CN115165859A - 一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其应用 - Google Patents

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CN115165859A CN202210719556.0A CN202210719556A CN115165859A CN 115165859 A CN115165859 A CN 115165859A CN 202210719556 A CN202210719556 A CN 202210719556A CN 115165859 A CN115165859 A CN 115165859A
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Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其应用。该即时诊断纳米探针通过多肽将蛋白载体和纳米模拟酶相连，构建得到的即时诊断纳米探针的粒径大于5.5nm，在正常无排斥状态下，即时诊断纳米探针无法通过肾脏滤过进入尿液；当发生排斥后，颗粒酶切断即时诊断纳米探针的多肽，导致纳米模拟酶与蛋白载体分离，纳米模拟酶经过肾脏滤过进入尿液；基于纳米模拟酶的过氧化氢酶活性，催化过氧化氢产生羟基自由基，进一步氧化四甲基联苯胺产生蓝色产物，通过比色法即可判别是否产生器官移植排斥反应，从而实现器官移植排斥反应的即时、无损检测。

Description

一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其应用。
背景技术
器官移植被认为是治疗终末期器官衰竭最成功的方法。然而，急性细胞排斥反应(ACR)，也被称为急性T细胞介导的排斥反应(TCMR)，已经严重阻碍了移植物的短期功能和长期存活。随着供受体配型技术的发展以及新型免疫抑制剂的临床应用，早期急性排斥发生率明显下降，移植器官短期存活率显著提高。器官移植后，患者需要终身服用免疫抑制剂(如环孢霉素A和FK 506等)用于对抗T细胞针对移植物的排斥反应。但此类药物的治疗窗很窄，如果用量不足，就不能有效防止珍贵的移植器官排斥失功，若剂量过大，则会导致患者自身免疫力显著下降，伴随严重的感染和肿瘤的并发症，从而威胁到患者的生命。所以器官移植后及时、准确、特异的监测对移植器官免疫排斥反应的早期发现及调整患者的免疫抑制剂用量具有极其重要的作用。临床工作中，医生往往借助于患者的临床表现和相关实验室指标来判定患者是否发生器官排斥反应。但这些非特异性指标无法与器官排斥反应建立紧密的联系，往往移植器官在悄无声息中进展到失功状态，难以通过临床手段挽救失功器官。移植器官穿刺活检是目前临床上唯一的权威诊断器官排斥反应的方法。但这种方法的最大缺点是其对移植器官的创伤性，有可能造成器官出血、血肿、动静脉痿等并发症，危害移植器官的存活。同时，手术的实施必须经过麻醉、无菌消毒、术前术后护理等一系列过程，费用昂贵。正因其创伤性、过程复杂和昂贵，不可能在所有级别的医院用来作为常规、即时的确诊手段。此外穿刺活检的另一个严重的缺陷是，活检所取的组织大小是器官的十几万分之一，仅仅是整个移植器官的极小部分，其情况未必能反映出其它部位是否有病变而造成误诊。所以目前临床上急需建立一种快捷、灵敏、特异和无创的即时诊断方法对器官移植后免疫排斥反应进行有效的监测。这对于早期发现和治疗排斥反应以及指导临床医生合理调整免疫抑制剂用量、适时减少或停药(将大大减轻病人的经济负担)，提高病人生存质量，降低移植患者的死亡率，延长移植器官的存活时间均具有重要意义，将有力推动器官移植事业的发展。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针。
本发明的第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的即时诊断纳米探针的制备方法。
本发明的第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的即时诊断纳米探针的应用。
本发明的第四方面的目的，在于提供一种产品。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针，包含：蛋白载体、多肽和纳米模拟酶；
所述多肽包含颗粒酶的酶切位点，能被器官移植排斥反应过程中释放的颗粒酶切割；
