CN104955946A - 靶向的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括溶酶体酶和靶向部分的化合物，例如，包括通过由特定的点击化学反应形成的接头而结合至血管肽素-2的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的化合物。在某些实施方式中，这些化合物由于存在靶向部分而能够比单独的酶更有效地穿过血脑屏障或积累在溶酶体中。本发明的特征还在于含有此类化合物的药物组合物以及使用此类化合物治疗溶酶体贮积症(例如，粘多糖贮积症II型)的方法。

Description

靶向的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶化合物

相关申请的参考

本申请要求于2012年11月30日提交的第61/732,145号美国临时申请和2013年6月6日提交的第61/831,919号美国临时申请的权益，通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及包括溶酶体酶和靶向部分的化合物以及此种化合物在治疗由于此种酶的缺陷所致的病症中的用途。本发明还涉及生产这些化合物中的修饰的溶酶体酶中间体。

背景技术

溶酶体贮积症(Lysosomal storage disorders)是约50种罕见的遗传病症的一组病症，其中受试者在正常代谢所需的溶酶体酶方面具有缺陷。这些疾病通常是由常染色体或X-连锁的隐性基因造成的。作为一个组，这些病症的发病率约为1:5000到1:10,000。

亨特综合症或粘多糖贮积症II型(MPS-II)是由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS；也称为艾杜硫酸酯酶)的缺陷引起的，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶是硫酸肝素和硫酸皮肤素的溶酶体降解所需的酶。因为该病症为X连锁隐性的，所以它主要影响男性。患有此疾病的那些人不能分解和回收利用这些粘多糖，其也称为也称为葡糖胺聚糖或GAG。这种缺陷导致在整个身体内积累GAG，这对神经系统、关节和各种器官系统(包括心脏、肝脏和皮肤)具有严重影响。此外还有一些身体症状，包括粗拙的面部特征、肿大的头部和腹部以及皮肤损伤。在最严重的病例中，这种疾病在青少年时期可能是致命的并伴有严重的智力低下。

MPS-II目前无法治愈。除了缓解措施之外，治疗方法包括有骨髓移植和酶替代疗法。已经观察到骨髓移植稳定了MPS-II的外周症状，包括心血管异常、肝脾肿大(肿大的肝脏和脾脏)以及关节僵硬。但是，这种方法不能稳定或解决与这种疾病相关联的神经精神症状(Guffon et al.,J.Pediatr.154:733-7,2009)。

通过静脉给予IDS的酶替代疗法也已经被证明具有益处，包括改善皮肤病变(Marín et al.,(在打印刷前发表在网上)Pediatr.Dermatol.2011年10月13日)、内脏器官大小、胃肠道功能、以及对用于治疗上呼吸道感染的抗生素的需求降低(Hoffman et al.,Pediatr.Neurol.45:181-4,2011)。如同骨髓移植，这种方法不能改善与MPS-II相关联的中枢神经系统缺陷，因为预计酶不能穿过血-脑屏障(BBB；Wraith et al.,Eur.J.Pediatr.1676:267-7,2008)。

已经并且正在研究用于提高向脑中递送IDS的方法，包括鞘内递送(Felice et al.,Toxicol.Pathol.39:879-92,2011)。然而，鞘内递送是一种高度创伤性的技术。

因此，除了其他症状之外，还解决了神经系统疾病症状的少创伤且更有效的治疗MPS-II的方法将是非常合乎需要的。

发明内容

本发明涉及包括靶向部分和溶酶体酶的化合物。这些化合物由可以用来治疗MPS-II的IDS-血管肽素(Angiopep)-2结合物和融合蛋白为例。因为这些结合物和融合蛋白能够穿过BBB，所以它们不仅能够治疗外周疾病症状，而且可以有效于治疗CNS症状。此外，因为靶向部分如血管肽素-2能够使酶靶向溶酶体，所以预期这些结合物和融合蛋白比酶本身更加有效。

因此，在第一方面，本发明的特征在于包括以下的化合物：(a)靶向部分(例如可以少于200、150、125、100、80、60、50、40、35、30、25、24、23、22、21、20或19个氨基酸的肽或拟肽靶向部分)和(b)溶酶体酶、其活性片段或其类似物，其中靶向部分与酶、片段或类似物经由接头连接，其中靶向部分能够将所述酶、片段或类似物运输至溶酶体和/或穿过血脑屏障，其中化合物表现出IDS酶活性，其中连接酶和肽靶向部分的接头可以通过点击化学对(click chemistry pair)之间的点击化学反应来形成并且其中接头不具有结构：

在更特定的方面，本发明的特征在于包含以下的化合物：(a)少于150个氨基酸的肽或拟肽靶向部分和(b)选自由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、具有IDS活性的IDS片段或具有IDS活性的IDS类似物组成的组中的酶，其中靶向部分能够将所述酶、片段或类似物运输至溶酶体和/或穿过血脑屏障，其中靶向部分以及酶通过选自由以下组成的组中的接头连接：含有单氟环辛炔(MFCO)的接头、含有二氟环辛炔(DFCO)的接头、含有环辛炔(OCT)的接头、含有二苯并环辛炔(DIBO)的接头、含有二芳基氮杂环辛炔(BARAC)的接头、含有二氟苯并环辛炔(DIFBO)的接头和二环[6.1.0]壬炔(BCN)。

溶酶体酶可以是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、具有IDS活性的IDS片段或IDS类似物。在某些实施方式中，IDS酶或IDS片段具有人类IDS同种型a的氨基酸序列或其片段(例如，同种型a的氨基酸26-550)或者IDS类似物基本上同一(例如，至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一)于人类IDS同种型a、同种型b、同种型c的序列或者同一于同种型a的氨基酸26-550。在特定的实施方式中，IDS酶具有人类IDS同种型a的序列或者同种型a的成熟形式(同种型a的氨基酸26-550)。

在第一方面中，靶向部分可以包括与任何SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:105或SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:117(例如，血管肽素-2(SEQ IDNO:97))基本相同的氨基酸序列。在其他实施方式中，靶向部分包含式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；而X5是Phe、Tyr或Trp，其中靶向部分可选地包含一种或多种式Ia中记载的氨基酸的D-异构体。在其他实施方式中，靶向部分包含式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；X5是Phe、Tyr或Trp；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；而Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；并且其中靶向部分可选地包含在式Ib、Z1或Z2中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。在其他实施方式中，靶向部分包括式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；而X6是Lys或D-Lys；并且其中X1、X2、X5或X6中的至少一个是D-氨基酸。在其他实施方式中，靶向部分包括式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；X6是Lys或D-Lys；而X7是Tyr或D-Tyr；并且其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个是D-氨基酸。在其他实施方式中，靶向部分包括式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；X6是Lys或D-Lys；X7是Tyr或D-Tyr；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；而Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个是D-氨基酸；而其中肽或拟肽可选地包含在Z1或Z2中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。

在第一方面，接头可以是共价键(例如，肽键)或一个或多个氨基酸。化合物可以是融合蛋白(例如，血管肽素-2-IDS、IDS-血管肽素-2或血管肽素-2-IDS-血管肽素-2或具有图1中所示的结构)。化合物可以进一步包括由第二接头连接到化合物的第二靶向部分。

本发明的特征还在于一种药物组合物，其包括第一方面的化合物以及药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明的特征在于一种治疗或预防性治疗患有溶酶体贮积症(例如，MPS-II)的受试者的方法。该方法包括向受试者给予第一方面的化合物或本文所描述的药物组合物。化合物中的溶酶体酶可以是IDS。受试者可能患有MPS-II的严重形式或者MPS-II的轻度形式。受试者可能正经历神经性症状(例如，精神发育迟滞)。方法可以实施于或开始于小于六个月龄，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15或18岁龄的受试者。受试者可以是婴儿(例如，不到1岁大)。

在某些实施方式中，靶向部分不是抗体(例如，对内源性BBB受体如胰岛素受体、转铁蛋白受体、瘦蛋白受体、脂蛋白受体和IGF受体是特异性的抗体或免疫球蛋白)。

在任何上述方面中，靶向部分可以与表1的任何序列或其片段基本上具有同一性。在某些实施方式中，肽具有以下的序列：血管肽素-1(SEQ IDNO:67)、血管肽素-2(SEQ ID NO:97)(An2)、血管肽素-3(SEQ ID NO:107)、血管肽素-4a(SEQ ID NO:108)、血管肽素-4b(SEQ ID NO:109)、血管肽素-5(SEQ ID NO:110)、血管肽素-6(SEQ ID NO:111)、血管肽素-7(SEQ IDNO:112)或反向血管肽素-2(SEQ ID NO:117)。靶向部分或化合物可以有效地转运到特定的细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种、或五种)中或可以有效穿过哺乳动物BBB(例如，血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5和血管肽素-6)。在另一个实施方式中，靶向部分或化合物能够进入特定的细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种、或五种)但并不能有效穿过BBB(例如，包含血管肽素-7的结合物)。靶向部分可以是任何长度，例如，至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200或500个氨基酸或这些数之间的任何范围。在某些实施方式中，靶向部分小于200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个氨基酸(例如，10至50个氨基酸的长度)。可以通过重组遗传技术或化学合成生产靶向部分。

表1：示例性的靶向部分

SEQ IDNO:

多肽编号5、67、76和91，分别包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:91的序列，并在C-端酰胺化。

多肽编号107、109和110分别包含SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的序列，并在N-端乙酰化。

在任何上述方面，靶向部分可以包括具有下式的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19

其中X1-X19中每一个(例如，X1-X6、X8、X9、X11-X14和X16-X19)独立地是氨基酸(例如，天然氨基酸如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)或不存在并且X1、X10和X15中的至少一个(例如，2或3)是精氨酸。在一些实施方式中，X7是Ser或Cys；或X10和X15各自独立地是Arg或Lys。在一些实施方式中，从X1至X19的残基，包括X1和X19在内，与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:116(例如，血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5、血管肽素-6和血管肽素-7)任何之一的任何氨基酸序列基本上具有同一性。在一些实施方式中，至少一个(例如，2、3、4或5)氨基酸X1～X19是Arg。在一些实施方式中，肽在肽的N-端、肽的C-端或这二者同时具有一个或多个另外的半胱氨酸残基。

在任何上述方面中，靶向部分可以包括氨基酸序列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；而X5是Phe、Tyr或Trp；其中，肽可选地长度少于200个氨基酸(例如，少于150、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8或7个氨基酸，或这些数之间的任何范围)；其中，肽或拟肽可选地包括一种或多种记载于式Ia中的氨基酸的D-异构体(例如，Lys、Arg、X3、X4、X5或Lys的D-异构体)；并且其中，肽或拟肽不是表2中的肽。

在任何上述方面中，靶向部分可以包含氨基酸序列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；并且X5是Phe、Tyr或Trp；其中，肽或拟肽长度上少于19个氨基酸(例如，少于18、17、16、15、14、12、10、11、8、或7个氨基酸，或这些数之间的任何范围)；并且其中，肽或拟肽可选地包含记载于式Ia中的氨基酸的一种或多种D-异构体(例如，Lys、Arg、X3、X4、X5或Lys的D-异构体)。

在任何上述方面中，靶向部分可以包含氨基酸序列Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；X5是Phe、Tyr或Trp；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；并且Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；并且其中肽或拟肽可选地包含式Ib、Z1或Z2中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。

在任何以上方面中，靶向部分可以包含氨基酸序列Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys。在其他实施方式中，靶向部分具有Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr的氨基酸序列。在还有的其他实施方式中，靶向部分具有Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys的氨基酸序列。

在任何以上方面中，靶向部分可以具有X1-X2-Asn-Asn-X5-X6的氨基酸序列(式IIa)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；并且X6是Lys或D-Lys；并且其中X1、X2、X5或X6中的至少一个(例如，至少两、三或四个)是D-氨基酸。

在任何以上方面中，靶向部分可以具有X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7的氨基酸序列(式IIb)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；X6是Lys或D-Lys；并且X7是Tyr或D-Tyr；并且其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个(例如，至少两、三、四或五个)是D-氨基酸。

在任何上述方面，靶向部分可以具有Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式IIc)的氨基酸序列，其中X3为Asn或Gln；X4为Asn或Gln；X5为Phe、Tyr或Trp；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；而Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个为D-氨基酸；其中肽或拟肽可选地包含一种或多种Z1或Z2中记载的氨基酸的D-异构体。

在任何上述方面，靶向部分可以具有Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr(An2)的氨基酸序列，其中任何一个或多个氨基酸为D-异构体。例如，靶向部分可以具有为D-异构体的1、2、3、4或5个氨基酸。在优选的实施方式中，8、10和11位的一个或多个或全部可以是D-异构体。在又另一个实施方式中，8、10、11和15位的一个或多个或全部可以具有D-异构体。

在任何上述方面，靶向部分可以是Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr(3D-An2)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1a)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1b)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys(P1c)；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys(P1d)；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P2)；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P3)；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P4)；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5)；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5a)；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5b)；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys(P5c)；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys(P6)；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys(P6a)；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys(P6b)；Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr；和D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys(P6c)；或它们的片段。在其他实施方式中，靶向部分具有的序列为具有0至5个(例如，0至4、0至3、0至2、0至1、1至5、1至4、1至3、1至2、2至5、2至4、2至3、3至5、3至4或4至5个)氨基酸的替换、缺失或另外的前述肽或拟肽的一个。

在任何上述方面，肽可以是Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；或Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys或它们的片段。

在任何上述方面，拟肽可以是Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr(3D-An2)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1a)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1b)；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys(P1c)；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys(P1d)或它们的片段(例如，从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的N-末端缺失1至7个氨基酸；从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的C-末端缺失1至5个氨基酸；或从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的N-末端缺失1至7个氨基酸且从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的C-末端缺陷1至5个氨基酸)。

在本文中所描述的任何靶向部分中，部分可以包含1、2、3、4或5个氨基酸(例如，1至3个氨基酸)的插入或缺失，可以由本文中所描述的氨基酸序列(例如，由Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys)制成。

