特征多肽报告肽的LC-MS/MS检测方法,对上述五种肝细胞中的HULC拷贝数进行检测。
其中,对上述五种肝细胞中总RNA的提取过程如下:
1.1将细胞培养瓶中的细胞依次进行清洗、消化和离心。
1.2向离心管中加入1~2mL的PBS溶液将离心后的细胞沉淀清洗悬浮,100g/min离心3分钟,重复操作3次。
1.3向离心后的细胞沉淀中加入1mL的Trizol溶液,用移液枪反复吹打,充分裂解细胞,然后将含Trizol的细胞溶液静置于室温5min。
1.4将离心管放置于冰盒上,往离心管中加入200μL的三氯甲烷,上下颠倒,充分混匀,然后放置于冰上静置15min。
1.5静置结束后,将离心管转移到预冷后的高速低温离心机中,在4度条件下,12,000rpm/min转速离心15分钟。
1.6离心后,轻轻取出离心管可见离心管中溶液分成三层,用200μL的移液枪小心吸取离心后的上层清液,将其转移至新的离心管中。
1.7往装有上层清液的离心管中加入等体积预冷的异丙醇溶液,盖紧管盖后轻轻上下摇晃,使管内溶液颠倒混匀。然后将其放入-20度冰箱水平静置20min。
1.8将离心管转移至4度预冷的离心机中,14,000rpm/min转速下离心10min。然后用移液枪吸取上清弃去,将离心管倒扣在无菌滤纸上尽量吸干管内的溶液,此时可看见离心管底部出现白色沉淀,即为RNA。
1.9向离心管中加入1mL预冷的100%无水乙醇洗涤RNA沉淀2次,盖紧管盖后轻轻上下摇晃,颠倒混匀,使管底白色沉淀呈漂浮状态即可。
1.10将离心管转移至4度预冷的离心机中,14,000rpm/min转速下离心5min,然后用移液枪吸取上清弃去,将离心管倒扣在无菌滤纸上吸干管内的溶液,静置2~3min,待溶液充分挥发晾干。
1.11向晾干后的离心管中加入30~80μL的DEPC水,用移液枪轻轻吹打混匀使RNA充分溶解。溶解后的RNA可立即进行后续实验,若想长期保存,可将RNA溶液放置于-80度冰箱。
2.参照实施例1中RNA的生物素化的方法,对上述五种肝细胞RNA进行生物素链接反应,生物素化反应体系如表8所示,具体过程如下:
(1)将表8中除30%PEG和DMSO外的所有试剂在冰上解冻,在室温下解冻DMSO,并在37℃下将30%的PEG加热5-10分钟使其融解。
(2)将金属浴调整到85℃,把RNA样本放置于在85℃加热3-5分钟,然后立即将RNA放置于冰上。
注:RNA需要加热以松弛二级结构。此外,在25%DMSO存在的情况下加热RNA可以提高松弛RNA二级结构的效率。
(3)按表8中列出的顺序向无核酸酶的离心管加入以下试剂,准备用于RNA的生物素标记反应体系。
注:30%PEG是最后添加的试剂。小心地将30%的PEG移入反应混合物中。
表8.RNA生物素化反应体系
(4)将以上反应体系放置于恒温震荡仪中,温度设置为16℃,孵育过夜以提高效率。
(5)待反应结束,向反应体系中加入70μL的DEPC水,用移液器轻轻吹打混匀。
(6)用移液器往每个反应体系中加入100μL氯仿:异戊醇(24:1)以提取RNA连接酶,将离心管轻轻涡旋混匀。
(7)将混匀后的溶液在微型离心机中高速离心,离心条件:12000g,3min;离心后分离上层水相和下层有机相;用移液器小心地吸取顶部(水)相并转移到新的无核酸酶的EP管中。
(8)往上述离心管中依次加入10μL的5M NaCl,1μL的glycogen和300μL的预冷100%乙醇,轻轻吹打混匀,然后将离心管放置于在-20℃条件下静置1小时。
(9)将离心管进行离心,离心条件:13,000×g,4℃,时间为15分钟,然后用移液器小心吸取上清液,注意不要吸取下层沉淀颗粒。
(10)用300μL预冷的70%乙醇轻轻洗涤沉淀颗粒。然后小心弃去乙醇,将离心管室温下静置5分钟,风干沉淀颗粒。
(11)用移液器吸取20μL的DEPC水重新悬浮沉淀颗粒,轻轻混匀,使沉淀完全溶解。
随后上述生物素化RNA与链霉亲和素磁珠结合、DNA-多肽探针与生物素化LncRNA杂交、胰蛋白酶水解DNA-多肽探针的特征多肽、固相萃取(Solid phase extraction,SPE)进行样本除盐和样本的LC-MS/MS检测的具体操作步骤详见实施例1“DNA-多肽探针与待测核酸杂交、酶解制得用于LC-MS/MS检测的报告肽”中记载的方法,对上述五种肝细胞中HULC的拷贝数进行检测,检测结果如表9和图6A所示。
此外,本实施例以现有常规的RT-qPCR检测方法对上述五种肝细胞中HULC的拷贝数进行检测,检测结果如图6B所示。
