CN106699850B - Rbbp4靶向多肽和抗肿瘤多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RBBP4靶向多肽和一种抗肿瘤多肽及其应用。所述RBBP4靶向多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述抗肿瘤多肽包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域，所述RBBP4靶向结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接RBBP4靶向结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

Description

RBBP4靶向多肽和抗肿瘤多肽及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种RBBP4靶向多肽和一种抗肿瘤多肽及其应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康，是世界范围内一个主要的致死因素。常规的肿瘤治疗手段包括化疗、放疗、手术切除等。但这些方法通常会对机体的正常组织带来损伤，造成很大的毒副作用，给肿瘤患者带来极大的痛苦。因此，特异性高、疗效显著的肿瘤靶向治疗方法引起了人们的极大兴趣。

肿瘤靶向疗法指通过干扰参与肿瘤细胞发生、发展和扩散相关的特殊分子，进而抑制肿瘤进展的治疗方法。肿瘤靶向疗法区别于传统化疗，有其特定的靶标分子，人们也正在努力开发各种肿瘤靶向疗法。目前认为，靶向性多肽是比较理想的肿瘤靶向治疗手段，具有以下优势：1)血浆清除速度快，亲和力高，特异性强；2)良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；3)易于化学合成，且免疫原性低，可避免单克隆抗体治疗的不足。因此，近年来许多学者应用肽库技术寻找可能与肿瘤细胞特异结合的短肽，以达到靶向治疗肿瘤的目的。

多梳抑制复合物2(PRC2)是一类重要的表观遗传抑制复合物，能通过调控组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27)，抑制基因的转录。PRC2在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。相对于正常细胞，肿瘤细胞中PRC2复合物对抑癌基因的抑制活性显著增强。PRC2在肿瘤中的关键作用使得它成为肿瘤表观遗传疗法的重要靶标。PRC2与多种肿瘤，如结肠癌、乳腺癌、白血病、肝癌、口腔癌的相关性已引起人们日益增多的关注。

人类PRC2复合物由四个核心组分组成，即，胚胎外胚层发育蛋白(EED)、果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)、Zeste人12同源物1抑制因子2(SUZ12)和RBBP4。其中，EZH2是核心催化亚基，RBBP4与SUZ12负责结合核小体，EED能增强EZH2的催化作用。已有多项研究针对EZH2设计多肽及药物，抑制其功能，达到治疗肿瘤的作用，然而尚缺乏针对RBBP4蛋白设计的多肽或药物研究。

RBBP4蛋白是WD40家族中的一员，定位于细胞核内，能直接结合组蛋白H3-H4复合物，也参与多种组蛋白结合复合物的形成；除PRC2复合物以外，RBBP4参与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)复合物、核小体重塑脱乙酰基酶(NuRD)复合物的形成，调节染色质结构及功能。对RBBP4进行靶向结合，能削弱PRC2复合物的形成，并抑制其催化活性，从而达到治疗肿瘤的效果。

细胞穿膜肽(CPP)是一类具有很强穿透细胞膜能力的短肽，具有正电荷，既可以从生物体内提取，也可以通过人工合成。该多肽可以直接穿透细胞膜，进入细胞浆和细胞核，有利于进一步作为载体携带药物进行抗肿瘤治疗。同时，对正常组织毒副作用小，从根本上改善基因治疗的安全与伦理问题。对进一步研制高效、安全的靶向治疗药物具有重要意义，可望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。

因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。

发明内容

为解决以上问题，发明人制备了一种靶向RBBP4的多肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。

基于该研究，本发明提供了一种RBBP4靶向多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了上述RBBP4靶向多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域，所述RBBP4靶向结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述RBBP4靶向结构域位于所述抗肿瘤多肽的C端，并且所述穿膜结构域位于N端。

本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接RBBP4靶向结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

附图说明

图1为用RBP-25和对照多肽孵育肿瘤细胞后的荧光显微镜照片；

图2为不同浓度的RBP-25对SW480增殖活性影响的统计图；

图3为不同浓度的RBP-25对SK-N-SH增殖活性影响的统计图；

图4为RBP-25处理不同时间对SW480增殖活性影响的统计图；

图5为RBP-25处理不同时间对SK-N-SH增殖活性影响的统计图；

图6为Transwell实验的结晶紫染色照片；

图7为根据图6计数得到的IMR32细胞的Transwell实验的细胞计数图；

图8为根据图6计数得到的SK-N-SH细胞的Transwell实验的细胞计数图；

图9为倒置显微镜下动态观察HUVEC小管形成的照片；

图10为RBBP4抗体免疫沉淀EZH2/SUZ12的western blot检测照片；

图11为RBP-25处理后SK-N-SH细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的western blot检测照片；

图12为RBP-25处理后MCF-7细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的westernblot检测照片；

图13为RBP-25处理后SK-N-SH细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相对转录水平；

图14为RBP-25处理后MCF-7细胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相对转录水平。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.RBBP4靶向多肽的鉴定以及抗肿瘤多肽的合成