在任何本文所描述的靶向部分中，部分可以在肽或拟肽的N-末端、肽或拟肽的C-末端或两者具有一个或多个另外的半胱氨酸残基。在其他实施方式中，靶向部分可以在肽或拟肽的N-末端、肽或拟肽的C-末端或两者具有一个或多个另外的酪氨酸残基。在又进一步的方面，靶向部分在肽或拟肽的N-末端、肽或拟肽的C-末端或两者具有氨基酸序列Tyr-Cys和/或Cys-Tyr。

在任何上述方面的某些实施方式中，靶向部分在长度上可以少于15个氨基酸(例如，少于10个氨基酸的长度)。

在任何上述方面的某些实施方式中，靶向部分可以具有酰胺化的C-末端。在其他实施方式中，靶向部分能有效地运输穿过BBB(例如，比血管肽素-2更有效地运输穿过BBB)。

在任何上述方面的某些实施方式中，融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶(例如，IDS)或片段被修饰为类似物或拟肽(例如，本文中所描述的)。融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶、片段或类似物可以被酰胺化、乙酰化或两者。此种修饰可以在肽或酶的氨基或羧基末端。融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶、片段或类似物可以为多聚体形式，例如二聚体形式(例如，由半胱氨酸残基的二硫键形成)。

在某些实施方式中，靶向部分、溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物具有：有至少一个氨基酸替换(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个替换)、插入或缺失的本文所描述的氨基酸序列。肽可以含有例如1至12、1至10、1至5或1至3个氨基酸替换，例如1至10(例如，至9、8、7、6、5、4、3、2)个氨基酸替换。一个或多个氨基酸替换可以是保守的或非保守的。例如，靶向部分可以在对应于任何SEQ ID NO:1、血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5、血管肽素-6和血管肽素-7的氨基酸序列的位置1、10和15位的一个、两个或三个位置上具有精氨酸。

在任何上述方面，化合物可以明确排除包括或由SEQ ID NO:1-105和107-117组成的肽(例如，血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5、血管肽素-6和血管肽素-7)。在一些实施方式中，本发明肽排除SEQ ID NO:102、103、104和105的肽。

在任何上述方面中，接头(X)可以是本领域内或本文中描述的任何接头。在具体实施方式中，接头是共价键(例如，肽键)、化学连接剂(例如，本文中所描述的那些)、氨基酸或肽(例如，2、3、4、5、8、10或更多个氨基酸)。为避免疑义，化学连接剂除了非氨基酸部分之外还可以包括一个或多个氨基酸。

在某些实施方式中，接头具有式：

其中n是2至15的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)；且Y是A上的巯基而Z是B上的伯胺或Y是B上的巯基而Z是A上的伯胺。在某些实施方式中，接头是N-琥珀酰亚胺基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)接头或肼接头。接头可以通过游离胺、半胱氨酸侧链(例如，血管肽素-2-Cys或Cys-血管肽素-2的半胱氨酸侧链)或通过糖基化位点结合于(conjugated to)酶(例如，IDS)或靶向部分(例如，血管肽素-2)。

在某些实施方式中，化合物具有式：

其中，“Lys-NH”基团表示存在于酶中的赖氨酸或N-端或C-端的赖氨酸。在另一实例中，化合物具有结构：

其中，各个-NH-基团分别表示存在于靶向部分和酶上的伯氨基基团。在特定的实施方式中，酶可以是IDS或靶向部分可以是血管肽素-2。

在某些实施方式中，化合物是包括靶向部分(例如，血管肽素-2)和溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物的融合蛋白。

在某些实施方式中，接头是通过点击化学反应对的反应来形成的，其中点击化学反应是从由下列反应组成的组中选择的：炔基和叠氮基之间的惠斯更(Huisgen)1,3-偶极环加成反应以形成含三唑的接头；具有4π电子体系的二烯(例如，可选取代的1,3-不饱和化合物，如可选取代的1,3-丁二烯、1-甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-1,3-丁二烯、环戊二烯、环己二烯或呋喃)和具有2π电子体系(例如，可选取代的烯基或可选取代的炔基)的亲二烯体或杂亲二烯体之间的迪尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应；与亲核试剂和紧张的(strain)杂环亲电试剂的开环反应；以及与硫代磷酸酯基团和碘代基团的夹板连接反应；以及与醛基和氨基的还原胺化反应。在本发明的一个方面，点击化学反应是炔基和叠氮基之间的惠斯更1,3-偶极环加成反应。在此种实施方式中，炔基包括单氟环辛炔(MFCO)、二氟环辛炔(DFCO)、环辛炔(OCT)、二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔(BARAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)或二环[6.1.0]壬炔(BCN)。

在某些实施方式中，靶向部分可以在多肽的N-末端或C-末端使用叠氮基来衍生化使得叠氮基在点击化学反应中可以与炔衍生化的接头反应，从而将该靶向部分附接至接头。在更特定的实施方式中，血管肽素-2可以在多肽的N-末端或C-末端使用叠氮基来衍生化(可选地，在N-末端或C-末端的氨基酸侧链上)使得叠氮基在点击化学反应中可以与附接至酶的炔衍生化的接头反应，从而将血管肽素-2附接至接头和酶。

在另一方面，接头是马来酰亚胺基团或S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)基团。

在一个实施方式中，化合物包含通过含有BCN的接头连接至酶(例如，IDS、活性IDS片段或IDS类似物)的血管肽素-2。这种化合物可以具有以下的一般结构：

其中，R¹为：

其中n为1至6并且附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。当n为1时，化合物具有以下结构：

当n为2时，化合物具有以下结构：

在式IV和V的化合物中，附接至酶的一个或多个NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应并且R¹为：

本发明的特征还在于式III的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间(例如，1、1.2、1.5、2、2.4、2.5、2.8、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。更具体地，本发明的特征在于式III的化合物的群体，其中n的平均值在1和4之间。甚至更具体地，本发明的特征在于式III的化合物的群体，其中n的平均值为约1、约2.4或约3。

在某些实施方式中，式III的化合物中附接至酶的一个或多个NH基团来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。在式III的化合物的进一步实施方式中，附接至酶的一个或多个NH基团来源于赖氨基199和/或赖氨酸376(使用全长人类IDS同种型a的编号)的一个或多个伯氨基基团。

具有含有BCN的接头的化合物也可以具有以下结构：

其中R¹为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数并且其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。

本发明的特征在于式VI的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间(例如，1、1.5、2、2.3、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。更具体地，本发明的特征在于式VI的化合物的群体，其中n的平均值为约2.3。

在某些实施方式中，式VI的化合物中附接至酶的一个或多个NH基团来源于赖氨酸残基的一个或多个伯氨基基团。在化合物VI的进一步的实施方式中，附接至酶的一个或多个NH基团来源于赖氨酸199和/或赖氨酸479(使用全长人类IDS同种型a的编号)的一个或多个伯氨基基团。

在一个实施方式中，化合物包括经由含有MFCO的接头连接至IDS、活性IDS片段或活性IDS类似物的血管肽素-2。化合物可以具有以下一般结构：

其中R²为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数并且其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。

本发明的特征还在于式VII的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间(例如，1、1.5、2、2.3、2.5、2.6、3、3.5、4、4.2、4.4、4.5、5、5.3、5.5或6)。更具体地，本发明的特征在于式VII的化合物的群体，其中n的平均值为约2.3、约4.4或约5.0。

具有含有MFCO的接头的化合物可以具有以下结构：

其中R²为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数并且其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。

本发明的特征在于式VIII的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、4.8、4.9、5、5.5或6)。更具体地，本发明的特征在于式VIII的化合物的群体，其中n的平均值为约4.9。

在某些实施方式中，式VIII的化合物中附接至酶的一个或多个NH基团来源于赖氨酸残基的伯氨基基团。在化合物VIII的进一步的实施方式中，附接至酶的一个或多个NH基团来源于赖氨酸199、赖氨酸211和赖氨酸376(使用全长人类IDS同种型a的编号)的伯氨基基团的一个或多个。

在本发明的另一个实施方式中，化合物包括通过含有DBCO的接头连接至IDS、活性IDS片段或活性IDS类似物的血管肽素-2并且具有以下结构：

其中R³为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数并且其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。

本发明的特征在于式IX的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间(例如，1、1.3、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6)。更具体地，本发明的特征在于式IX的化合物的群体，其中n的平均值为约1.3。

本发明的特征还在于其中血管肽素-2-Cys经由含有马来酰亚胺的基团连接至IDS、活性片段或活性IDS类似物并且具有以下结构的化合物：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或活性类似物，其中n为经由接头附接至IDS的血管肽素-2部分的数目并且是1和6之间的整数，其中附接至An₂Cys的S部分表示血管肽素-2-Cys的中的半胱氨酸上的侧链硫化物，并且其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。

本发明的特征在于式X的化合物的群体，其中n的平均值在0.5和6之间(例如，0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。更具体地，本发明的特征在于式X的化合物的群体，其中n的平均值为约0.8。

在可替代的实施方式中，Cys-血管肽素-2经由含有马来酰亚胺的基团连接至IDS、活性片段或活性IDS类似物并且具有以下结构：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为经由接头附接至IDS的血管肽素-2部分的数目并且在1至6之间，其中Cys-An₂是Cys-血管肽素-2，附接至Cys-An₂的S部分表示Cys-血管肽素-2中的半胱氨酸上的侧链硫化物，并且其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应。

本发明的特征在于式XI的化合物的群体，其中n的平均值在0.5和6之间(例如，0.5、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。更具体来说，本发明的特征在于式XI的化合物的群体，其中n的平均值为约0.9。

在一个方面，接头是使用从由单氟环辛炔(MFCO)、二氟环辛炔(DFCO)、环辛炔(OCT)、二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔(BARAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)和二环[6.1.0]壬炔(BCN)组成的组中选择的炔基团官能化的含有马来酰亚胺的基团，并且炔-官能化的马来酰亚胺经由附接至血管肽素-2的叠氮基而附接至血管肽素-2。

在本发明的一个实施方式中，化合物包含经由S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)基团连接至IDS的血管肽素-2并且具有以下结构：

其中n为经由接头附接至IDS的血管肽素-2部分的数目并且在1至6之间，An₂是血管肽素-2，附接至An2的NH基团是血管肽素-2的N-末端氨基，并且附接至IDS的NH基团表示IDS中的伯氨基基团。本发明的特征在于包含式XII的化合物的组合物，其中n的平均值在1和6之间(例如，1、1.5、2、2.5、2.6、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

上述式III至XII的化合物可以具有经由接头附接至酶的1、2、3、4、5或6个肽靶向部分。在一个实施方式中，酶是人类全长IDS同种型a或人类成熟的IDS同种型a。

在另一方面，本发明的特征在于一群具有以下一般结构的化合物：

其中R²为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应并且其中n的平均值在1和6之间。在一些实施方式中，n的平均值在4.5和5.5之间。在其他实施方式中，n的平均值为约4.9。

在其他方面，本发明的特征在于一群具有以下一般结构的化合物：

其中R¹为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中附接至酶的NH基团来源于酶中的伯氨基基团的反应并且其中n的平均值在1和6之间。在一些实施方式中，n的平均值在2和3之间。在其他实施方式中，n的平均值为约2.3。

在进一步的方面，本发明的特征在于具有以下通式的化合物，其为本发明的化合物的制造中的中间体：

其中A为从由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、具有IDS活性的IDS片段或具有IDS活性的IDS类似物组成的组中选择的酶；附接至A的NH基团来源于A中的伯氨基基团的反应；n为1和8之间的整数；并且B为羟基、可选取代的C_1-10烷基、可选取代的C_1-10炔基、可选取代的炔基、可选取代的芳基、杂环、可选取代的C_1-10烷氧基、可选取代的C_1-10烷基氨基、可选取代的C_3-10环烷基、可选取代的C₄-₁₀环烯基、可选取代的C_4-10环炔基、氨基酸或2至5个氨基酸的肽。

在某些实施方式中，B为氨基酸、2至5个氨基酸的肽或者选自于：

在一些实施方式中，B为

在本发明的这些中间体的某些实施方式中，A通过赖氨酸的一个或多个侧链伯氨基基团的衍生化而被修饰。

当B为时，附接至A的一个或多个NH基团可以来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。更具体地，附接至A的一个或多个NH基团来源于赖氨酸199、赖氨酸240、赖氨酸295、赖氨酸347、赖氨酸479和赖氨酸483(使用全长人类IDS同种型a的编号)的伯氨基基团的一个或多个。在一个实施方式中，附接至A的一个或多个NH基团来源于赖氨酸199、赖氨酸479和赖氨酸483(使用IDS同种型a的编号)的伯氯基的一个或多个。

当B为时，附接至A的一个或多个NH基团可以来源于赖氨酸残基的伯氨基基团。更具体地，附接至A的NH基团来源于赖氨酸479(使用全长人类IDS同种型a的编号)。

本发明的某些中间体表现出比相应的未修饰的IDS、IDS片段或IDS类似物更高水平的IDS活性。

本发明的特征在于一种组合物，其包括结合至任何上述化合物的纳米颗粒。本发明的特征还在于任何上述特写的化合物的脂质体制剂。

本发明的特征在于一种药物组合物，其包括上述化合物的任一种以及药学上可接受的载体。本发明的特征还在于一种治疗或预防性治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法，其中该方法包括向受试者给予任何上述的化合物或组合物。在方法的一个方面，溶酶体贮积症是粘多糖贮积症II型(MSP-II)并且溶酶体酶是IDS、其活性片段或活性类似物。在方法的另一方面，受试者患有MPS-II的严重形式或MPS-II轻度形式。在方法的又另一方面，受试者具有神经系统症状。受试者可以在五岁以下，优选在三岁以下开始治疗。受试者可以是婴儿。本发明的方法还包括肠胃外给予本发明的化合物或组合物。

“受试者”是指人类或非人类动物(例如，哺乳动物)。

“溶酶体酶”是指在溶酶体中发现的任何酶，其中酶的缺陷可以导致溶酶体贮积症。

“溶酶体贮积症”是指由溶酶体酶的缺陷导致的任何疾病。已经确定了约五十种此种疾病。

“靶向部分”是指可以被运输至特定的细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾或肌肉)中、运输至特定的细胞区室(例如，溶酶体)中或穿过BBB的化合物或分子如肽或拟肽。在某些实施方式中，靶向部分可以结合至脑血管内皮细胞上存在的受体并由此通过转胞吞作用(transcytosis)而被运输穿过BBB。靶向部分可以是能够获得高水平的跨内皮运输而不会影响细胞或BBB完整性的分子。靶向部分可以是肽或拟肽并且可以是天然存在的或通过化学合成或基因重组技术产生的。