结果显示肝癌细胞中HULC的表达水平均比正常肝细胞高,且该结果与RT-qPCR检测的HULC变化趋势相一致。此外,现有研究发现肝癌细胞中HULC的表达水平均比正常肝细胞高,本发明构建的基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法对肝癌细胞中的HULC的检测结果与现有研究结果相一致([1]Zhou H,Xu Q,Ni C,et al.Prospects of NoncodingRNAs in Hepatocellular Carcinoma[J].BioMed Research International,2018,2018:1-9.;[2]Lim L J,Wong S Y S,Huang F,et al.Roles and Regulation of LongNoncoding RNAs in Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Research,2019,79(20):5131-5139.;[3]Hammerle M,Gutschner T,Uckelmann H,et al.Posttranscriptionaldestabilization of the liver-specific long noncoding RNA HULC by the IGF2mRNA-binding protein 1(IGF2BP1)[J].Hepatology,2013,58(5):1703-1712.)。
上述试验结果进一步证明了本发明构建的基于DNA-多肽探针技术定量核酸的质谱方法是可靠的,与现有核酸检测方法以及研究报告的结果相一致。且由于质谱定量的精度高、色谱检测的速度快,使得本发明构建的定量核酸的质谱方法具有检测速度快、精度高的优点。
表9.LC-MS/MS检测不同细胞中HULC的定量结果(n=4,M(P25~P75)
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种非诊断目的的基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)以待测核酸的核苷酸序列为基础,设计DNA探针;筛选出特征多肽,并与所述DNA探针构建DNA-多肽探针;所述DNA-多肽探针中DNA探针的核苷酸序列从5’端到3’端的序列为TTGATGATATTTTGCCATGCTT;
(2)将由步骤(1)构建的DNA-多肽探针与待测核酸杂交;
(3)将杂交后的DNA-多肽探针进行蛋白酶酶解,将DNA-多肽探针中的特征多肽水解为报告肽;
(4)构建报告肽的LC-MS/MS检测方法;
(5)利用LC-MS/MS检测方法对报告肽的浓度进行检测;
(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数,实现对待测核酸的定量检测;
所述步骤(1)中DNA-多肽探针的具体构建过程如下:
A.将设计的DNA探针合成为5’端含有二硫键修饰的DNA探针;
B.将二硫键修饰的DNA探针中的二硫键进行还原;
C.将二硫键还原后的DNA探针与等量的马来酰亚胺修饰的特征多肽偶联反应,制得DNA-多肽探针;
所述DNA-多肽探针中的特征多肽的氨基酸序列为GDKAVLGVDPFR;所述报告肽的氨基酸序列为AVLGVDPFR;
所述步骤(6)由报告肽的浓度换算为待测核酸的拷贝数的具体换算关系为:待测核酸的拷贝数copies/L=3.78×1021×x mol/L,其中,x mol/L表示经LC-MS/MS检测得到的报告肽的摩尔浓度。
2.根据权利要求1所述基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法,其特征在于,所述步骤(2)中DNA-多肽探针与待测核酸的杂交过程如下:
I.将生物素标记的待测核酸与链霉亲和素磁珠重悬孵育形成生物素化待测核酸;
II.将生物素化待测核酸与DNA-多肽探针按照摩尔比1:1混合,进行杂交孵育制得含有待测核酸的DNA-多肽探针。
3.根据权利要求2所述基于DNA-多肽探针技术定量HULC的质谱方法,其特征在于,所述LC-MS/MS检测报告肽的质谱参数如下:一级质谱m/z为487.3;二级质谱m/z为690.3。
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