CN110441527B - β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

β‑内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用，该纳米探针是以两亲性生物素‑聚乙二醇‑内酰胺‑十八胺为载体材料制备的纳米粒和包载于该聚合物纳米粒中的报告多肽构成。通过生物素与链霉亲和素琼脂糖珠反应，将纳米探针固定在琼脂糖珠上。当存在β‑内酰胺酶时，纳米探针解体释放出多肽，然后通过液相质谱联用检测报告多肽，即可检测样品中β‑内酰胺酶的量，从而检测耐药菌。该纳米探针具有制备简单、灵敏度、准确和精密度高，且可显著放大β‑内酰胺酶的信号等优点。

Description

β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

自1928年青霉素发现以来的近一百年的时间里，抗生素被广泛用于治疗各种感染性疾病，拯救了数以千万计的生命。然而，由于普遍存在的抗生素不合理使用导致耐药菌甚至“超级细菌”的产生，严重威胁着大众生命健康，特别是儿童。儿童的生理系统和器官尚未发育完全，对药物有着特殊的敏感性及反应性，在使用抗生素过程中比成年人具有更大的复杂性和风险性，这就使得儿童成为了抗生素使用中的最大受害者。如何才能避免抗生素的不合理使用，关键依靠的是快速精准检测。然而目前临床上检测耐药菌的药敏实验通常耗时1-2天，这不利于快速控制病情。另一方面，耐药菌在患者病菌菌株占比极低(约0.7％)，普通的方法通常很难检测到，因此需要对样品中细菌进行扩增，这常常会造成假阳性。因此，开发一种能快速、灵敏检测患者所感染病菌中有无耐药菌，对临床用药至关重要。此外，研究表明细菌产生耐药性的主要机制是高表达β-内酰胺酶(BLA)，因此，通过定量代谢物中BLA的量可以检测出是否含药耐药菌。基于此，申请人通过联合纳米技术、蛋白质组学方法以及质谱技术，拟开发一种无创、快速、准确定量儿童感染患者代谢产物(尿液、粪便、唾液、血液等)中耐药菌的方法：BLA响应纳米探针-蛋白质组学方法。该方法可以将样品中BLA的信号扩增几百倍，并将BLA的信号转化为报告分子的信号，从而具有高选择性和特异性。

发明内容

解决的技术问题：本发明鉴于目前临床耐药菌株检测所存在的缺陷，提供一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用，以达到快速、无创以及精准检测耐药菌的目的。

技术方案：一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针的制备方法，制备步骤为：按比例，将5mg两亲性聚合物生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺(Biotin-PEG-LA-C18)和1mg报告多肽共同溶入2mL二甲基亚砜中，然后将所得混合溶液逐滴加入到10mL水溶液中，搅拌，透析除去二甲基亚砜，过220μm膜即得到纳米探针。

上述报告多肽的序列为：AVLGVDPFR、AVVGVDPFR、AVLKGDF和GVDGFG。

优选的，上述Biotin-PEG-LA-C18重均分子量2000-3000。

优选的，上述Biotin-PEG-LA-C18和报告多肽质量比为5:1。

上述Biotin-PEG-LA-C18的制备方法为：将生物素-聚乙二醇与β-内酰胺共价结合得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)，然后在与硬脂胺共价结合得到最终两亲性聚合物。

Biotin-PEG-LA-C18的具体制备步骤为：取1.0mg重均分子量为2000Da的生物素-聚乙二醇、0.2mgβ-内酰胺、0.1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.15mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL甲酰胺中，30℃，500rpm搅拌反应24小时；然后将反应液转移到截留分子量：1000Da的透析袋中，用去离子水透析24小时，然后冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)；称取0.5mg生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)、0.1mg硬脂胺、0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL二甲基亚砜中，30℃，500rpm搅拌反应24小时，然后将反应液转移到截留分子量：1000Da的透析袋中，用二甲基亚砜透析12小时，然后用去离子水透析24小时，冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺。

上述制备方法制得的β-内酰胺酶敏感型纳米探针。

上述β-内酰胺酶敏感型纳米探针的固定方法，通过生物素与链霉亲和素反应将纳米探针固定在琼脂糖磁珠上，包括以下步骤：将磁珠和β-内酰胺酶敏感型纳米探针按体积比2:1在pH 7.4磷酸缓冲液中孵育2小时，并每隔0.5小时搅拌一次，充分混匀磁珠和纳米探针，2小时后洗涤除去未固定的纳米探针。

β-内酰胺酶敏感型纳米探针在制备检测尿液中β-内酰胺酶试剂盒中的应用。

对本发明制备的β-内酰胺酶敏感型纳米探针进行评价：

对本发明制备的β-内酰胺酶敏感型纳米探针进行了粒径表征、酶敏感报告多肽释放研究，结果表明，纳米探针粒径为85nm，与1nM、5nM、10nMβ-内酰胺酶孵育6小时后，分别有5％、25％和50％的报告多肽释放，表明酶敏感性良好，达到预期目的。