在受试者中“治疗”疾病、病症或病况是指通过向受试者给予治疗剂以减少疾病、病症或病况的至少一种症状。

在受试者中“预防性治疗”疾病、病症或病况是指在疾病症状发病之前向受试者给予治疗剂以减少疾病、病症或病况的发生频率或降低疾病、病症或病况的严重程度。

“有效地运输穿过BBB”的肽是指能够至少与血管肽素-6同样有效地穿过BBB(即，在2007年5月29日提交的美国专利申请号11/807,597中描述的原位脑灌注试验中，比血管肽素-1(250nM)的要大38.5％，该专利申请通过引用而并入本文)。因此，“不能有效地运输穿过BBB”的肽以较低的水平运输至脑(例如，不能如血管肽素-6那样的进行运输)。

“有效地输送至特定的细胞类型”的肽或化合物是指肽或化合物在细胞类型中能够积累(例如，由于向细胞中的增加运输、从细胞中的减少流出或由于它们的组合)至比对照物质或在结合物的情况下比未结合的试剂大至少10％(例如，25％、50％、100％、200％、500％、1,000％、5,000％或10,000％)的程度。此种活性在国际申请公开号WO 2007/009229中有详细描述，其通过引用而并入本文。

“基本的同一性”或“基本上同一于”是指肽、多肽或多核苷酸序列分别具有与参比序列相同的肽、多肽或多核苷酸序列，或者在将两个序列进行最佳对齐时，分别具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸与参比序列中相应位置的氨基酸残基或核苷酸相同。例如，“基本上同一于”参比序列的氨基酸序列与参比氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。对于肽或多肽，比较序列的长度一般为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个连续的氨基酸(例如，全长序列)。对于核酸，比较序列的长度一般为至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的核苷酸(例如，全长核苷酸序列)。可以使用序列分析软件在默认设置上来测量(例如，University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,WI 53705的遗传学计算机组的序列分析软件包)序列同一性。此种软件通过可对各种取代、缺失和其他修饰分配同源性程度而匹配相似的序列。

由下面的详细说明、附图和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是明显的。

附图说明

图1是示出产生的IDS构建体的示意图。

图2为示出来自使用抗-IDS抗体对用指示的构建体转染的CHO-S细胞的细胞培养基的免疫印迹的图像。

图3为示出用于检测下述实施例中的IDS活性的荧光测定法的示意图。

图4为示出来自用指示的构建体转染的CHO-S细胞的细胞培养基中的IDS活性的图表。

图5A为示出在使用所指示的构建体对CHO-S细胞转染后的七天期间的IDS活性的图表。

图5B为示出在七天的期间CHO-S细胞中IDS-His或IDS-An2-His的表达的一组免疫印迹图像。

图6A为示出在使用来自表达所指示的构建体的CHO-S细胞的培养基处理后MPS-II成纤维细胞中³⁵S-GAG积累的减少的图表。

图6B为示出在使用纯化的IDS-An2-His处理后MPS-II成纤维细胞中GAG积累的减少的图表。

图7A-图7C为IDS的同种型的序列(同种型a，图7A；同种型b，图7B；同种型c，图7C)。

图8为示出IDS(JR-032)和IDS-血管肽素-2结合物的考马斯亮蓝染色和免疫印迹检测的一组图表。

图9A-图9C为示出70-56-1B、70-56-2B和68-32-2结合物的MALDI-TOF分析的一组图表。

图10A示出了68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的SEC分析。

图10B示出了68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的SP分析。

图11为示出使用共聚焦显微镜测量Alexa 488标记的结合物的胞内运输的方案的示意图。

图12为示出相比于lysotracker染料，Alexa-标记的IDS(上图)和Alexa-标记的血管肽素-2-IDS(70-56-2B，下图)在U87细胞中的定位的一组共聚焦显微照片。在第4图中示出了16小时摄取后的共定位(合并)。在37℃下在50nM的浓度下将酶温育16小时。放大率为100X。

图13为示出相比于lysotracker染料，Alexa-标记的IDS(上图)和Alexa-标记的血管肽素-2-IDS(70-56-2B，下图)在U87细胞中的定位的一组共聚焦显微照片。在第4图中示出了缺乏共定位(合并)。在37℃下在100nM的浓度下将酶温育1小时。放大率为100X。

图14为示出相比于lysotracker染料，Alexa-标记的IDS(上图)和Alexa-标记的血管肽素-2-IDS(70-56-2B，下图)在U87细胞中的定位的一组共聚焦显微照片。在第4图中以黄色示出了共定位(合并)。在37℃下在100nM的浓度下将酶温育16小时。放大率为100X。

图15为示出相比于lysotracker染料，Alexa-标记的IDS和Alexa-标记的血管肽素-2-IDS(70-56-1B)在U87细胞中的定位的共聚焦显微照片。在37℃下在50nM的浓度下将酶温育过夜。放大率为100X。右图为左图的缩放版。

图16为示出Alexa-标记的IDS和Alexa488标记的An2-IDS结合物：68-32-2、70-66-1B、70-56-2B和68-27-3在U-87细胞中的摄取和定位的一组共聚焦显微照片。

图17A和图17B为示出在1小时和16小时内Alexa488-IDS和Alexa488-An2-IDS(70-56-2B)被U87细胞摄取的图表。

图18和图19为示出血管肽素-2-IDS结合物显示了增加的向U87细胞中的摄取并且增加血管肽素-2-IDS结合物的掺入比与增加的向细胞中的摄取相关的图表。

图20A为示出与JR-032相比IDS-血管肽素-2结合物的酶活性的图表。酶活性表示为％JR-032对照。对于结合物，测定的数目在4和8之间，对于JR-032，每个棒均为15次测定的平均值。

图20B为示出大规模合成的结合物70-56-2B、70-66-1B和68-32-2与JR-032相比的酶活性的图表。

图21为示出在使用未结合的JR-032或个体结合物(4ng/ml)处理的MPSII患者成纤维细胞中测量的GAG浓度的图表。GAG水平表示为健康患者成纤维细胞中测定的GAG的％。

图22为示出血管肽素-2-IDS结合物以与未结合的JR-032类似的效力降低MPSII成纤维细胞中的GAG浓度的图表。在使用不同浓度的JR-032和三个结合物处理的MPSII患者成纤维细胞中测量GAG浓度。GAG水平表示为在健康患者成纤维细胞中测量的GAG的％。

图23为示出在单一时间点(2分钟)未结合的JR-032和15个结合物各自的脑分布的图表。除非指定为C-末端，否则所有的接头均通过N-末端附接而连接至An2。

图24A和图24B为示出JR-032在脑的不同部分中的分布的图表。

图24C和图24D为比较An2-IDS结合物与未结合的JR-032的K_in和脑分布的图表。

图25为比较JR-032和菊粉的脑摄取和分布的图表。

图26为比较大规模合成的70-56-2B、70-66-1B和68-32-2在全脑、毛细血管及实质中的脑分布的图表。

图27A-图27C示出了放射性标记的JR-032和An2IDS结合物的血浆浓度时间曲线。

图28A-图28C示出了在1小时、8小时和48小时，放射性标记的JR-032和An2-IDS结合物在组织中的浓度。

图29示出了放射性标记的JR-032和An2-IDS结合物在脑中的浓度。

图30示出了与JR-032相比，在给药1小时后和给药8小时后，结合物在脑、心脏、肝、肺、肾(皮质)、肌肉(腿外展肌)、皮肤、骨(股骨，包括骨髓)和脾脏中的浓度。

图31示出了在0.5小时、1小时、4小时和24小时JR-032、70-66-1B和68-32-2在血浆、脑、肝和甲状腺中的浓度。

图32A和图32B示出了JR-032、ANG3402和ANG3403在来自PK分布实验的肝脏样品中的加工。

图33示出了JR-032、ANG3402和ANG3403在MPS II成纤维细胞中的加工。

图34示出了JR-032、ANG3402和ANG3403在血浆中的加工。

图35A-图35C为示出给予有媒介物(vehicle)、JR-032或An2-IDS结合物的半合子基因敲除小鼠的肝脏、心脏和大脑中的GAG浓度的图表。

图36为示出每种结合物在每个剂量下的GAG降低的图表(表示为由JR-032实现的降低的百分比)。

具体实施方式

本发明涉及化合物，其包括经由接头(例如，肽键)连接的溶酶体酶(例如，IDS)和靶向部分(例如，血管肽素-2)。靶向部分能够将酶运输至溶酶体和/或穿过BBB。此种化合物的例示为血管肽素-2-IDS结合物或融合蛋白。这些蛋白质在酶法测定中和在MPS-II的细胞模型中均保持了IDS酶活性。因为靶向部分如血管肽素-2能够将蛋白质运输穿过BBB，因此这些结合物预期不仅具有外周活性，而且也具有在中枢神经系统(CNS)中的活性。此外，靶向部分如血管肽素-2由受体介导的传输机制(如LRP-1)被细胞摄取至溶酶体。因此，我们相信，这些靶向部分可以提高酶在溶酶体中的浓度，由此产生更有效的治疗，特别是在表达LRP-受体的组织和器官如肝、肾和脾中。

这些特征克服了现行治疗方法的一些最大的缺点，因为通过静脉给予IDS本身不能治疗CNS疾病症状。与高度侵入性且因此通常对CNS递送问题不具有吸引力的解决方案的绕过BBB的物理方法(如鞘内或颅内给予)相反，本发明使得能够非侵入性脑递送。此外，与标准的替代疗法相比，治疗剂向溶酶体的改进的运输使得能够降低给药剂量或降低给药频次。

溶酶体贮积症

溶酶体贮积症是一组其中脂质、糖蛋白或粘多糖的代谢基于酶功能障碍而被中断的病症。这种功能障碍导致不能正常代谢的物质的细胞积累。症状随不同的疾病而不同，但是在许多疾病中存在器官系统(肝、心、肺、脾)的问题、骨的问题以及神经问题。典型地，这些疾病是由于相关酶的罕见遗传缺陷所引起的。这些疾病的大多数是以常染色体隐性遗传方式来遗传的，但是一些如MPS-II是X-连锁隐性遗传疾病。

溶酶体酶

本发明可以使用本领域中公知的有用于治疗溶酶体贮积症的任何溶酶体酶。本发明的化合物的示例是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS；也称为艾杜硫酸酯酶)。化合物可以包括IDS、保留有酶活性的IDS的片段或IDS类似物，该IDS类似物可以包括基本上同一于(例如，至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％同一)于人类IDS序列并且保留有酶活性的氨基酸序列。

已知有三种IDS的同种型，同种型a、b和c。同种型a为550个氨基酸的蛋白质并且示于图7A中。同种型b(图7B)为343个氨基酸的蛋白质，其相比于更长的同种型a而言具有不同的C-末端区。同种型c(图7C)由于下游起始密码子的使用而具有N-末端的改变。这些同种型的任何一种均可以用在本发明的化合物中。

重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶酶类(例如，JR-032)在本领域中是公知的。JR-032是一种按照美国专利号5,932,211中的描述而制造的重组人类IDS全长同种型a(INN：艾杜硫酸酯酶)。

为了测试特定的片段或类似物是否具有酶活性，本领域技术人员可以使用任何适合的测定法。用于测量IDS活性的测定法是本领域中公知的，例如包括Hopwood,Carbohydr.Res.69:203-16,1979,Bielicki et al.,Biochem.J.271:75-86,1990和Dean et al.,Clin.Chem.52:643-9,2006中描述的那些。以下还描述了类似的荧光分析。使用这些测定法的任何一种，本领域技术人员均能够确定特定的IDS片段或类似物是否具有酶活性。这些测定法还可以识别本发明的化合物是否具有酶活性。

在某些实施方式中，使用了酶片段(例如，IDS片段)。IDS片段在长度上可以为至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、或500个氨基酸。在某些实施方式中，酶可以例如使用本文所描述的任何多肽修饰来进行修饰。

靶向部分

本发明的化合物可以特征在于本文所描述的靶向部分的任何一种，例如表1中描述的肽(例如，血管肽素-1、血管肽素-2或反向的血管肽素-2)或它们的片段或拟肽的任何一种。在某些实施方式中，肽与本文所描述的肽可以具有至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％的同一性。多肽相对于本文所描述的序列之一可以具有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)个替换。以下更加详细地描述了其他修饰。

本发明的特征还在于这些肽或拟肽的片段(例如，功能片段)。在某些实施方式中，片段能够被有效地运输至特定的细胞类型或积累在特定的细胞类型(例如，肝、肺、肾、眼或脾)中或被有效地运输穿过BBB。肽或拟肽的截短物可以是来自肽的N-末端、肽的C-末端或它们的组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸。其他片段包括其中缺失了肽或拟肽的内部部分的序列。

通过使用本文所描述的测定法或方法之一可以确定另外的肽或拟肽。例如，候选肽或拟肽可以通过常规肽合成来产生、与紫杉醇结合并且给予至实验动物。例如，可以基于其增加注射有肿瘤细胞并使用结合物治疗的动物相对于未使用结合物治疗的对照动物(例如，使用未结合的试剂来治疗)的存活能力来识别生物活性的结合物。作为另一个实例，可以基于其在原位脑灌注法中在实质细胞中的定位来识别生物活性的肽或拟肽。