所述蛋白载体与所述多肽连接；
所述多肽与所述纳米模拟酶连接；
所述纳米模拟酶具有过氧化物酶活性；
所述即时诊断纳米探针的粒径大于5.5nm。
本发明的即时诊断纳米探针在正常无排斥状态下，无法通过肾脏滤过进入尿液；当发生排斥后，颗粒酶切断即时诊断纳米探针的多肽，导致纳米模拟酶与蛋白载体分离，纳米模拟酶经过肾脏滤过进入尿液；基于纳米模拟酶的过氧化氢酶活性，催化过氧化氢产生羟基自由基，进一步氧化四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色产物，通过比色法即可判别是否产生器官移植排斥反应。
优选地，所述蛋白载体与所述多肽的摩尔比为1:(1～10)，例如：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10；进一步为1:(4～10)；更进一步为1:4。
优选地，所述即时诊断纳米探针的粒径为6～100nm；进一步为10～100nm，例如：10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm；更进一步为约11nm。
本文中，“约”在用于修饰数值时表示计算或测量值允许该数值包含准确数值的一些近似值，或合理接近的数值；本文中“约”至少表示由测量或使用此类参数的常用方法可产生的变异数值；应当理解“约”的存在或不存在不影响其数值的解释；优选地，表示其后的数值加或减10％范围内的所有数值。
优选地，所述颗粒酶包含颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶H、颗粒酶K、颗粒酶M中的至少一种；进一步为颗粒酶B。
优选地，所述蛋白载体与所述多肽通过共价键或非共价键连接。
优选地，所述共价键包含硫醚键、酰胺键中的至少一种。
优选地，所述非共价键包含氢键、疏水相互作用力、静电相互作用、π-π相互作用力。中的至少一种；进一步优选地，所述非共价键包含氢键。
优选地，所述蛋白载体与所述多肽通过氢键连接。
优选地，所述蛋白载体为生物体来源或人工合成的蛋白。
优选地，所述蛋白载体包含中性链霉亲和素、链霉亲和素、亲和素、白蛋白、精蛋白、转铁蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白中的至少一种，进一步优选地，所述蛋白载体包含中性链霉亲和素。
优选地，所述多肽的N端或C端连接有生物素；进一步优选地，所述多肽的N端连接有生物素。
优选地，所述蛋白载体与所述多肽的生物素通过氢键连接。
优选地，所述多肽与所述纳米模拟酶通过共价键连接。
优选地，所述共价键包含金硫键、酰胺键、硫硫键、缩硫酮、酯键中的至少一种；进一步为金硫键。
优选地，所述纳米模拟酶为金属纳米团簇；进一步为金纳米团簇、银纳米团簇、铜纳米团簇、铂纳米团簇、铂-铁双金属纳米团簇、钴团簇、金-银双金属纳米团簇中的至少一种；更进一步为金纳米团簇。
优选地，所述多肽的氨基酸序列包含如下中的至少一种：SGSRSGIEFDKGGSGGC(SEQID NO.1)、SGSRSGIEPDKGGSGGC(SEQ ID NO.2)、SGSGSGIEFDKGGSGGC(SEQ ID NO.3)、SGSGSGIEPDKGGSGGC(SEQ ID NO.4)、SGSGIEFDRGGSGGC(SEQ ID NO.5)、SGSGIEPDRGGSGGC(SEQ ID NO.6)、SGIEFDRGGSGGC(SEQ ID NO.7)、SGIEPDRGGSGGC(SEQ ID NO.8)、IEFDRGGSGGC(SEQ ID NO.9)、IEPDRGGSGGC(SEQ ID NO.10)、IEFDSGGC(SEQ ID NO.11)、IEPDSGGC(SEQ ID NO.12)；进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列包含：SGSRSGIEFDKGGSGGC(SEQ ID NO.1)。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的即时诊断纳米探针的制备方法，包含如下步骤：1)采用多肽合成多肽-纳米模拟酶；2)将多肽-纳米模拟酶与蛋白载体混合，得到即时诊断纳米探针。
优选地，所述多肽的合成方法、多肽-纳米模拟酶的合成方法均为本领域常规的方法。
优选地，所述多肽的合成方法如下：采用固相合成法从C端到N端合成多肽，然后用生物素封端。