通过生物信息学和蛋白定点突变技术，获取针对RBBP4的多肽氨基酸序列SEQ IDNO:2。

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域(SEQ ID NO:1)，为了研究方便，我们还在RBBP4靶向结构域的C端标记的异硫氰酸荧光素标记，氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-MEILQSDYILAQVK-FITC(命名为RBP-25)，由武汉百意欣生物技术有限公司合成。

合成步骤如下：

1)称取n当量树脂放入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的二异丙基乙胺(DIEA)，适量的二甲基甲酰胺(DMF)、DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)、DIEA、DMF、DCM，氮气鼓泡反应60分钟。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净。

2)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐(HBTU和DIEA，氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，洗净，茚三酮检测。

3)依步骤2)的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰。

4)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％三氟乙酸、2％乙二硫醇、2％三异丙基硅烷、1％水)，震荡，滤掉树脂。

5)得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物。

多肽纯化：反相高效液相色谱法纯化粗品，多肽通过疏水作用连接到柱填料上，渐次降低离子强度进行洗脱。

采用紫外分光光度法测定多肽紫外吸收进行定量。结果显示成功合成该多肽，并且纯度为95％以上。

多肽冻干：纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

储存：冻干多肽放在-70℃条件下可以保存一年以上，避免紫外线等剧烈物理环境，避免反复冻融。

用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)将多肽稀释为1mM的储存液分装后避光冻存于-70℃备用。

2.RBP-25多肽穿膜及细胞定位实验

分别采用人乳腺癌细胞系MCF-7、人神经母细胞瘤细胞系IMR32进行检测。将对数期生长的细胞种植在24孔板内的盖玻片上，每孔约15000个细胞。以10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养，并加入30μM的多肽，维持48小时。以与该多肽相同组成的氨基酸随机重新排列后的错序肽作为对照肽。

弃去培养基，加入4％多聚甲醛300μl/孔，室温固定细胞20分钟，弃去多聚甲醛，1xPBS清洗两次，每次5分钟。

加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液300μl/孔，室温染细胞核5分钟，1x PBS充分洗涤5次，每次5分钟。纯甘油封片，将盖玻片固定于载玻片上。采用激光共聚焦显微镜检测带有荧光基团的多肽在细胞内的定位，拍照并保存。

以上实验结果在相同条件下重复三次。

实验结果如图1所示，该多肽在加入细胞培养体系48小时之后，能有效与肿瘤细胞结合，并显示强胞浆及胞核染色。而对照肽仅能部分进入细胞浆，少量分布在细胞核。实验结果表明，该多肽能够有效进入肿瘤细胞的胞浆和胞核内。

3.RBP-25多肽抑制细胞增殖活性实验

采用MTT法检测该多肽对不同肿瘤细胞的增殖活性影响。分别使用人结肠癌细胞系SW480、人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH进行检测。以与该多肽相同组成的氨基酸随机重新排列后的错序肽作为对照肽。

在96孔细胞培养板中，每孔种植5000个细胞培养，每个样品设定10个复孔。24小时后，加入多肽。多肽及其对照多肽浓度分别为10μM、30μM、50μM、100μM；作用时间分别为为24小时、48小时、72小时。

到达标定时间之后，吸弃培养上清，用1×PBS清洗样品孔3次，每次5分钟。再向样品孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液。将培养板静置于37℃，10分钟。取出后轻轻混匀孔内样品。用酶标仪检测570nm吸光度。收集数据，计算并统计。

以上实验在相同条件下重复三次。

实验结果如图2-5所示，该多肽能显著抑制肿瘤细胞SW480和SK-N-SH的增殖活性，其效果在30μM浓度以上(图4和5)48小时后(图2和3)较为明显。而对照肽并不体现出明显的抑制增殖效应。

4.RBP-25多肽抑制细胞迁移活性检测

细胞迁移实验可以通过检测肿瘤细胞趋营养穿透Transwell微孔薄膜进行检测。

在24孔培养板中放置Transwell小室(购自Corning公司，货号：3421)，向底层加入含15％胎牛血清的完全培养基，并向培养基中加入不同浓度的多肽。

用无血清培养基制备单细胞悬液，计数后，以200μl无血清培养基中2×10⁴个细胞的浓度向Transwell上室中加入200μl细胞悬液，约2×10⁴个细胞。并向上室内加入与下室相同浓度的多肽。

于5％二氧化碳、37℃培养24小时。取出小室放入4％多聚甲醛中固定20分钟，再放入0.5％结晶紫染色液中染色2小时。

用棉签轻轻去除上室中未穿过多孔膜的细胞，在倒置显微镜下对多孔膜进行照相计数。

实验结果如图6-8所示，RBP-25能显著抑制肿瘤细胞迁移活性并呈剂量依赖性。而对照多肽并不体现出明显的抑制效应。

5.RBP-25多肽抑制肿瘤细胞血管生成活性检测

肿瘤细胞血管生成活性，可以通过检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在细胞外基质胶(matrigel)中的生长与血管形成状态来进行检测。