本发明通过使用纳米探针和靶向蛋白质组学中特征多肽的思想可以很好的保留下来。β-内酰胺酶敏感型纳米探针固定在链霉亲和素琼脂糖珠上。当样品中存在β-内酰胺酶时，β-内酰胺酶会作用于载体材料生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺上的β-内酰胺，使两亲性载体材料断裂，从而最终使纳米探针崩解，释放出包载在纳米探针中的报告多肽。由于包载在纳米粒中的报告多肽具有较高的含量，因此该过程可以实现显著的信号放大。最后，离心除去未解离的纳米探针，然后利用液相质谱串联技术(LC-MS/MS)对上清液中报告多肽进行定量检测。通过这个方法，样品中β-内酰胺酶的信号可以被转换成报告多肽的水平。而β-内酰胺酶的水平又可以代表耐药菌的水平，最终，报告多肽的水平可以凸显出耐药菌的水平。从而实现对样品中耐药菌的检测。

有益效果：1)本发明所述的纳米探针载体材料可化学合成，稳定性好；2)本发明所述纳米探针具有较高的报告多肽载量，可以实现信号放大；3)本发明所述纳米探针制备方法简单易行，重复性高，耗时短，可直接用于代谢产物中β-内酰胺酶的检测；4)本发明所述纳米探针可固定在链霉亲和素琼脂糖珠上，未反应的纳米探针易于除去，检测本底低，灵敏度高。

附图说明

图1为本发明中β-内酰胺酶敏感性纳米探针的制备及其联合液相串联质谱检测β-内酰胺酶新方法的流程示意图；

图2为本发明所筛选出的多肽的响应。1-10各肽段的序列分别为：AKKLGGPF、AGKGKVA、AGVDPFR、AVGKDPFR、AVLKKDF、GDDGFG、LGVDPFR、AVVGVDPFR、AVLKGDF和GVDGFG；

图3为本发明中报告多肽AVLGVDPFR的图谱，其中A为子离子图,B为LC-MS/MS色谱图，以及相应同位素标记的内标的色谱图；

图4为本发明的β-内酰胺酶敏感性纳米探针的表征，其中(A)为粒径图，(B)为透射电镜图；

图5为本发明β-内酰胺酶敏感性纳米探针在不同浓度β-内酰胺酶条件下报告肽段的释放情况；

图6为本发明中10例儿童尿液中检测到β-内酰胺酶水平图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1β-内酰胺酶敏感性纳米探针的制备和表征

(1)生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺的制备

1.0mg生物素-聚乙二醇(重均分子量为2000Da)、0.2mg的β-内酰胺、0.1mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.15mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL甲酰胺中，30℃，500rpm搅拌反应24小时。然后将反应液转移到透析袋中(截留分子量：1000Da)，用去离子水透析24小时。然后冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)。称取0.5mg生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)、0.1mg硬脂胺、0.2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL二甲基亚砜中，30℃，500rpm搅拌反应24小时。然后将反应液转移到透析袋中(截留分子量：1000Da)，用二甲基亚砜透析12小时，然后用去离子水透析24小时。冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺。

(2)β-内酰胺酶敏感性纳米探针的制备和纯化

首先筛选报告多肽。我们根据经验和计算机软件EPR设计了10条肽段，并用质谱检测了它们各自的响应，结果如图2所示。结果显示，AVLGVDPFR、AVVGVDPFR、AVLKGDF和GVDGFG均有较高的响应，超过0.7。随后，制备纳米探针。称取5mg生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺和1mg报告多肽，然后将其共同溶入2mL二甲基亚砜中。混合溶液超声(20MHz)溶解半小时后，在剧烈搅拌条件下，将混合溶液逐滴滴入到10mL去离子水中。继续搅拌2h后，将纳米粒溶液转移到透析袋(截留分子量：1000Da)中，用去离子水在4℃条件下透析6小时以除去二甲基亚砜，然后冻干得到最终纳米探针。

(3)β-内酰胺酶敏感性纳米探针的表征

采用粒径分析仪测定纳米探针的粒径及Zeta电位，并利用透射电镜观察所制得的纳米探针的形貌。如图4所示，纳米探针形态圆整，平均粒径80nm，表面Zeta电位-15mV。

实施例2β-内酰胺酶敏感性纳米探针对β-内酰胺酶的敏感性实验

将1mg实施例1制得的纳米探针冻干粉溶入1mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，然后加入400μL链霉亲和素琼脂糖珠，在室温下孵育2小时，使纳米探针充分固定到磁珠表面，然后2000rpm离心5分钟，弃上清除去未固定的探针，然后加入1mL磷酸缓冲液(pH 7.4)，用枪吹打均匀后，再次离心弃上清。此步骤重复3次，以除去没有固定好的纳米探针。然后，将不同浓度的β-内酰胺酶溶液加入到固定好的探针溶液中，37℃孵育6h，离心，收集上清液，并利用液相质谱联用检测上清液中报告肽段的量。结果如图5所示，孵育6小时后，当不存在β-内酰胺酶时，没有报告肽段释放；当加入1nMβ-内酰胺酶时，有5％的报告肽段释放；当加入5nM的β-内酰胺酶时，有25％的报告肽段释放；当加入10nM的β-内酰胺酶时，有50％的报告肽段释放。