优选地，所述纳米模拟酶为金纳米团簇，蛋白载体为中性链霉亲和素时，所述即时诊断纳米探针的制备方法包括如下步骤：
1)合成多肽-金纳米团簇：将多肽、谷胱甘肽、含Au3+的盐混合，反应，得到多肽-金纳米团簇；
2)合成即时诊断纳米探针：将多肽-金纳米团簇与中性链霉亲和素混合，反应，得到即时诊断纳米探针。
优选地，步骤1)中将多肽、谷胱甘肽、含Au3+的盐混合的步骤如下：将多肽、谷胱甘肽和水混合，得到C液；将含Au3+的盐和水混合，然后加入C液。
优选地，所述含Au3+的盐为氯金酸。
优选地，步骤1)中所述多肽与谷胱甘肽的摩尔比为1:(5～25)；进一步为1:(5～9)。
优选地，步骤1)中所述多肽与含Au3+的盐的摩尔比为1:(15～25)。
优选地，步骤1)中所述反应的条件为60～80℃下搅拌18～30h。
优选地，步骤2)中所述多肽-金纳米团簇与中性链霉亲和素的摩尔比为(1～10)：1。
优选地，步骤1)中所述反应的条件为在PBS中搅拌8～16h。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的即时诊断纳米探针在制备产品中的应用。
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒中的至少一种。
优选地，所述产品具有如下功能：
器官移植排斥反应检测；和/或
评估免疫抑制剂治疗器官移植排斥的效果。
本发明的第四个方面，提供一种产品，包含本发明第一个方面的即时诊断纳米探针。
优选地，所述产品还包含：过氧化物和四甲基联苯胺(TMB)中的至少一种。
优选地，所述过氧化物包含金属过氧化物、过氧化氢、过氧酸盐和有机过氧化物中的至少一种；进一步优选地，所述过氧化物包含过氧化氢。
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒中的至少一种。
优选地，所述产品具有如下功能：
器官移植排斥反应检测；和/或
评估免疫抑制剂治疗器官移植排斥的效果。
本发明的第五个方面，提供一种检测系统，包含：本发明第一个方面的即时诊断纳米探针和/或本发明第四个方面的产品；和
分光光度计。
优选地，所述检测系统具有如下功能：
器官移植排斥反应检测；和/或
评估免疫抑制剂治疗器官移植排斥的效果。
本发明的第六个方面，提供一种方法，包含：采用(1)～(3)中至少一种的步骤；
(1)本发明第一个方面的即时诊断纳米探针；
(2)本发明第四个方面的产品；
(3)本发明第五个方面的检测系统；
所述方法用于：
器官移植排斥反应检测；和/或
评估免疫抑制剂治疗器官移植排斥的效果。
优选地，所述方法包括如下步骤：将(4)～(6)中至少一种导入患者体内，收集患者尿液，将尿液与过氧化物、TMB混合，检测；
(4)本发明第一个方面的即时诊断纳米探针；
(5)本发明第四个方面的产品中的即时诊断纳米探针；
(6)本发明第五个方面的检测系统中的即时诊断纳米探针。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针，包含：蛋白载体、多肽和纳米模拟酶；所述多肽包含颗粒酶的酶切位点，能被器官移植排斥反应过程中释放的颗粒酶切割；所述蛋白载体与所述多肽连接；所述多肽与所述纳米模拟酶连接；所述纳米模拟酶具有过氧化物酶活性；该即时诊断纳米探针通过多肽将蛋白载体和纳米模拟酶相连，构建得到的即时诊断纳米探针的粒径大于5.5nm(肾小球滤过尺寸)，在正常无排斥状态下，即时诊断纳米探针无法通过肾脏滤过进入尿液；当发生排斥后，颗粒酶切断即时诊断纳米探针的多肽，导致纳米模拟酶与蛋白载体分离，纳米模拟酶经过肾脏滤过进入尿液；基于纳米模拟酶的过氧化氢酶活性，催化过氧化氢产生羟基自由基，进一步氧化四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色产物，通过比色法即可判别是否产生器官移植排斥反应，从而实现器官移植排斥反应的即时、无损检测，克服了用于诊断器官移植排斥的金标准需要侵入性活检的问题，本发明提供的基于即时诊断纳米探针的非侵入性检测方法将能够多次的用于监测以及实现对T细胞介导的移植物排斥反应的早诊，对于确保移植物存活和及时采取应急措施至关重要。并且本发明提供的即时诊断纳米探针不依赖昂贵的大型仪器，与过氧化氢及TMB混合包装可以制成试剂盒，适合推广使用。
附图说明
图1是用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针的结构示意图。