也可以进行确定在其他组织中的积累的测定。可以将肽或拟肽的标记的结合物给予到动物中并且测量在不同器官中的积累。例如，将肽或拟肽结合至可检测的标记物(例如，近-IR荧光光谱标记物，如Cy5.5)允许实时在体内可视化。可以将此类肽或拟肽给予到动物中，并且可以检测到肽或拟肽在器官中的存在，由此能够确定肽或拟肽在期望的器官中积累的速率和量。在其他实施方式中，可以使用放射性同位素(例如，¹²⁵I)来标记肽或拟肽。然后可以将肽或拟肽给予至动物。在一段时间之后，将动物处死并且提取器官。然后可以使用本领域公知的任何方法来测量放射性同位素在各个器官中的量。通过比较特定器官中所标记的候选肽或拟肽的量相对于标记的对照肽或拟肽的量，可以确定候选肽或拟肽接近并在特定组织中积累的能力。适合的阴性对照包括已知不能有效地被运输至特定细胞类型中的任何肽或多肽(例如，与不能穿过BBB的血管肽素相关的肽或任何其他肽)。

另外的序列描述于美国专利号5,807,980(例如，本文中的SEQ IDNO:102)、5,780,265(例如，SEQ ID NO:103)、5,118,668(例如，SEQ IDNO:105)。编码抑肽酶类似物的示例性的核苷酸序列为atgagaccag atttctgcctcgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctgtgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgcgtacttgcgg tggtgcttag；SEQ ID NO:106；Genbank登录号X04666)。抑肽酶类似物的其他实例可以通过使用国际申请号PCT/CA2004/000011中公开的合成的抑肽酶序列(或其部分)来进行蛋白质BLAST(Genbank:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)来找到。通过登录号CAA37967(GI:58005)和1405218C(GI:3604747)也能找到示例的抑肽酶类似物。

修饰的多肽

本发明中使用的融合蛋白、靶向部分和溶酶体酶或片段可以具有经修饰的氨基酸序列并且可以是类似物或拟肽。在某些实施方式中，修饰不显著地破坏所需的生物活性(例如，穿过BBB的能力或酶活性)。修饰可能降低(例如，至少5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％)、可能不会影响或可能提高(例如，至少5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％或1000％)原始多肽的生物活性。修饰可能具有或可能优化合物、融合蛋白、靶向部分、溶酶体酶或片段的特性，如体内稳定性、生物利用度、毒性、免疫活性、免疫性同一性和结合性能方面。

修饰包括通过自然过程的那些如翻译后加工，或者通过本领域中公知的化学修饰技术。修饰可以出现有(多)肽中的任何位置，包括(多)肽骨架、氨基酸侧链或氨基末端或羧基末端。在给定(多)肽的多个位点可以相同或不同程度的存在同种类型的修饰，并且(多)肽可以含有多于一种类型的修饰。(多)肽可以由于泛素化而支化，并且它们可以是环状的、有或没有分支的。环状的、支化的以及支化环状的(多)肽可以由翻译后天然加工来产生的或可以合成制得。其他修饰包括聚乙二醇化、乙酰化、酰化、添加乙酰氨基甲基(acetomidomethyl)(Acm)基团、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、甲氨酰化、羧乙基化、酯化、共价附接至黄素、共价附接至血红素部分、共价附接核苷酸或核苷酸衍生物、共价附接药物、共价附接标志物(例如，荧光或放射性的)、共价附接脂质或脂质衍生物、共价附接磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加如精氨酰化和泛素化。

经修饰的(多)肽在多肽序列中还可以包括氨基酸插入、缺失或保守或非保守的替换(例如D-氨基酸、脱氨基酸)(例如，其中此种变化基本上不会改变(多)肽的生物活性)。特别地，向本发明的(多)肽的任一者的氨基或羧基末端添加一个或多个半胱氨酸残基可以促进这些(多)肽通过例如二硫键的结合。例如，血管肽素-1(SEQ ID NO:67)、血管肽素-2(SEQ ID NO:97)或血管肽素-7(SEQ ID NO:112)可以被修饰以在氨基末端包括单个半胱氨酸残基(分别为SEQ ID NO:71、113和115)或在羧基末端包括单个半胱氨酸残基(分别为SEQ ID NO:72、114和116)。氨基酸替换可以是保守的(即，其中残基被另一个相同一般类型或组的残基替换)或非保守的(即，其中残基被另一种类型的氨基酸替换)。此外，非天然存在的氨基酸可以替换天然存在的氨基酸(即，非天然存在的保守氨基酸替换或非天然存在的非保守氨基酸替换)。

合成制得的(多)肽可以包括不是由DNA天然编码的氨基酸替换(例如，非天然存在的或非天然的氨基酸)。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有附接至半胱氨酸的硫原子的乙酰基氨基甲基基团的氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、式NH₂(CH₂)_nCOOH的ω氨基酸(其中n为2至6)、中性非极性氨基酸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可以替换Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和蛋氨酸亚砜是中性非极性的，半胱氨酸是酸性的，且鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以替换为羟脯氨酸并且保留构象赋予特性。

类似物或拟肽可以通过替换诱变来产生并且保留原始(多)肽的生物活性。确定为“保守替换”的替换的实例示于表2中。如果此种替换产生了不期望的改变，那么引入表2中命名为“示例性替换”的或本文参照氨基酸类别进一步描述的其他类型的替换并且对产物进行筛选。

通过选择在维持(a)在替换的区域中的(多)肽骨架的结构，例如，作为片或螺旋构象；(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积(bulk)的效果上显著不同的替换，来完成功能或免疫同一性的实质性修饰。基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为以下组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)，

(2)中性亲水性的：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)

(3)酸性/带负电荷的：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)

(4)碱性的：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)

(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；

(6)芳香族的：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)，

(7)极性的：Ser、Thr、Asn、Gln

(8)碱性带正电荷的：Arg、Lys、His，和；

(9)带电荷的：Asp、Glu、Arg、Lys、His

表2中列出了其他氨基酸替换。

表2：氨基酸替换

原始残基	示例性的替换	保守替换
			Ala(A)	Val、Leu、Ile	Val
Arg(R)	Lys、Gln、Asn	Lys
			Asn(N)	Gln、His、Lys、Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu

原始残基	示例性的替换	保守替换
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro	Pro
			His(H)	Asn、Gln、Lys、Arg	Arg
Ile(I)	Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe	Ile
Lys(K)	Arg、Gln、Asn	Arg
			Met(M)	Leu、Phe、Ile	Leu
Phe(F)	Leu、Val、Ile、Ala	Leu
			Pro(P)	Gly	Gly
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr
			Tyr(Y)	Trp、Phe、Thr、Ser	Phe
Val(V)	Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸	Leu

多肽衍生物和拟肽

除了由天然存在的氨基酸组成(多)肽之外，拟肽或(多)肽类似物也被包括在本发明中并且可以形成本发明的化合物中使用的融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶、酶片段或酶类似物。(多)肽类似物通常作为具有类似于模板多肽的性质的非肽类药物用于制药工业中。非肽类化合物称为“肽模似物”或拟肽(Fauchere et al.,Infect.Immun.54:283-287,1986and Evans et al.,J.Med.Chem.30:1229-1239,1987)。在结构上与治疗上有用的肽或多肽相关的肽模拟物可以用来产生等效或增强的治疗或预防效果。一般而言，拟肽在结构上类似于范例(多)肽(即，具有生物或药理活性的(多)肽)，如天然存在的受体结合(多)肽，但是其一个或多个肽连接(键，linkage)通过本领域众所周知的方法可选地被替换为连接如–CH₂NH–、–CH₂S–、–CH₂–CH₂–、–CH＝CH–(顺式和反式)、–CH₂SO–、–CH(OH)CH₂–、–COCH₂–等(Spatola,Peptide Backbone Modifications,Vega Data,1:267,1983；Spatola et al.,LifeSci.38:1243-1249,1986；Hudson et al.,Int.J.Pept.Res.14:177-185,1979；和Weinstein,1983,Chemistry and Biochemistry,of Amino Acids,Peptidesand Proteins,Weinstein编,Marcel Dekker,New York)。此种拟肽相对于天然存在的(多)肽可具有显著的优势，包括更经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理学性质(例如，半衰期、吸收、效力、效率)、抗原性降低等。

虽然本文所描述的肽靶向部分可以有效地穿过BBB或靶向特定的细胞类型(例如，本文中描述的那些)，但是它们的有效性会由于蛋白酶类的存在而降低。同样地，在本发明的化合物中使用的溶酶体酶或酶片段的有效性也类似地会被降低。血清蛋白酶具有特异性底物要求，包括L-氨基酸和用于裂解的肽键。另外，代表血清中蛋白酶活性的最突出的部分的外肽酶通常作用于多肽的第一肽键且需要游离的N-末端(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。鉴于此，往往有利地是使用修饰版本的靶向肽酶或酶片段。拟肽或类似物保留了原始L-氨基酸(多)肽的结构特性，但有利地是不能容易地被蛋白酶和/或外肽酶裂解。

使用相同类型的D-氨基酸对共有序列中的一个或多个氨基酸的系统替换(例如，对映异构体；D-赖氨酸替换L-赖氨酸)可以用来产生更稳定的(多)肽。因此，本文所描述的(多)肽衍生物、类似物或拟肽可以是完全的L-多肽、完全的D-多肽或者混合的D、L多肽。由于肽酶不能利用D-氨基酸作为底物，所以N-末端或C-末端D-氨基酸的存在增加了(多)肽的体内稳定性(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。反向的-D(多)肽是相对于含有L-氨基酸的(多)肽以反向序列布置的、含有D-氨基酸的(多)肽。因此，L-氨基酸(多)肽的C-末端残基成为D-氨基酸(多)肽的N-末端，诸如此类。反向D-(多)肽可以保留与L-氨基酸多肽相同的三级构象并因此保留相同的活性，但是对体外和体内的酶降解更加稳定，并因此具有比原始(多)肽更大的疗效(Brady and Dodson,Nature 368:692-693,1994和Jameson etal.,Nature 368:744-746,1994)。除了反向-D-(多)肽之外，可以通过本领域中公知的方法产生包含共有序列或基本同一的共有序列变体的约束(多)肽(Rizo et al.,Ann.Rev.Biochem.61:387-418,1992)。例如，可以通过添加能够形成二硫键的半胱氨酸残基来产生约束(多)肽并由此产生环状(多)肽。环状(多)肽不具有游离N-末端或C-末端。因此，虽然它们不对外肽酶的蛋白质水解不敏感，但是它们当然地对不切割(多)肽末端的内肽酶敏感。分别除了存在的N-末端或C-末端氨基酸残基或它们的环状结构之外，具有N-末端或C-末端D-氨基酸的(多)肽的氨基酸序列或环状的(多)肽的氨基酸序列通常同一于它们所对应的(多)肽的序列。

可以通过常规的固相合成的同时在选择用于环化的位置如氨基或羧基末端掺入适合的S-保护的半胱氨酸或半胱氨酸残基来制备含有分子内二硫键的环状衍生物(Sah et al.,J.Pharm.Pharmacol.48:197,1996)。在完成链组装之后，可以(1)通过选择性除去S-保护基团，接着进行载体上(on-support)氧化相应的两个游离SH-功能基以形成S-S键，随后进行产物从载体上的常规移除和适合的纯化工序，或者(2)通过随着完成侧链脱保护的同时从载体上移除多肽，随后在高度稀释的水溶液中氧化游离的SH-官能团，从而进行环化。

可以通过常规固相合成的同时在选择用于环化的位置上掺入适合的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物来制备含有分子内酰胺键的环状衍生物。可以通过常规固相化学的同时在选择用于环化的位置掺入具有适合的氨基保护的侧链和适合的S-保护的半胱氨酸或半胱氨酸残基的氨基酸残基来制备含有分子内-S-烷基键的环状衍生物。

用于赋予对作用于(多)肽的N-末端或C-末端的肽酶的耐性的另一种有效的方法是在多肽末端添加化学基团使得经修饰的(多)肽不再是肽酶的底物。一种此类化学修饰是在任一末端或两个末端对(多)肽的糖基化。已经证明，某些化学修饰，特别是N-末端糖基化提高了(多)肽在人类血清中的稳定性(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。增强血清稳定性的其他化学修饰包括但不限于添加由1至20个碳的低级烷基组成的N-末端烷基(如乙酰基)和/或添加C-末端酰胺基或被取代的酰胺基。特别地，本发明包括由携带有N-末端乙酰基和/或C-末端酰胺基的多肽组成的经修饰的(多)肽。

本发明还包括的是其他类型的(多)肽衍生物、类似物或拟肽，其含有通常不是(多)肽的一部分的另外的化学部分，条件是衍生物、类似物或拟肽保留有(多)肽的期望的功能活性。此类衍生物、类似物或拟肽的实例包括(1)氨基末端或另一个游离氨基的N-酰基衍生物，其中酰基可以是烷酰基(例如，乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基(例如，苯甲酰基)或阻断基团，如F-moc(芴基甲基-O–CO–)；(2)羧基末端或另一个游离羧基或羟基的酯；(3)通过与氨或适合的胺反应产生的羧基末端或另一个游离羧基的酰胺；(4)磷酸化衍生物；(5)结合至抗体或其他生物学配体的衍生物以及其他类型的衍生物。

由向本文所描述的多肽添加另外的氨基酸残基产生的更长的(多)肽序列也被包括在本发明中。可以预期此种更长的多肽序列具有与上文所描述的多肽相同的生物活性以及特异性(例如，细胞嗜性)。虽然不排除具有相当数量的另外的氨基酸的多肽，但应当认识到的是，可以设想一些大的多肽具有能够掩蔽有效序列的构型，由此阻止了与靶(例如，LRP受体家庭的成员)的结合。这些衍生物可以作为竞争性拮抗剂。因此，虽然本发明包含本文所描述的具有延伸(extension)的多肽或多肽的衍生物，但可取的是延伸不会破坏化合物的细胞靶向活性或酶活性。

本发明中包括的其他衍生物是由本文所描述的两个相同的多肽或两个不同的多肽直接彼此共价连接或通过间隔子如通过一段短的丙氨酸残基或通过假定的用于蛋白水解(例如，通过组织蛋白酶，参见例如，美国专利号5,126,249和欧洲专利号495049)的位点彼此共价连接而组成的双元多肽。本文所描述的多肽的多聚体由相同或不同的多肽或其衍生物形成的分子的聚合物组成的。