实施例3使用β-内酰胺酶敏感型纳米探针联合LC-MS/MS定量检测尿液中β-内酰胺酶的水平

对尿液样品进行预处理。首先，1000rpm离心取上清，去除尿液中哺乳动物细胞和其他杂质；随后，向上清液中加入RIPA裂解液，裂解细菌；最后，4℃5000rpm离心10分钟，取上清，得到β-内酰胺酶样品溶液。然后用实施例2中方法，将β-内酰胺酶样品溶液加入到固定好的探针中，最后，利用LC-MS/MS检测报告肽段释放量。结果如图6所示，10例样品中β-内酰胺酶的含量不同。其中，样品1和2为正常儿童尿液，样品3-10为感染患儿尿液样品。从中可以看出，样品6和样品8中β-内酰胺酶的浓度显著高于其他组，表明有耐药菌存在。传统药敏实验检测耐药菌需耗时48小时以上，不利于重症患者的治疗，而本发明的方法检测耐药菌耗时在12小时以内，这比目前所报到的方法都极大的缩短了检测时间。此外，本发明由于应用了纳米技术对信号进行扩增，每个纳米探针中包载了50个报告多肽，也就是至少可以信号放大50倍，这显著提高了检测灵敏度。

以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京医科大学

东南大学

<120> β-内酰胺酶敏感型纳米探针及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Lys Lys Leu Gly Gly Pro Phe

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Gly Lys Gly Lys Val Ala

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Gly Val Asp Pro Phe Arg

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Val Gly Lys Asp Pro Phe Arg

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Val Leu Lys Lys Asp Phe

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Asp Asp Gly Phe Gly

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Gly Val Asp Pro Phe Arg

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Val Val Gly Val Asp Pro Phe Arg

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Val Leu Lys Gly Asp Phe

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Val Asp Gly Phe Gly

1 5

Claims (7)

1.一种β-内酰胺酶敏感型纳米探针的制备方法，其特征在于制备步骤为：按比例，将5mg两亲性聚合物生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺，即Biotin-PEG-LA-C18，和1mg报告多肽共同溶入2mL二甲基亚砜中，所述报告多肽的序列为：AVLGVDPFR、AVVGVDPFR、AVLKGDF和GVDGFG，然后将所得混合溶液逐滴加入到10mL水溶液中，搅拌，透析除去二甲基亚砜，过220μm膜即得到纳米探针；所述Biotin-PEG-LA-C18的制备方法为：将生物素-聚乙二醇与β-内酰胺共价结合得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)，然后在与硬脂胺共价结合得到最终两亲性聚合物。

2.根据权利要求1所述β-内酰胺酶敏感型纳米探针的制备方法，其特征在于所述Biotin-PEG-LA-C18重均分子量2000-3000。

3.根据权利要求1所述β-内酰胺酶敏感型纳米探针的制备方法，其特征在于所述Biotin-PEG-LA-C18和报告多肽质量比为5:1。

4.根据权利要求1所述β-内酰胺酶敏感型纳米探针的制备方法，其特征在于制备步骤为：取1.0mg重均分子量为2000Da的生物素-聚乙二醇、0.2mgβ-内酰胺、0.1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL甲酰胺中，30℃，500rpm搅拌反应24小时；然后将反应液转移到截留分子量：1000Da的透析袋中，用去离子水透析24小时，然后冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)；称取0.5mg生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)、0.1mg硬脂胺、0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺共同溶入50mL二甲基亚砜中，30℃，500rpm搅拌反应24小时，然后将反应液转移到截留分子量：1000Da的透析袋中，用二甲基亚砜透析12小时，然后用去离子水透析24小时，冻干得到生物素-聚乙二醇-(β-内酰胺)-硬脂胺。

5.权利要求1-4任一所述制备方法制得的β-内酰胺酶敏感型纳米探针。

6.权利要求5所述β-内酰胺酶敏感型纳米探针的固定方法，其特征在于通过生物素与链霉亲和素反应将纳米探针固定在琼脂糖磁珠上，包括以下步骤：将磁珠和β-内酰胺酶敏感型纳米探针按体积比2:1在pH 7.4磷酸缓冲液中孵育2小时，并每隔0.5小时搅拌一次，充分混匀磁珠和纳米探针，2小时后洗涤除去未固定的纳米探针。

7.权利要求5所述β-内酰胺酶敏感型纳米探针在制备检测尿液中β-内酰胺酶试剂盒中的应用。

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