图2是实施例1中制备的多肽的MALDI-TOF谱图。
图3是实施例1中制备的多肽-金纳米团簇的透射电镜图，比例尺为5nm。
图4是实施例1中制备的即时诊断纳米探针的动态光散射图。
图5是实施例1、2步骤(3)得到的即时诊断纳米探针(纳米探针)经颗粒酶B处理前后的粒径变化图(其中，1：5及1：9代表多肽-金纳米团簇的合成过程中多肽与谷胱甘肽的摩尔比)。
图6是实施例1步骤(2)得到的多肽-金纳米团簇催化过氧化氢使TMB显色的明场图。
图7是异品系小鼠心脏移植组和同品系小鼠心脏移植组小鼠心脏移植物生存期图。
图8是异品系小鼠心脏移植组和同品系小鼠心脏移植组小鼠心脏植物搏动评分图。
图9是异品系小鼠心脏移植组和同品系小鼠心脏移植组小鼠注入纳米探针后的尿液在652nm波长初始变异速度的结果图。
图10是即时诊断纳米探针(纳米探针)用于小鼠心脏移植排斥感应检测的特异性和灵敏性图。
图11是小鼠注射即时诊断纳米探针(纳米探针)后组织切片的HE染色图，比例尺为200nm。
图12是异品系小鼠心脏移植模型小鼠经治疗或非治疗后小鼠心脏移植物生存期图。
图13是异品系小鼠心脏移植模型小鼠经治疗或非治疗后小鼠心脏移植物搏动评分图。
图14是异品系小鼠心脏移植模型小鼠经治疗5、14d后或非治疗5d后注入纳米探针后的尿液在652nm波长初始变异速度的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其制备方法
一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针，其结构示意图如图1所示，包含：中性链霉亲和素(购于Thermo Scientific公司，NO.31000)、多肽和金纳米团簇，其中，多肽为Biotin-SGSRSGIEFDKGGSGGC(SEQ ID NO.1)，其分子结构如下所示：
Figure BDA0003710780610000071
中性链霉亲和素和多肽中的生物素通过氢键作用力及疏水作用力连接，金纳米团簇与多肽中的C端氨基酸通过金硫键连接，中性链霉亲和素与多肽的摩尔比为1:4。
上述用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)多肽的合成：
1)多肽采用固相合成法获得(合成顺序从C端到N端)，合成选用0.4mM负载量的Rink Amide-AM树脂，其中树脂上存在被Fmoc保护的氨基；用20％(v/v)的六氢吡啶的DMF溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果，显蓝色代表Fmoc被脱除；接着将第一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(摩尔量为氨基酸用量的10倍)的DMF溶液活化，并将10ml上述液体加入到脱去保护的树脂中室温下摇床震荡反应1小时；按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽，其中最后一个丝氨酸脱完保护后用Biotin封端(Biotin的羧基与脱保护后的氨基共价偶联)；然后用含有2.5％(v/v)水、2.5％(v/v)三异丙基硅烷和2.5％(v/v)乙二硫醇的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化；
2)纯化过程的条件为：流动相是含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈(流动相A)和含有0.1％(v/v)三氟乙酸的双蒸水(流动相B)；参数是0min内参数是梯度洗脱从5％流动相A/95％流动相B到60％流动相A/40％流动相B，进样量25uL，流速为10mL/min，处理时间为30min；检测器为Shimadzu SPD 20A紫外检测器，色谱柱InterSustain C18(4.6*250mm,5um)检测波段为220nm；室温，所得到的多肽的MALDI-TOF图谱如图2所示，由图可知，连接多肽的分子量为1826.0，即为：Biotin-SGSRSGIEFDKGGSGGC。
(2)多肽-金纳米团簇的合成：
1)分别配制20mM的步骤(1)得到的多肽溶液(A液)和80mM的谷胱甘肽GSH溶液(B液)；
2)取150μL的A液与187.5μL的B液(多肽与谷胱甘肽的摩尔比为1:5)混合，加入2.8125mL去离子水得到C液；