本发明还包括多肽衍生物，其是含有本文所描述的多肽或其片段的嵌合蛋白或融合蛋白，多肽或其片段以其氨基或羧基末端或两者连接至不同的蛋白质的氨基酸序列。可以通过编码蛋白质的核酸的重组表达来产生此种嵌合蛋白或融合蛋白。例如，嵌合蛋白或融合蛋白可以含有至少6个与所描述的多肽之一共享的氨基酸，理想的是这将产生具有相当或更高功能活性的嵌合蛋白或融合蛋白。

鉴别拟肽的测定

如上的，产生用于复制本文所描述的多肽的骨干几何形状和药效团展示(拟肽)的非肽基化合物往往具有更高的代谢稳定性、更高的效力、作用持续时间较长且更好的生物利用度的属性。

可以使用本领域中已知的组合文库方法中的多种方法的任何一种来获得拟肽化合物，组合文库方法包括生物文库、空间可寻址平行固相或溶液相文库、需要去卷积的合成文库法、“一珠一化合物”文库法、以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法局限于肽文库，而其他四种方法可适用于肽、非肽类寡聚物或化合物的小分子文库(Lam,AnticancerDrug Des.12:145,1997)。可以在本领域中找到用于合成分子文库的方法的实例，例如，在：DeWitt et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909,1993)；Erb et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422,1994)；Zuckermann et al.(J.Med.Chem.37:2678,1994)；Cho et al.(Science 261:1303,1993)；Carell etal.(Angew.Chem,Int.Ed.Engl.33:2059,1994和ibid 2061)；以及在Gallop etal.(Med.Chem.37:1233,1994)中找到。化合物的文库可以存在于溶液中(例如，Houghten,Biotechniques 13:412-421,1992)和在珠上(Lam,Nature354:82-84,1991)、芯片上(Fodor,Nature 364:555-556,1993)、细菌或孢子上(美国专利号5,223,409)、质粒上(Cull et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-1869,1992)或在噬菌体上(Scott和Smith,Science 249:386-390,1990)或荧光素酶上、以及在通过将适当的底物转化为产物的测定所检测的酶标记物上。

一旦确定了本文所描述的多肽，即可以通过任何数量的标准方法或通过用于纯化肽、拟肽或蛋白质的任何其他标准技术来将其分离并纯化，标准方法包括但不限于溶解度差(例如，沉淀)、离心分离、色谱法(例如，亲和力、离子交换和尺寸排阻)。可以使用本领域中公知的任何功能检测定法来评价所确定的目标多肽的功能特性。理想的是，使用用于评价细胞内信号转导的下游受体功能的测定法(例如，细胞增殖)。

例如，可以使用以下三阶段方法来获得本发明的拟肽化合物：(1)扫描本文所描述的多肽以确定用于靶向本文所描述的特定细胞类型所需的二级结构；(2)使用构象约束的二肽替代物(surrogate)来精制骨架几何结构并且提供对应于这些替代物的有机平台；和(3)使用最佳的有机平台来展示设计用于模拟所需要的天然多肽的活性的候选文库中的有机药效团。更详细地说，三阶段如下。在阶段1中，扫描前导候选多肽并且删节它们的结构以确定它们活性的需求。合成原始的一系列多肽类似物。在阶段2中，使用构象约束的二肽替代物来研究最佳的多肽类似物。使用吲嗪啶-2-酮(indolizidin-2-one)、吲嗪啶-9-酮和喹嗪酮(quinolizidinone)氨基酸(分别为I²aa、I⁹aa和Qaa)作为平台以研究最佳肽候选物的骨架几何结构。可以在多肽的特定区域引入这些及相关平台(Halab et al.,Biopolymers 55:101-122,2000和Hanessian et al.,Tetrahedron 53:12789-12854,1997的综述)以定向在不同方向上的药效团。这些类似物的生物评价识别出模拟了活性几何需求的改善的前导多肽。在阶段3中，将来自最具活性的前导多肽的平台用于表现担负天然肽的活性的药效团的有机替代物。以平行合成格式组合药效团和支架。可以通过使用本领域中公知的方法的其他方法来完成多肽的衍生化和上述阶段。

由本文所描述的多肽、多肽衍生物、拟肽或其他小分子确定的结构功能关系可以用来精制和制备具有类似或更好性能的类似分子结构。因此，本发明的化合物也包括共享有本文所描述的多肽的结构、极性、电荷特性和侧链特性的分子。

总之，基于本文所公开的内容，本领域技术人员能够开发出有用于识别用于将药剂靶向特定分子类型(例如，本文所描述的那些)的化合物的肽和拟肽筛选测定法。本发明的测定法可以开发用于低通量、高通量或超高通量筛选格式。本发明的测定法包括易于自动化的测定法。

接头

溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物可以直接(例如，通过共价键如肽键)或可以经由接头而结合至靶向部分。接头包括化学连接剂(例如，可裂解的接头)和肽。

在一些实施方式中，接头上化学连接剂。溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物与靶向部分可以通过巯基、氨基(胺)和/或糖类或任何适当的反应性基团来结合。可以从许多商业来源获得同型双官能和异双官能交联剂(结合剂)。可以在本发明的多肽上找到可用于交联的区域。交联剂可以包括柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。示例性的交联剂包括BS3([辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯]；BS3是靶向可接近的伯胺的同型双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酸亚胺和N-乙基-’(二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC允许伯胺基团与羧基的结合)、磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS为对巯基和氨基具有反应性的异型双官能反应性基团(马来酰亚胺和NHS-酯))、酰肼(大多数蛋白质含有暴露的糖类并且酰肼是一种有用的用于将羧基连接至伯胺的试剂)和SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA对对胺类具有反应性并且添加受保护的巯基基团)。

为了形成共价键，在羟基部分为生理学上可接受的情况下，可以所需的水平使用各种活性羧基(例如酯)作为化学反应性基团来修饰肽。特定的试剂包括N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酸亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酸亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酸亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。

伯胺是NHS酯的主要靶。可接近的存在于蛋白质的N-末端上的α-胺基以及赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯结合反应与释放伯胺的N-羟基琥珀酸亚胺反应时，形成酰胺键。在本文中将这些含有琥珀酸亚胺的反应性基团称为琥珀酰亚胺基基团。在本发明的某些实施方式中，蛋白质上的官能团将会是硫醇基(thiol)且化学反应性基团将会是含有马来酰亚胺基的基团，如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺基的基团在本文中称为马来酰亚胺基基团(maleido group)。

马来酰亚胺基在反应混合物的pH为6.5至7.4时，对于肽上的巯基(sulfhydryl)最具选择性。在pH 7.0时，马来酰亚胺基与巯基(例如，蛋白质如血清清蛋白或IgG上的硫醇基)的反应速度比与胺的反应速度快1000倍。因此可以在马来酰亚胺基与巯基之间形成稳定的硫醚键。

在其他实施方式中，接头包括至少一个氨基酸(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在某些实施方式中，接头为单个氨基酸(例如，任何天然存在的氨基酸，如Cys)。在其他实施方式中，使用了富含甘氨酸的肽，如具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n的肽，其中n为1、2、3、4、5或6，如美国专利号7,271,149中所描述的。在其他实施方式中，使用了富含丝氨酸的肽接头，如美国专利号5,525,491中所描述的。富含丝氨酸的肽接头包括式[X-X-X-X-Gly]_y的那些，其中多至两个X为Thr，并且剩余的X为Ser，并且y为1至5(例如，Ser-Ser-Ser-Ser-Gly，其中y大于1)。在某些情况下，接头是单个氨基酸(例如，任何氨基酸，如Gly或Cys)。其他接头包括刚性接头(例如，PAPAP和(PT)_nP，其中n为2、3、4、5、6或7)和α-螺旋接头(例如，A(EAAAK)_nA，其中n为1、2、3、4或5)。

适合的接头的实例为琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽如Gly-Lys。当接头为琥珀酸时，其一个羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而其另一个羧基可以例如与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当接头为Lys、Glu或Asp，其羧基可以与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，并且其氨基可以例如与取代基的羧基形成酰胺键。当将Lys用作接头时，可以在Lys的ε-氨基与取代基之间插入另外的接头。在一个特定的实施方式中，另外的接头为琥珀酸，其例如与Lys的ε-氨基并与取代基上存在的氨基形成酰胺键。在一个实施方式中，另外的接头为Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键并且与取代基中存在的羧基形成另一个酰胺键)，即，取代基是N^ε-酰基化的赖氨酸残基。

点击化学接头

在特定的实施方式中，接头是通过点击化学反应对之间的反应来形成的。点击化学反应对是指一对反应性基团，它们以高产率和高热力学增益参与模块化反应，从而产生点击化学接头。在这种实施方式中，反应性基团的一个附接至酶部分而中一个反应性基团附接至靶向多肽。示例性的反应和点击化学对包括：炔基和叠氮基之间的惠斯更1,3-偶极环加成反应以形成含有三唑的接头；具有4π电子体系的二烯(例如，可选取代的1,3-不饱和化合物，如可选取代的1,3-丁二烯、1-甲氧基-3-三甲基甲硅烷基氧基-1,3-丁二烯、环戊二烯、环己二烯或呋喃)和具有2π电子体系(例如，可选取代的烯基或可选取代的炔基)的亲二烯体或杂亲二烯体之间的迪尔斯-阿尔德反应；与亲核试剂和紧张的杂环亲电试剂的开环反应；与硫代磷酸酯基和碘代基团的夹板连接反应；以及与醛基和氨基的还原胺化反应(Kolbet al.,Angew.Chem.Int.Ed.,40:2004-2021(2001)；Van der Eycken et al.,QSAR Comb.Sci.,26:1115-1326(2007))。

在本发明的特定实施方式中，通过炔基和叠氮基点击化学对之间的反应形成的含三唑的接头将多肽连接至酶部分。在此种情况下，叠氮基可附接至多肽而炔基可附接至酶部分。可替代地，叠氮基可附接至酶部分而炔基可以附接至多肽。在某些实施方式中，叠氮基和炔基之间的反应是未催化的，并且在其他实施方式中，反应是由铜(I)催化剂(例如，碘化铜(I))、在还原剂的存在下的铜(II)催化剂(例如，硫酸铜(II)或乙酸铜(II)与抗坏血酸钠)或含有钌的催化剂(例如，Cp*RuCl(PPh₃)₂或Cp*RuCl(COD))来催化的。

示例性的接头包括含有单氟环辛炔(MFCO)、二氟环辛炔(DFCO)、环辛炔(OCT)、二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔(BARAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)和二环[6.1.0]壬炔(BCN)的接头。

溶酶体贮积症的治疗

本发明的特征还在于用于治疗溶酶体贮积症如MPS-II的方法。MPS-II的特征在于糖胺聚糖(GAG)的细胞积累，这是由于个体不能分解这些产物造成的。

在某些实施方式中，治疗是在已确诊为在IDS基因中存在变异但是还没有疾病症状的受试者上进行的(例如，婴儿或2岁以下的受试者)。在其他实施方式中，治疗是在具有至少一个MPS-II症状(例如，任何本文所描述的那些症状)的个体上进行的。

MPS-II一般分为两大组：重度疾病和减弱的疾病。本发明可涉及治疗患有任一类型的疾病的受试者。重度疾病的特征在于CNS受累。在重度疾病中，认知能力下降，再加上呼吸道和心脏疾病，通常会在成年之前导致死亡。减弱形式的疾病通常仅涉及极微的或不涉及CNS受累。在重度的和减弱的疾病中，非CNS疾病症状可能与患有“重度”形式的那些症状一样严重。

初始MPS-II症状从大约18个月到约4岁开始显现出来，并且包括腹部疝气、耳部感染、流鼻涕和伤风。症状包括粗拙的面部特征(例如，前额突出，扁平的鼻梁的鼻子、肿大舌头)、大脑袋(大头畸形)、腹部肿大，包括肿大的肝脏(肝肿大)和肿大的脾脏(脾肿大)以及听力丧失。本发明的方法可涉及治疗患有任何本文所的症状的受试者。MPS-II还导致关节异常，涉及到骨骼增厚。

治疗可以在从婴儿期到成年期的任何年龄的受试者中进行。受试者可以在出生时、第六个月或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15或18岁时开始治疗。

给予与剂量

本发明的特征还在于含有治疗有效量的本发明的化合物的药物组合物。组合物可以配制用于在多种药物递送系统中使用。也可以将一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载体包括在组合物中用于适当的制剂。可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版,1985中找到适合用于本发明中的制剂。对于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。

药物组合物意在用于肠胃外、鼻内、局部、口服或局部给予，如通过透皮方式，用于预防性和/或治疗性治疗。药物组合物可以肠胃外给予(例如，通过静脉内、肌内或皮下注射)，或通过口服摄取，或在受血管或癌症病症影响的区域处通过局部施用或关节内注射。其他给予途径包括血管内、动脉内、瘤内、腹膜内、心室内、硬脑膜内(intraepidural)，以及鼻、眼、巩膜内、眶内、直肠、局部或气雾吸入给予。通过如以长效注射剂或易蚀植入物或组件的方式，缓释给予也专门涵盖于本发明中。因此，本发明提供了胃肠外给予的组合物，包含溶解或悬浮于可接受的载体，优选水性载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等中的上面提到的药物。组合物可以含有接近生理条件所需的药用辅助物质，如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。本发明还提供了口服递送的组合物，其可以包含惰性组分如用于配制片剂、胶囊等的粘结剂或填料。另外，本发明提供了局部给予的组合物，其可以不含惰性成分，如配制霜剂、软膏等的溶剂或乳化剂。

这些组合物可以通过常规灭菌技术灭菌或可以无菌过滤。所得到的水溶液可以原样包装使用或冻干，冻干制剂在给予之前与无菌水性载体组合。制剂的pH值一般为3至11，更优选5至9或6至8，而最优选7至8，如7至7.5。所得的固体形式的组合物可以分多个单剂量单位包装，每个都包含固定量的上述一种或多种试剂，如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以包装于一个灵活量的容器中，如设计用于局部可涂施的霜剂或软膏的可挤压管中。