具体实施方式如下：

在12孔板中以80％细胞密度铺板，每孔加入1ml培养基，再加入不同浓度的多肽，同时设对照孔；

在37℃、5％CO₂环境培养48小时，收集培养孔内的上清液，标记好冻存在-80℃备用；

从-20℃取出基质胶，在冰水浴中复温至融解状态。取96孔细胞培养板，每孔加入50μl基质胶至孔底，水平放置于37℃培养箱30分钟，待基质胶凝固；

制备HUVEC单细胞悬液，计数后，向96孔板每孔加入3000个细胞，再加入收集的肿瘤细胞培养上清100μl；

在37℃、5％CO₂环境培养6-8小时，在倒置显微镜下动态观察HUVEC小管形成状态，适时拍照。

实验结果如图9所示，RBP-25能显著抑制肿瘤细胞血管形成活性，并呈剂量依赖性。而对照度肽并不体现出明显的抑制效应。

6.RBP-25多肽抑制蛋白相互作用的免疫共沉淀检测

采用SK-N-SH细胞检测多肽对RBBP4蛋白与PRC2复合物组分EZH2、SUZ12相互作用的抑制效应。向10cm培养皿中培养的细胞加入不同浓度的多肽(0、10、30、50、100μM)，同时另设对照多肽加入组，处理48小时；

0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞，1×PBS洗涤，去除上清；

用RIPA(弱)裂解液1ml充分裂解细胞团块，将裂解液分为3等份，取50μl作为总蛋白对照组冻存于-70℃，余下450μl作为免疫共沉淀组，加入30μl预混匀蛋白琼脂糖纯化树脂，1.5μg RBBP4抗体/EZH2抗体/SUZ12抗体，置于4℃冰箱以10rpm旋转混匀过夜；

取出过夜混匀的试管，3000rpm离心1分钟，弃上清，加入1ml 1×PBS重悬琼脂糖珠，3000rpm离心1分钟，小心吸去上清，反复4-5次，将未结合琼脂糖珠的部分清洗弃去。最后一次洗涤后，小心去除上清，保留20-30μl PBS；

加入20-30μl 2×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样缓冲液，混匀后95℃水浴10分钟，解离琼脂糖珠上的蛋白；

制备12％SDS-PAGE胶，电泳后按照分子量切取48KD(RBBP4)、102KD(EZH2)、83KD(SUZ12)的条带，转膜封闭，相应抗体孵育后曝光。根据条带的明暗判读不同浓度的多肽对RBBP4与EZH2及SUZ12相互作用的抑制效果。

实验结果如图10所示，采用Western blot检测，总蛋白对照组显示每组蛋白上样量相等，Co-IP组显示随着多肽浓度的提高，以RBBP4抗体免疫沉淀获得的EZH2/SUZ12蛋白逐渐减少，说明PRC2复合物的组建受到一定程度的抑制。

7.RBP-25多肽对于RBBP4下游基因的调节作用

通过生物信息学芯片分析，结合实时定量PCR分析，获得了数个与RBBP4在肿瘤细胞中作用时的下游靶基因，且均为抑癌基因。认为RBBP4的作用促进了PRC2复合物在这些基因的启动子区域结合，抑制了这些基因的转录与表达，从而促进肿瘤的发生发展；

获得的基因如下：L1CAM同源物细胞粘附分子(CHL1)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)、外周髓鞘蛋白-22(PMP22)、蛋白酪氨酸磷酸酶受体Z1(PTPRZ1)、RNA聚合酶1和转录释放因子抗体(PTRF)；

根据NCBI提供的基因序列设计了针对这五个基因的特异引物，用于实时定量PCR检测其转录水平变化；

购买了这些基因的相应蛋白抗体，进行蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白水平；

取对数生长期的肿瘤细胞，向培养体系中加入不同浓度的多肽(0、10、30、50、100μM)，处理48小时之后，收集细胞；

取部分细胞提取RNA，经逆转录之后用步骤3所设计的特异性引物进行实时定量PCR分析检测；

取部分细胞提取总蛋白，测定浓度，变性之后采用SDS-PAGE凝胶电泳，转膜孵育抗体后分别检测五个靶基因的蛋白表达水平。获取多肽调节五个靶基因的蛋白水平数据。

实验结果如图11-14所示，该多肽能提升RBBP4下游靶基因的转录及蛋白翻译水平，随着多肽浓度的增加，该作用更为明显，证明该多肽确实能对抗PRC2复合物对抑癌基因的抑制作用，发挥抑制肿瘤发生、发展的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> RBBP4靶向多肽和抗肿瘤多肽及其应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ile Leu Gln Ser Asp Tyr Ile Leu Ala Gln Val Lys

1 5 10

Claims (6)

1.一种RBBP4靶向多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的RBBP4靶向多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为人神经母细胞瘤或结肠癌。

3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括RBBP4靶向结构域和穿膜结构域，所述RBBP4靶向结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求3或4所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述RBBP4靶向结构域位于所述抗肿瘤多肽的C端，并且所述穿膜结构域位于N端。

6.权利要求3-5中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为人神经母细胞瘤或结肠癌。

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