3)取500μL氯金酸溶液(100mM)与20.75mL去离子水在50mL单口瓶中混合，随后在室温下将3.75mL的C液加入并500rpm搅拌；
4)2分钟后，将反应温度升高至70℃，持续搅拌24小时；
5)用10kD的超滤管纯化样品，通过透射电镜对样品进行表征，结果如图3所示：样品(多肽-金纳米团簇)尺寸在2nm左右；
(3)即时诊断纳米探针(纳米探针)的制备：将中性链霉亲和素与步骤(2)得到的多肽-金纳米团簇按摩尔比1:4混合，在PBS中搅拌过夜，反应完后的溶液用50kD的超滤管进行纯化，用动态光散射对纳米探针尺寸进行表征；结果如图4所示，即时诊断纳米探针尺寸为11.25nm，大于5.5nm。
实施例2一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其制备方法
本实施例中的用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其制备方法与实施例1相同，区别仅在于：多肽-金纳米团簇的合成过程中多肽和谷胱甘肽的摩尔比为1:9。
效果实施例
1.用动态光散射仪对实施例1步骤(2)得到的金纳米团簇(金团簇，制备方法与步骤(2)中多肽-金纳米团簇的合成方法相同，区别仅在于不使用A液)、实施例1、2步骤(3)得到的即时诊断纳米探针(纳米探针)、以及经颗粒酶B处理的实施例1、2步骤(3)得到的即时诊断纳米探针(将400μL实施例1、2步骤(3)得到的即时诊断纳米探针(50μM)与1.2μL颗粒酶B溶液(1600nM)在室温下共孵育1h)的尺寸进行表征，结果如图5所示：金纳米团簇的尺寸小于5nm，实施例1、2步骤(3)得到的即时诊断纳米探针(纳米探针)大于5.5nm(肾小球滤过尺寸)，并且随着多肽和谷胱甘肽的摩尔比的减小而增加，经颗粒酶B处理的即时诊断纳米探针(纳米探针)小于5nm；即正常无排斥状态下，该即时诊断纳米探针(纳米探针)无法通过肾脏滤过进入尿液；当发生急性排斥后，颗粒酶B切断即时诊断纳米探针(纳米探针)上的多肽，导致金纳米团簇与中性链霉亲和素分离，小尺寸的金纳米团簇易经过肾脏滤过进入尿液。
2.取200μL实施例1步骤(2)得到的金纳米团簇((金团簇，制备方法与步骤(2)中多肽-金纳米团簇的合成方法相同，区别仅在于不使用A液；2mM)与200μL过氧化氢(5M)和200μL TMB(5mM)混合后，补加400μL乙酸钠-柠檬酸缓冲液(pH＝4)，在室温下反应30分钟，观察颜色变化，结果如图6所示：溶液由无色变为蓝色，表明金纳米团簇具有过氧化物酶的活性，在有过氧化氢及TMB存在下，可以显色。
3.构建异品系小鼠心脏移植排斥模型：异品系小鼠心脏移植组(BalB/c小鼠心脏移植于c57小鼠，BalB/c和C57小鼠采购于江苏集萃药康生物科技有限公司；小鼠年龄6～8周，体重18～22g)，同品系小鼠心脏移植组(BalB/c小鼠心脏移植于BalB/c小鼠)；具体如下：手术动物仰卧位保定，常规剃毛消毒，从剑突下方到耻骨上方为手术入口暴露腹腔；在体视镜下手术，供体分离出供心，受体分离出小鼠颈外动脉和颈内静脉(异位心脏移植)，然后与供心行套管法吻合，供心复流，完成手术，关闭受体颈部；每种处理12只小鼠。
通过建立异品系小鼠心脏急性排斥模型(BalB/c小鼠心脏移植于C57小鼠)基础上，利用斯坦福心脏外科实验室移植物评分量表(表1)评估小鼠心脏移植模型，当移植心脏评分低于1时，被认为是移植物完全排斥即移植物生存期终止。由图7可知，异品系小鼠心脏移植组(异种)移植物生存期中位数在7天，同品系小鼠心脏移植组(同种)移植物生存期大于10天。由图8可知，异品系小鼠心脏移植组(异种)和同品系小鼠心脏移植组(同种)移植心脏搏动评分在Day5(2.83vs 4,P<0.001)、Day7(0.42vs 4,P<0.001)有明显差异，表明异品系小鼠心脏移植排斥模型构建成功。在移植手术后第五天，分别向异品系小鼠心脏移植组(异种)和同品系小鼠心脏移植组(同种)小鼠通过尾静脉注射一次200uL 50nM即时诊断纳米探针(纳米探针)(实施例1制备得到的)，利用96孔板收集小鼠注射1h后尿液，对不同组收集尿液(加入过氧化氢和TMB)在652nm波长进行定量分析(分光光度计)，结果如图9所示：异品系小鼠心脏移植组(异种)和同品系小鼠心脏移植组(同种)的尿液检测在652nm波长初始变异速度有明显的差异(P<0.001)，与上述结果一致。通过652nm波长初始变异速度对异品系小鼠心脏移植组(异种)和同品系小鼠心脏移植组(同种)尿液样本有显著的区分度AUC＝0.896(图10)，表明本申请提供的即时诊断纳米探针(纳米探针)可以用于检测是否发生器官移植排斥。