含有有效量的组合物可以给予用于预防性或治疗性治疗。在预防性应用中，组合物可以给予至诊断为具有与溶酶体积贮症相关的突变(例如，IDS基因中的突变)的受试者。可以以足以延迟、减少或优选防止病况发作的足够量将本发明的组合物给予至受试者(例如，人)。在治疗性应用中，按照足以治愈或至少部分阻止这种疾病的症状及其并发症的用量将组合物给予至已经遭受溶酶体积贮症(例如，MPS-II)的受试者(例如，人类)。足以实现此目的量定义为“治疗有效量”，足以基本上改善与疾病或医学病况相关的至少一种症状的化合物量。例如，在溶酶体积贮症的治疗中，减少、预防、延迟、抑制或阻止疾病或病况的任何症状的药剂或化合物将会是治疗有效的。不要求治疗有效量的药剂或化合物治愈疾病或病况，但将提供对疾病或病况的治疗，而使这种疾病或病况的发作受到延迟、阻滞或预防，或疾病或病况症状得到缓解，或疾病或病况的期限改变或，例如，在个体中不太严重或加速恢复。

用于这种用途的有效量可能取决于疾病或病况的严重程度以及受试者的体重和一般状态。建议每周静脉注射给予艾杜硫酸酯酶0.5mg/kg。例如可以等效剂量(即，相对于艾杜硫酸酯酶，考虑到融合蛋白的附加分子量)以及频率来给予本发明的化合物。可以艾杜糖醛酸酶等效剂量来给予化合物，例如，每周一次、每周两次、每隔一天一次、每天一次或每天两次0.01、0.05、0.1、0.5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0或5mg/kg。本发明的组合物和在本发明的方法中所用给予至哺乳动物(例如，人类)的治疗有效量可以通过普通技术人员结合考虑哺乳动物在年龄、体重和状况上的个体差异而确定。因为本发明的某些化合物表现出穿过BBB并进入溶酶体中的能力增强，本发明化合物的剂量可以低于(例如，低于或等于约90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的)未结合药剂治疗效果所需的等效剂量。以有效量将本发明的试剂给予至受试者(例如，哺乳动物，如人类)，有效量是在所治疗的受试者中产生所希望的结果(例如，GAG积累减少)的量。还可以通过本领域那些技术人员根据经验确定治疗有效量。

可以用由治疗医师所选的剂量水平和模式实施本发明的包含有效量的组合物的单次或多次给予。可以基于疾病或病况在受试者中的严重度确定和调整剂量和给予方案，这种严重度可以在整个治疗过程中根据由临床医师普遍实行的或本文所描述的方法进行监测。

本发明的化合物可以与常规治疗或疗法的方法组合使用，或可以独立于常规治疗或疗法的方法使用。

当以组合疗法与其他药物一起给予本发明的化合物时，它们可以顺序或同时向个体给予。另外，根据本发明的药物组合物可以由本发明的化合物的组合联合本文所描述的药用赋形剂，以及本领域中已知的另一种治疗或预防药物而构成。

以下实施例预想举例说明本发明，而非进行限制。

实施例1

设计IDS-血管肽素-2融合蛋白

设计了一系列IDS-血管肽素-2构建体。IDS cDNA获自于Origene(货号RC219187)。使用了三个基本配置：N-末端融合(An2-IDS和An2-IDS-His)、C-末端融合(IDS-An2和IDS-An2-His)、以及N-和C-末端融合(An2-IDS-An2和An2-IDS-An2-His)，均具有或不具有8x His标签(图1)。还产生了不具有血管肽素-2的对照(IDS和IDS-His)。

实施例2

重组hIDS蛋白在CHO-S细胞中的表达及活性

然后将这些构建体在生长于悬浮液中的CHO-S细胞中进行表达。使用直链25kDa聚乙烯亚胺(PEI,Polyscience)作为转染试剂，通过在FreeStyle CHO-S细胞(Invitrogen)中的瞬时转染来表达IDS构建体。在一个实例中，将DNA(1mg)与70ml FreeStyle CHO表达培养基(Invitrogen)混合并且在室温下温育15min。单独地将PEI(2mg)在70ml培养基中温育15分钟，然后将DNA和PEI溶液混合在一起并且进一步温育15min。将DNA/PEI复杂混合物(complex mixture)加入到360ml含有1x 10⁹个CHO-S细胞的培养基中。在37℃,8％CO₂和适度搅拌下温育4小时后，加入500m温热的培养基。在收获前在相同的条件下将CHO-S细胞再温育5天。

为了确定细胞是否表达并分泌IDS或IDS融合蛋白，在培养基上进行使用抗-IDS抗体的免疫印迹。如在图2中可以看到的，IDS-His、An2-IDS-His和IDS-An2-His的表达水平相似。由此，细胞能够表达这些蛋白质。

我们还表征了培养基中的IDS活性。这种测定法是使用两步酶促测定法来进行的(图3)。这种测定法包括使用IDS在水中将4-甲基伞形酮基-α-L-艾杜糖苷-2-硫酸酯(4-methylumbelliferyl-α-L-iduronide-2-sulfate)处理4小时以产生4-甲基伞形酮基-α-L-艾杜糖苷和硫酸盐。在第二步中，使用过量的α-L-艾杜糖苷酶(IDUA)处理这些产物24小时以产生α-L-艾杜糖醛酸和4-甲基伞形酮。通过测量4-甲基伞形酮的荧光来确定活性(365nm激发；450nm发射)。

在一个特定的实例中，如下进行这种测定法。在乙酸盐缓冲液pH 5.0中将十μl来自于CHO-S转染的细胞的培养基与20μl的1.25mM 4-甲基伞形酮基-α-L-艾杜糖苷-2-硫酸酯(来自Moscerdam Substrates的IDS底物)混合，并且在37℃温育4h。然后，通过添加20μl 0.2M Na₂HPO₄/0.1M柠檬酸缓冲液pH 4.5和10μl纯化自牛睾丸的溶酶体酶(LEBT)来开始测定法的第二步。在37℃下24h后，使用200μl含有0.025％Triton X-100的0.5M NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液pH 10.7来停止反应。通过测量4-甲基伞形酮的荧光来确定活性(365nm激发；450nm发射)。

图4中示出了生长于悬浮液中的CHO-S细胞中的IDS活性的测量，并且所有三种蛋白质(IDS-His、An2-IDS-His和IDS-AN2-His)均显示具有IDS活性。

实施例3

表达的表征与优化

为了进一步表征表达，如图5A和图5B所示，针对IDS-His和IDS-An2-His融合蛋白测量了生长于悬浮液中的CHO-S细胞中的IDS表达和活性的时间进程评价。从这些数据可以看到，在转染后的第五天观察到了最大的IDS表达和活性。在这些实验中未观察到CHO-S细胞对IDS-An2-His的重俘获。

为了进一步优化转染条件，使用两种不同数目的细胞(1.25x 10⁷个细胞或2.5x 10⁷个细胞)来进行转染。使用了DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的三个不同的比率(1:1、1:2、1:3和1:4)。

从这些实验可以看出，如IDS活性所示的(图5A)以及表达分析所示的(图5B)，使用1:2的DNA:PEI比获得了最佳结果。

实施例4

MPS-II成纤维细胞中的IDS活性

为了确定所表达的蛋白质是否能够降低细胞中葡糖胺聚糖(GAG)的积累，使用了采集自MPS-II患者的成纤维细胞。在第一组实验中，使用成纤维细胞温育来自于使用各种IDS和IDS融合蛋白转染的上述CHO-S细胞的细胞培养基。基于35S-GAG的存在来测量GAG积累。如图6A所示的，使用融合蛋白的GAG的降低与IDS本身的类似。

这些测定法是按如下进行的。将MPS II(Coriell institute,GM00298)或健康人成纤维细胞(GM05659)以250,000细胞/孔种植于6-孔平皿中的具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中并且在37℃在5％CO₂下生长。4天之后，使用PBS将细胞洗涤一次并且使用低硫酸盐F-12培养基(Invitrogen,目录#11765-054)洗涤一次。将1ml含有10％透析的FBS(Sigma,目录#F0392)的低硫酸盐F-12培养基和10μCi ³⁵S-硫酸钠加入到存在或不存在重组IDS蛋白质的细胞中。将成纤维细胞在37℃在5％CO₂下温育。48h后，移去培养基并且使用PBS将细胞洗涤5次。在0.4ml/孔的1N NaOH中将细胞裂解并且在60℃下加热60min以溶解蛋白质。取出一等份试样用于微-BCA(二喹啉甲酸)蛋白质测定(Smith,P.K.et al.,1986,Anal.Biochem.,150(1):76-85)。用液体闪烁计数器计数放射性。数据表示为³⁵S CPM每μg蛋白质。

使用纯化的IDS-An2-his获得了甚至更可喜的结构，其能够将GAG-积累降低至在正常人成纤维细胞中测量的正常对照值(图6B)。这些结果表明，我们的纯化的融合蛋白是具有活性的。总计，使用MPS-II成纤维细胞的这些数据表明，融合蛋白是具有活性的并且它们到达了溶酶体，在其中它们能够裂解糖胺聚糖。

最后，免疫印迹显示，在正常和MPS-II成纤维细胞中以相同的水平表达了低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)(数据未示出)。

实施例5

点击化学接头

在一个实例中，靶向部分通过点击化学接头而被连接至溶酶体酶。这些点击化学的实例如下所示。

这种途径是有利的，因为其非常具有选择性，原因在于反应仅在叠氮化物和炔烃组分之间发生。反应也在含水溶液中发生并且是生物相容性的并且可以在活细胞中进行。此外，反应快速且定量，这允许在稀溶液中制备纳摩尔的结合物。最后，由于反应是pH不敏感的，因此可以在pH 4至11的任何条件下进行。在本发明中使用的具体的点击化学接头在实施例8和实施例9中讨论。

实施例6

SATA化学键

在另一个实例中，靶向部分通过SATA化学接头而连接至溶酶体酶。用于产生此种结合物的示例性方案如下所示。

实施例7

其他化学结合策略

在另一个实例中，通过酰肼接头来实现化学结合。用于产生此种结合物的示例性方案如下。

在另一个实例中，使用高碘酸盐-氧化的酶与肼衍生物通过糖部分(例如，糖基化位点)来实现化学结合。这种途径的实例如下所示，使用经保护的丙酰基酰肼。

这种途径的另一个实例如下所示。

实施例8

通过点击化学将IDS与An2的结合的方法

艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的氨基酸序列中可能的结合位点包括赖氨酸和N-末端残基。

化合物结构

血管肽素2序列

H₂NThr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-TyrCOOH叠氮基-An2(N-末端)4

具有N-末端叠氮基团的叠氮基丁酰基-An2(叠氮基-An2)的结构如下所示。这种化合物是通过标准固相合成方法来制备的。

An2-叠氮基(C-末端)8

具有C-末端叠氮基团的An₂-[叠氮基-正亮氨酸](An2-叠氮基)的结构如下所示。这种化合物是通过标准固相合成方法来制备的。

结构示意图：

IDS-BCN-丁酰基-An₂(70-56-1B和70-56-2B)的结构如下。

其中R¹为：

其中附接至IDS的NH基团来源于IDS中的伯氨基基团的反应。

An₂-[叠氮基-正亮氨酸]-MFCO-IDS(70-66-1B)的结构如下所示。

其中R2为：

其中附接至IDS的NH基团来源于IDS中的伯氨基基团的反应。

An₂-[叠氮基-正亮氨酸]-BCN-IDS(68-32-2)的结构如下所示。

其中R¹为：

其中附接至IDS的NH基团来源于IDS中的伯氨基基团的反应。

70-56-1B和70-56-2B的合成方案

其中R¹为：

BCN：二环[6.1.0]壬炔

70-56-1A的合成

在RT下，在偶尔的手动摇下历经5h，向溶于pH～7.6磷酸盐缓冲液20mM中的(7.24mg,95nmol)的IDS(1)中，加入380nmol(4当量)的BCN-N-羟基琥珀酸亚胺酯(2)(来自于如下制备的原液：5.82mg溶解于1000μl无水DMSO中)。通过使用磷酸盐缓冲液20mM pH 7.6以5mL/分钟下使用HiPrep 26/10脱盐柱的凝胶过滤，从过量的试剂中纯化出经修饰的IDS 3a,70-56-1A。将收集的级分通过Amicon超离心过滤器(限制10kDa,3000rpm)浓缩至3.8mL(6.5mg,收率90％)。回收经修饰的IDS70-56-1A(3a)并且用于随后的与叠氮基-An2(N-末端)(4)的结合步骤。

步骤2：经修饰的IDS与叠氮基-An2(N末端)的结合

(70-56-1B)的合成

向经修饰的IDS衍生物(3a)(6.5mg,85.2nmol)中，加入8当量的叠氮基-An2(N-末端)(4)。手动振摇溶液，包上铝箔并且在RT放置过夜。通过Q Sepharose 1mL柱使用pH 7的20mM TRIS作为结合缓冲液，并且使用pH 7.0的20mM TRIS和500mM NaCl作为洗脱缓冲液来纯化结合物(5)。分离出结合物，并且使用IDS缓冲液(1X:137mM NaCl,17mM NaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄,pH～6)通过使用Amicon超离心过滤器(10kDa截止,3000rpm)洗涤5次15mL进行交换，并且浓缩至2.5mL以获得70-56-1B(6mg,收率83％)。

70-56-2A的合成

在RT下，偶尔的手动振摇历经5h，向溶于pH～7.6的磷酸盐缓冲液20mM的7.24mg(95nmol)IDS(1)中，加入570nmol(6当量)的BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2)。通过使用HiPrep 26/10脱盐柱以5mL/分钟的磷酸盐缓冲液20mM pH 7.6下的凝胶过滤，从过量的试剂中纯化出经活化的IDS70-56-2B(3b)。通过Amicon超离心过滤器(10kDa,3000rpm)将收集的级分浓缩至3.5mL,(6.5mg,收率90％)。回收经修饰的IDS 3b,70-66-2A，将其用于下一步与叠氮基-An2(N-末端)(4)的结合步骤。

(70-56-2B)的合成

向经修饰的IDS 3b,70-56-2A(6.5mg,85.2nmol)中，加入12当量的叠氮基-An2₍N-末端)(4)。手动振摇溶液并且包上铝箔并且在RT下放置过夜。通过Q Sepharose 1mL柱使用20mM pH 7的TRIS缓冲液作为结合缓冲液并且使用pH 7.0的20mM TRIS和500mM NaCl作为洗脱缓冲液来纯化结合物(5)。分离出结合物，并且使用IDS缓冲液(1X:137mM NaCl,17mM NaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄,pH～6)通过使用Amicon超离心过滤器(10kDa限制,3000rpm)洗涤5次15mL进行交换，并且浓缩至3mL以获得70-56-2B(6mg,83％)。

70-56-2B的大规模合成

在RT下，偶尔手动振摇历经5h，向溶于pH 7.6的磷酸盐缓冲液20mM的(152mg,1992nmol)IDS中，加入11952nmol(6当量)BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(20mmol于无水DMSO中)。通过使用脱盐柱Sephadex G25以15mL/分钟的磷酸盐缓冲液20mM,pH 7下的凝胶过渡，从过量试剂中纯化出经修饰的IDS 70-56-2B。通过Centricon Plus-70(10kDa,3100rpm)离心过滤器将收集的级分(65mL)浓缩至36mL，(145mg,收率95％)。回收经修饰的IDS以用于下一步与叠氮基An2(N-末端)的结合步骤。向经修饰的IDS(130mg,1704nmol)中，加入12当量的叠氮基An2(62mg)。手动振摇溶液，用铝箔包裹并且在RT下放置过夜。在Q Sepharose 20mL柱上使用pH 7的20mM TRIS缓冲液作为结合缓冲液并且使用pH 7.0的20mM TRIS与500mM NaCl作为洗脱缓冲液来纯化结合物。分离出结合物(90mL)，使用Centricon Plus-70(10kDa,3100rpm)浓缩至30mL，并且使用IDS缓冲液(1X:137mM NaCl,17mM NaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄,pH 6)通过洗涤(4x 35mL IDS缓冲液)进行交换。然后使用Centricon Plus-70(10kDa,3100rpm)柱将材料浓缩至33mL，并且无菌过滤得到70-56-2B(114mg,88％)。

70-66-1B的合成方案

下示的合成方案显示了含有MFCO的接头与IDS的附接以及An₂-[叠氮基-正亮氨酸](An2-叠氮基(C-末端))通过An2-叠氮基(C-末端)8的叠氮基至含有MFCO的接头的附接。

70-66-1B的合成方案

其中R²为：

MFCO：单氟环辛炔

70-66-1A的合成

向溶于pH～7.6的磷酸盐缓冲液20mM的IDS(1)(10.6mg,139nmol)中，添加1112nmol(8当量)的MFCO-N-羟基琥珀酰亚胺酯(6)(来自于如下制备的储液：7.6mg溶解于1000μl无水DMSO中)，并且在RT下放置5h，偶尔手动振摇。通过使用HiPrep 26/10脱盐柱以5mL/分钟的磷酸盐缓冲液20mM pH 7.6的凝胶过滤，从过量的试剂中纯化出经修饰的IDS70-66-1A(7)。通过Amicon超离心过滤器(10kDa限制,3000rpm)将收集的级分浓缩至3mL,(9.4mg,收率89％)。将经修饰的IDS(7)用于随后的与An2-叠氮基(C-末端)(8)的结合步骤。

步骤2：经修饰的IDS与An2-叠氮基(C末端)(An₂-[叠氮基-正亮氨酸])的结合

向经修饰的IDS衍生物(7)(6.1mg,80nmol)中，加入16当量的An2-叠氮基(C-末端)(8)。手动振摇溶液并且包裹上铝箔并且在RT下放置过夜。通过Q Sepharose 1mL柱使用pH 7的20mM TRIS作为结合缓冲液并且使用pH 7.0的20mM TRIS和500mM NaCl作为洗脱缓冲液纯化结合物(9)。分离出结合物并且使用Amicon超离心过滤器(10K mW,3000rpm)使用IDS缓冲液(1X:137mM NaCl,17mM NaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄，pH～6)通过洗涤5次15mL进行交换，并且浓缩至2.5mL以获得70-66-1B(6.1mg,100％)。

70-66-1B的大规模合成

在RT下，偶尔手动振摇，历经5h向溶于pH 7.6磷酸盐缓冲液20mM中的IDS(152mg,1992nmol)中，加入15936nmol(8当量)的MFCO-N-羟基琥珀酰亚胺酯(20mM溶于DMSO中)。通过使用脱盐柱Sephadex G25以15mL/分钟磷酸盐缓冲液20mM pH 7下的凝胶过滤从过量的试剂中纯化出经修饰的IDS。通过Centricon Plus-70(10kDa,3100rpm)离心过滤器将收集的级分(65mL)浓缩至36mL(157mg,收率至100％)。回收经修饰的IDS以用于随后的与An2叠氮基(C-末端)的结合步骤。

向经修饰的IDS(130mg,1704nmol)中，加入16当量的An2-叠氮基(C-末端)的溶液(84mg,10mg/mL在去离子水中)。手动振摇溶液，包裹铝箔并且在RT下放置过夜。在Q Sepharose 20mL柱上使用pH 7的20mMTRIS缓冲液作为结合缓冲液并且使用pH 7.0的20mM TRIS与500mMNaCl作为洗脱缓冲液纯化结合物。分离结合物(90mL)，使用CentriconPlus-70(10kDa,3100rpm)浓缩至30mL，并且使用IDS缓冲液(1X:137mMNaCl,17mM NaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄,pH 6)通过洗涤(4x 35mL IDS缓冲液)进行交换。然后使用Centricon Plus-70(10kDa,3100rpm)柱将材料浓缩至33mL并且无菌过滤得到70-66-1B(104mg,80％收率)。

68-32-2的合成方案

其中R¹为：

BCN：二环[6.1.0]壬滁

68-31-2的合成

向处于pH～7.6的磷酸盐缓冲液中的IDS(1)(14.5mg,190nmol)中，加入1520nmol(8当量)的BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2)(来自于如下制备的储液：5.82mg溶解于1000μl无水DMSO中)，并且在RT下贮存5h，偶尔手动振摇。通过使用HiPrep 26/10脱盐柱以5mL/分钟的磷酸盐缓冲液20mM pH 7下的凝胶过滤从过量试剂中纯化出经修饰的IDS(10)。通过Amicon超离心过滤器(限制10kDa,3000rpm)将收集的级分浓缩至4mL(14.5mg,收率100％)。回收经修饰的IDS并且用于随后的与An2-叠氮基(C-末端)的结合步骤。

步骤2：经修饰的IDS与An2-叠氮基(C末端)(An₂-[叠氮基-正亮氨酸])的结合

68-32-2的合成

向经修饰的IDS衍生物(10)(11mg,144.2nmol)中，加入16当量的An2-叠氮基(C-末端)。手动振摇溶液并且包裹上铝箔并且在RT下放置过夜。通过Q Sepharose 1mL柱使用pH 7的20mM TRIS作为结合缓冲液并且使用pH 7.0的20mM TRIS和500mM NaCl作为洗脱缓冲液来纯化结合物(11)。分离结合物，并且使用IDS缓冲液(1X:137mM NaCl,17mMNaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄，pH～6)通过洗涤5次15mL使用Amicon超离心过滤器(10K mW,3000rpm)进行交换，并且浓缩至2.5mL以获得68-32-2(10mg,91％)。

68-32-2的大规模合成

在室温下，侧尔手动振摇历经5h，向处于pH～7.6的磷酸盐缓冲液20mM中的IDS(152mg,1992nmol)中，加入15936nmol(8当量)的BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(来自于如下制备的储液：5.82mg溶解在1000μl无水DMSO中)。通过使用脱盐柱Sephadex G25以15mL/分钟磷酸盐缓冲液20mM～pH 7下从过量的试剂中纯化出经修饰的IDS。通过CentriconPlus-70(10kDa,3100rpm)离心过滤器将收集的级分65mL浓缩至36mL(145mg,收率至95％)。回收经修饰的IDS并且将其用于随后的与An2-叠氮基(C-末端)的结合步骤。

将16当量的叠氮基An2(C-末端)(84mg)(10mg/mL在去离子水中)加入到经修饰的IDS(130mg,1704nmol)。手动振摇溶液并且包裹上铝箔并且在RT下放置过夜。在Q Sepharose 20mL柱使用pH 7的20mM TRIS缓冲液作为结合缓冲液并且使用pH 7.0的20mM TRIS与500mM NaCl作为洗脱缓冲液纯化结合物。分离出结合物(90mL)，使用CentriconPlus-70(10kDa,3100rpm)浓缩至30mL，并且使用IDS缓冲液(1X:137mMNaCl,17mM NaH₂PO₄,3mM Na₂HPO₄,pH 6)通过洗涤(4x 35mL IDS缓冲液)进行交换。然后，使用Centricon Plus-70(10kDa,3100rpm)柱将材料浓缩至33mL并且无菌过滤以获得68-32-2(104mg,80％收率)。

实施例9

IDS-血管肽素-2与可裂解的接头的结合物的合成

通过以下所示的两个方案，通过含有二硫化物的可裂解接头将An2结合至IDS。在第一个方案中，使IDS的赖氨酸侧链与SPDP接头反应以产生经修饰的IDS。使经修饰的IDS与An₂-Cys-SH反应以通过An₂-Cys的C-末端半胱氨酸的S部分以附接An2以产生IDS-An₂结合物。

在第二个方案中，使IDS与SATA接头反应，随后与羟胺反应以产生经修饰的IDS。使An₂的N-末端与SPDP反应以产生经修饰的An₂。使经修饰的IDS与经修饰的An₂反应以通过An₂的N-末端氨基来将An₂附接至IDS以产生IDS-An₂结合物。

实施例10

化合物的筛选与表征

通过赖氨酸附接将重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)(JR-032)结合至An2。其中潜在附接位点被标记的IDS氨基酸序列在以上实施例8中介绍。这些结合物代表了An2:接头与IDS的不同比率。在这种结合策略中测试的接头是点击化学接头，包括MFCO(单氟环辛炔)、BCN(二环壬炔)、SATA(S-乙酰基硫代乙酸酯)、DBCO(二苄基环辛炔)和马来酰亚胺基。在所有的情况下，添加至反应的An2:接头材料的比率为2:1，An2超过IDS为4倍、6倍或8倍。通过Q-琼脂糖凝胶柱色谱从反应产物中移除An2，并且使用MALDI-TOF分析来确定掺入在每个IDS上的An2的平均数目。使用SP-HPLC分析来确定在产物中是否存在未结合的IDS。使用SEC分析来检查结合后蛋白质的质量。使用这种方法，发现了第一系列的九个结合物具有聚集体形成的证据，并且优化并重复了结合反应以消除了这个问题。另外，使用其他接头生产了五个新的结合物。

如下表3中所示的，评价这些结合物以确定：

1.An2掺入(1至5An2/IDS的范围)

2.通过尺寸排阻色谱法(SEC)的聚集程度

3.通过侧群(SP)-分析的主要峰

选择用于进一步分析的赖氨酸结合物如下表3所示。需要注意的是，掺入的An2的数目是平均值，因为在结合反应产物中会存在多个物种。通过MALDI TOF的JR-032的质量为76,320Da(11次测定)。这些结合物的免疫印迹如图8所示。

Alexa488-IDS和Alexa488-An2-IDS(70-56-2B)在U87细胞中的摄取

将U87细胞接种于12孔板中并且允许正常的细胞培养条件下生长48h。在细胞培养条件下在完全细胞培养基(不含酚红但使用抗生素)中，通过使用递增浓度的Alexa488-标记的产品温育汇合的U87细胞来进行细胞摄取实验。然后洗涤细胞一次，胰蛋白酶消化且大量冰上再次清洗。通过流式细胞计评价荧光化合物在细胞中的摄取。在减去在不存在标记化合物下测量的基底细胞荧光后，将结构表示为样品的相对荧光单位(RFU)。

表3：选择的用于进一步分析的An2-IDS赖氨酸结合物

4.¹＝两个值的平均值。

5.²＝三个值的平均值。

也采用了半胱氨酸策略以尝试限制(并且标准化)掺入到每一个IDS中的An2的数目，但是使用包括多至20当量的An2的一系列条件获得了不超过50％的IDS与An2的结合。另外，结合反应的产物显示出酶活性的50％损失，表明经结合的材料是非活性的。因此，赖氨酸的方法是受青睐的。

结果

图9A、图9B、图9C和图9D分别显示了70-56-1B、70-56-2B、68-32-2和70-66-1B的MALDI-TOF分析。图10A和图10B显示了68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的SEC和SP分析。以上提供了这些结合物的结构以及合成方案的汇总。掺入到68-32-2、70-66-1B、70-56-2B和70-56-1B的An2的平均数目分别为2.3、4.9、2.4和1.2。在这些分析中未检测到未结合的JR-032。对于每个结合物有代表两个群体的An2-IDS的峰是可见的，一个在第4-5分钟洗脱出而第二个在第10分钟中洗脱出。已经证明，不同的An2-IDS结合物有类似间隔的纯化峰。

使用Alexa 488染料来标记结合产物并且用于在U87细胞中的运输研究(trafficking studies)，以将它们的定位与lysotracker染料的定位进行对比。图11中提供了显微镜实验的示意图，并且在图12至图16中示出了使用Alexa 488染料标记的68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的共聚焦显微镜的结果，显示了它们相对于lysotracker染料的定位。结合物与lysotracker染料的共定位表明在酸性溶酶体中存在结合物。图17示出的数据的定量分析表明，在温育1小时或16小时后(图17)观察到了结合的以及原生(天然，native)的JR-032。两种酶的摄取EC₅₀均为约10nM，70-56-2B显示了更高的最大摄取。图18和图19中示出了支持An2-IDS至U-87细胞中的摄取的进一步数据。

实施例11

经修饰的赖氨酸的识别

为了确定An2所结合的IDS中赖氨酸，将JR-032、70-56-2B、70-66-1B和68-32-2B以及它们的中间体经受胰蛋白酶消化。随后通过LCMSMS分析每种蛋白质的蛋白水解片段。由这种分析，如表4所示，JR-032上的八个赖氨酸已经被识别为在An2-IDS结合物的合成过程中作为发生修饰的位置。