表1斯坦福心脏外科实验室移植物评分量表
移植物评分 描述
0 无触及心脏搏动。
1 几乎没有明显的心脏搏动。
2 心脏收缩强度明显下降，但仍以规律方式收缩。
3 心脏强劲而规律的跳动，但收缩力量或速率上明显下降。
4 心脏强烈收缩，速率正常，无明显增大或质地僵硬。
4.利用健康C57品系小鼠，采用尾静脉注射200uL 50nM即时诊断纳米探针(纳米探针)(实施例1制备得到，即时诊断纳米探针(纳米探针)组)(对照组注射等量PBS)。分别对注射后不同时间点(7天、14天和30天)心、肝、脾、肺和肾组织取材，固定，并进行H&E染色。结果如图11所示：通过两名病理专家的独立评估，即时诊断纳米探针(纳米探针)组和PBS组之间无明显差异。表明在小鼠模型中，本申请提供的即时诊断纳米探针(纳米探针)没有诱导显著的系统毒性。
5.取24只成功建立的异品系小鼠心脏移植模型，术后治疗组腹腔注射2mg/kg他克莫司(FK 506)连续给药7天，未治疗注射等量生理盐水(每种处理12只小鼠)。分别选取未治疗组(异种)和治疗组(FK 506)术后Day5、Day14小鼠，通过尾静脉注射200uL 50nM即时诊断纳米探针(纳米探针)(实施例1制备得到)，利用96孔板收集小鼠注射1h后尿液，对不同组收集尿液(加入过氧化氢和TMB)在652nm波长进行初始变异速度定量分析。由图12可知，未治疗组和治疗组移植物生存期中位数分别是6.8天和16.2天；由图13可知，未治疗组和治疗组Day5、Day7移植心脏搏动指数有明显差异(2.25vs 4,0.33vs 4)；表明通过免疫抑制剂可以缓解器官移植排斥；由图14可知，未治疗组Day5分别与治疗组Day5、治疗组Day14在652nm波长初始变异速度有明显的差异(P<0.001，P<0.001)，与上述结果一致，表明本申请提供的即时诊断纳米探针(纳米探针)可以用于评估免疫抑制剂治疗效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第三医院
<120> 一种用于器官移植排斥检测的即时诊断纳米探针及其应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ile Glu Phe Asp Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Cys
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ile Glu Pro Asp Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Cys
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Phe Asp Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Cys
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Pro Asp Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Cys
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Gly Ser Gly Ile Glu Phe Asp Arg Gly Gly Ser Gly Gly Cys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ser Gly Ser Gly Ile Glu Pro Asp Arg Gly Gly Ser Gly Gly Cys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ser Gly Ile Glu Phe Asp Arg Gly Gly Ser Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ser Gly Ile Glu Pro Asp Arg Gly Gly Ser Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ile Glu Phe Asp Arg Gly Gly Ser Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ile Glu Pro Asp Arg Gly Gly Ser Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Ile Glu Phe Asp Ser Gly Gly Cys
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Ile Glu Pro Asp Ser Gly Gly Cys
1 5

Claims (10)

1.一种即时诊断纳米探针，包含：蛋白载体、多肽和纳米模拟酶；
所述多肽包含颗粒酶的酶切位点；
所述蛋白载体与所述多肽连接；
所述多肽与所述纳米模拟酶连接；
所述纳米模拟酶具有过氧化物酶活性；
所述即时诊断纳米探针的粒径大于5.5nm。
2.根据权利要求1所述的即时诊断纳米探针，其特征在于：
所述颗粒酶包含颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶H、颗粒酶K、颗粒酶M中的至少一种；
进一步为颗粒酶B。
3.根据权利要求1或2所述的即时诊断纳米探针，其特征在于：
所述蛋白载体与所述多肽通过共价键或非共价键连接；
优选地，所述蛋白载体为生物体来源或人工合成的蛋白；
优选地，所述蛋白载体包含中性链霉亲和素、链霉亲和素、亲和素、白蛋白、精蛋白、转铁蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白中的至少一种；
进一步优选地，所述蛋白载体包含中性链霉亲和素；
优选地，所述多肽的N端或C端连接有生物素。
4.根据权利要求1或2所述的即时诊断纳米探针，其特征在于：
所述多肽与所述纳米模拟酶通过共价键连接；
优选地，所述纳米模拟酶为金属纳米团簇；进一步为金纳米团簇、银纳米团簇、铜纳米团簇、铂纳米团簇、铂-铁双金属纳米团簇、钴团簇、金-银双金属纳米团簇中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的即时诊断纳米探针，其特征在于：
所述多肽的氨基酸序列包含如下中的至少一种：SGSRSGIEFDKGGSGGC(SEQ ID NO.1)、SGSRSGIEPDKGGSGGC(SEQ ID NO.2)、SGSGSGIEFDKGGSGGC(SEQ ID NO.3)、SGSGSGIEPDKGGSGGC(SEQ ID NO.4)、SGSGIEFDRGGSGGC(SEQ ID NO.5)、SGSGIEPDRGGSGGC(SEQ ID NO.6)、SGIEFDRGGSGGC(SEQ ID NO.7)、SGIEPDRGGSGGC(SEQ ID NO.8)、IEFDRGGSGGC(SEQ ID NO.9)、IEPDRGGSGGC(SEQ ID NO.10)、IEFDSGGC(SEQ ID NO.11)、IEPDSGGC(SEQ ID NO.12)；
优选地，所述即时诊断纳米探针的粒径为6～100nm；进一步为10～100nm；
优选地，所述蛋白载体与所述多肽的摩尔比为1:(1～10)。
6.权利要求1～5中任一项所述的即时诊断纳米探针的制备方法，包含如下步骤：1)采用多肽合成多肽-纳米模拟酶；2)将多肽-纳米模拟酶与蛋白载体混合，得到即时诊断纳米探针。
7.权利要求1～5中任一项所述的即时诊断纳米探针在制备产品中的应用；
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒中的至少一种；
优选地，所述产品具有如下功能：
器官移植排斥反应检测；和/或
评估免疫抑制剂治疗器官移植排斥的效果。
8.一种产品，包括：权利要求1～5中任一项所述的即时诊断纳米探针。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述产品还包含：过氧化物和四甲基联苯胺中的至少一种；
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒中的至少一种；
优选地，所述产品具有如下功能：
器官移植排斥反应检测；和/或
评估免疫抑制剂治疗器官移植排斥的效果。
10.一种检测系统，包含：权利要求1～5中任一项所述的即时诊断纳米探针和/或权利要求8～9中任一项所述的产品；和
分光光度计。
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