表4：识别的在An2-IDS结合物/中间体上的经修饰的赖氨酸的汇总

实施例12

结合物的IDS酶比活性

方案：

1)通过微BCA确定JR-032和结合物中的蛋白质的浓度。

2)测试溶液的制备：

在含有Triton-X100的稀释的缓冲液中稀释JR-032和结合物1/200。

3)通过将1mL 4-MU储液((4-甲基伞形酮；0.01mol/L)稀释于11.5mL含有Triton-X100的缓冲液中来制备标准溶液(最终浓度800μmol/L)。

4)通过将500μL的800μmol/L于500μL的含有Triton X100的缓冲液中以制备400μmol/L的溶液，重复该过程来获得下列释稀度：800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，以制备系列稀释度的标准溶液。

5)分别将10μL的空白溶液(含有Triton-X100的稀释缓冲液)分配在微孔板的2个孔中(n＝2)、10μL的标准溶液(6.25μmol/L至800μmol/L)分配在微孔板的2个孔中(n＝2)和各10μL的测试溶液分配在微孔板的4个孔中(n＝4)。

6)向每个孔中，加入100μL底物溶液(4-甲基伞形酮硫酸钾盐；4-MUS处于5mM含有0.1％(w/v)Triton-X-100和0.05％(w/v)BSA的乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中)并且轻柔混合。

7)盖上孔板并且将其放置于调节至37℃的培育箱中。

8)在正好60分钟后向每个孔中加入190μL停止液(0.33M甘氨酸和0.21M碳酸钠pH 10.7)，并且混合以终止反应。

9)将板放置在荧光酶标仪中并且在355nm的激发波长和在460nm的检测波长下确定荧光强度。

10)如果测试中需要对比，使用参比材料进行相同的测量。

计算的方法：

11)使用下列公式确定每个测试孔中的4-MU的浓度Cu(μmol/L)。

$Cu=Cs\left(\frac{Au}{As}\right)$

Cu：测试溶液中的浓度(μmol/L)

Cs：标准溶液中的浓度(μmol/L)

Au：测试溶液的荧光强度

As：标准溶液的荧光强度

12)测试溶液的比活性：使用下列公式来确定测试溶液的比活性B(mU/mg)：

$B=\frac{\frac{Cu}{60}\×C\×\frac{50}{0.1}}{P}$

C：脱盐测试物质的稀释因子

B：比活性(mU/mg)

P：脱盐测试物质中的蛋白质的浓度(mg/mL)

结果

使用JR-032作为对照，使赖氨酸结合物经受体外酶测定法。所有的结合物均保留了酶的活性(参见图20A)。在一些情况下，所测量的活性超过了原生IDS的活性。这可能是由蛋白质定量测定中的干扰引起的，其导致较低计算的蛋白质浓度和较高的活性/蛋白质，或可能表明酶的修饰正向的调节了其活性。图20B示出了JR032(通过Q-Sepharose柱以除去Tween-80)与大规模合成的70-56-2B、70-66-1B和68-32-2的体外酶活性的进一步比较的结果。

实施例13

糖胺聚糖(GAG)积累测定

方案：

材料：

II型MPS亨特成纤维细胞(Coriell institute，GM00298)

健康人成纤维细胞(Coriell institute，GM05659)

达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)，胎牛血清(FBS)

低硫酸盐Ham氏F-12培养基(Invitrogen，产品目录#11765-054)

针对0.15M NaCl透析的FBS，10000Da MWCO(Sigma，产品目录#F0392)

³⁵S-硫酸钠(Perkin-Elmer，产品目录#NEX041H002MC)

方法：

1.MPS II(GM00298)或健康人成纤维细胞(GM05659)处于

-6-孔皿中以250,000个细胞/孔，在具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中

-生长4天

2.-丢弃培养基，使用温和且无菌的PBS洗涤孔。

-添加1mL/孔的具有10％透析的FBS和10μCi ³⁵S-硫酸钠的低硫酸盐F-12培养基。

-添加JR-032或结合物。在37℃、5％CO₂下温育48h。

3.-丢弃培养基，使用冷PBS洗涤孔(1mL，5次)。

-在0.4mL/孔的1N NaOH中裂解细胞。

-在60℃下加热60分钟以溶解蛋白质。

-取出等分试样以用于μBCA蛋白质测定。

4.使用液体闪烁计数器进行放射性计数。

5.微BCA蛋白质测定。

数据表示为³⁵S CPM每μg蛋白质。

结果

为了确认具有功能性终点的酶活性，测定结合物在来自MPSII患者的成纤维细胞中降低GAG水平的功效。在4ng/ml(50pM)的浓度下，GAG水平被降低至在无病成纤维细胞中观察到的水平，这类似于使用JR-032的观察结果(参见图21和图22)。

实施例14

原位脑灌注

方案：

JR-032通过Q-sepharose柱并且使用来自Pierce(Rockford,IL)的碘珠试剂盒和D-盐右旋糖酐脱盐柱通过标准工序来放射性标记结合物。使用两个碘珠来碘化蛋白质。简要地说，在Whatman过滤器上使用3ml PBS将珠洗涤两次并且悬浮于60μl PBS中。将来自Amersham-PharmaciaBiotech(Baie d’Urfé,Que)的Na¹²⁵I(1mCi)加入到珠悬浮液中并且在室温下持续5分钟。通过添加稀释于磷酸盐缓冲液pH 6.5中的2mg蛋白质来引起JR-032或结合物的碘化。在室温下温育10分钟后，移去碘珠并且将上清液施加到预填有5ml来自Pierce(Rockford,IL)的交联的右旋糖酐的脱盐柱上。使用10ml PBS洗脱¹²⁵I-蛋白质。收集0.5ml的级分并且使用γ计数器(Perkin-Elmer,2470自动γ计数器)来测量5μl每种级分中的放射性。将对应于¹²⁵I-蛋白质的级分汇集并且相对于Ringer/Hepes,pH 7.4进行透析(截止10kDa)。在凝胶过滤柱上去除游离碘，随后进行大量透析。在放射性标记之后，SEC分析表明超过90％的放射性与对应于酶级分的主峰相关联。使用Bradford测定法以JR-032为标准来计量放射性标记的蛋白质。

通过Dagenais et al.,2000描述的方案在实验室中确定了原位小鼠脑灌注方法。简要地说，在腹腔注射(i.p.)氯胺酮/赛拉嗪(140/8mg/kg)的麻醉的小鼠上进行手术。暴露右颈总动脉并且在分叉的水平上扎结。然后，使用填充有盐水/肝素(25U/ml)溶液的、安装在26号针头上的聚乙烯管(0.30mm i.d.x 0.70mm o.d.)对颈总动脉吻侧插入导管。

在手术之前，制备由KREBS-碳酸氢盐缓冲液-9mM葡萄糖组成的灌注缓冲液并且在37℃、pH 7.4在95％O₂:5％CO₂稳定下温育。将含有添加至灌注缓冲液的放射性标记的化合物的注射器放置在输液泵(Harvardpump PHD2000；Harvard apparatus)上并且连接至导管。刚好在灌注之前，切断心脏并且在2.5ml/min的流速下对脑灌注2分钟。JR-032和结合物的所有灌注均是在5nM的浓度下进行的。在灌注之后，使用不含示踪剂的溶液对脑进行简单的灌注以清洗血管30s。在灌注结束后，立即断头处死小鼠并且在冰上分离出大脑右半球并且在Ringer/Hepes缓冲液中均质，然后进行毛细血管耗竭。

毛细血管耗竭

毛细血管耗竭方法通过消除示踪剂与毛细血管的结合而允许测量进入脑实质的灌注分子的积累。毛细血管耗竭方案改编自Triguero et al.,1990描述的方法。将右旋糖酐溶液(35％)加入到脑组织匀浆中以得到17.5％的最终浓度。在用手充分混合后，将混合物离心(在10000rpm下10分钟)。得产生的团粒主要含有毛细血管而上清液对应于脑实质。

示踪剂信号的测定

采集匀浆物、上清液、团粒和灌注液的等分试样以测试它们的放射性标记的分子的含量。在Wizard 1470自动γ计数器(Perkin-Elmer Inc,Woodbridge,ON)中对[¹²⁵I]-样品进行计数。使用三氯乙酸(TCA)来沉淀所有的等分试样以获得放射性标记的沉淀蛋白质级分。结果表示为在不同的脑室中的体积分布(ml/100g/2min)。

结果

为了确定结合是否赋予了关于大脑渗透的优势，将结合物进行放射性碘化并且在小鼠中以原位脑灌注法中进行测试。在该实验中，通过颈总动脉递送酶(5nM)，由此最大化选择性输送至脑的量。在两分钟暴露之后，使用盐水灌注大脑以除去循环酶。在去除大脑之后，使用毛细血管耗竭方案来分离毛细血管相关的级分和实质级分。对放射性进行计数以量化测试物品的分布体积。在所有的实验中均使用JR-032作为对照并且汇总其结果以产生单个对照值。图23和图24分别示出了在单个时间点(2分钟)的JR-032和结合物的脑分布。图25中提供了JR-032相对于菊粉的大脑分布的比较。图26提供了在小鼠中进行的碘化的JR032(通过Q-Sepharose柱以去除Tween-80)和大规模合成的70-56-2B、70-66-1B和68-32-2在全脑、毛细血管和实质中的进一步2分钟体内脑通透性研究的结果。处于BBB的内部由神经元和胶质细胞组成的实质代表了酶的疗效的靶区。对于70-56-2B、70-66-1B和68-32-2，在所有区室中的暴露均高于原生酶。

实施例15

在野生型小鼠中的PK/组织分布

方案：

在1mg/kg或5mg/kg下以单一静脉注射(iv)尾静脉给予对12周大小的C57Bl6/J(Jackson Laboratories)小鼠给予¹²⁵I酶。根据表5中的时间表采集组织和血浆(P：血浆；T：组织)。将血液收集在EDTA涂覆的微管(微量吸收(microcuvette)毛细管Di-Kalium EDTA)。在5000rpm下离心10分钟(Beckman Coulter Microfuge 22R离心机)后获得血浆样品。在为采集组织而处死小鼠之前，通过心脏左心室对小鼠灌注冰冷的40ml盐水(5ml/min,8分钟)。采集的组织为脑、肝、心脏、肺、皮肤、肌肉、脾脏、肾脏、骨和软骨。采集组织并且在预先称重管(Sarstedt 12x 75mm圆形底座)中称量(Balance Denver Instrument S-403)。在Wizard 1470自动γ计数器(Perkin-Elmer Inc,Woodbridge,ON)上对血浆(10μL)和组织中的放射性水平进行γ计数。

表5：血浆和组织采集时间表

使用Excel电子表格对数据进行数学分析。原始数据采集为cpm/mg组织并且将其转换为ng/g。对于血浆样品，将放射性计数转移为μg/ml血浆。使用WinNonlin_Professional version 5.2(Pharsight Corporation,Mountain View,CA)进行药代动力学分析。

数据表示为平均值±S.E.M。所有的统计分析均是采用GraphPadPrism version 5.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)来进行的。

结果

对于PK分析，通过放射性计数来确定血浆中酶的量。图27示出了血浆浓度-时间曲线，其中用于分析参数的数值在表6中。对于所有的酶，在15分钟处观察到Tmax。如对结合物所预期的，血浆AUC和Cmax低于JR-032，但是清除率和分布体积更高，与结合物更快速地从血浆向组织中的分配的可能性一致。对于所有的酶，AUC_％或基于外推法的AUC∞的百分比均较低，表明由AUC_0-48代表大于95％的总血浆暴露。

表6：用于JR-032和结合物的血浆PK参数

图28中示出了在第1小时、第8小时和第48小时时结合物与IDS在组织中的浓度的比较，图29中示出了大脑中所有酶的浓度比较。对于70-56-2B(图28A)，在所有的测试时间点，在所有的组织中的浓度均类似于或低于原生IDS的浓度。对于70-66-1B(图28B)，在心脏中的浓度类似于或等于IDS的浓度，在脑、肺、肌肉和皮肤中的浓度高于IDS的浓度，并且在肝、肾、脾和骨骼中的浓度低于IDS的浓度。对于68-32-2(图28C)，在脑和肺中的浓度高于IDS，在心脏、脾、肌肉和皮肤中的浓度类似于IDS，且在肝、骨骼和肾中的浓度稍低于IDS。如可以在图29中看到的，大脑浓度的等级次序为68-32-2(最高)，其次是70-66-1B和70-56-2B。这种等级次序与在图2中所示的小鼠脑通透性研究所观察到的一致，表明原位脑灌注技术能高度预测大脑暴露。JR-032和结合物的AUC值以及比率(结合物:JR-032)可以在表7中找到。

表7：JR-032和结合物的AUC值，单位ng/g*h。相对于JR-032AUC的倍数示于括号中。

三个结合物的血浆AUC值略低于JR-032的血浆AUC值，这是假定认为LRP-1受体介导的转胞吞作用加速了从血浆到组织的分布的所预期的结果。

一个结合物70-56-2B表现出了远比所测试的其他结合物更高的体积分布：22比12-15ml。这种结果表明，结合对于酶的药代动力学确实具有影响。但是，造成这种数值的组织区室(多个)是未知的，因为没有证据表明在我们的研究中所检查的九种组织接受了与70-56-2B的更多暴露。

已经证明，其他结合物70-66-1B和68-32-2在单次静脉注射给予后表现出的大脑水平比原生JR-032获得的水平更高。更具体地是，70-66-1B在早期时间点获得了比原生JR-032在大脑中实现了更高水平的暴露。68-32-2观察到了最高的大脑暴露，AUC0-∞为原生JR-032的2.5倍。血浆水平相比于原生酶没有增加的事实是显著的，因为在这种情况下通过提高血浆稳定性显然没有实现更高大脑水平的达成，由此增加了供应给大脑的含有药物的血液的时间量。

实施例16

雄性野生型和雄性半合子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因敲除小鼠中的组织分布

方案

如表8中所归纳的，进行了另外的组织分布研究。在每个阶段，以1mg/kg的目标剂量水平通过快速浓注(bolus injection)入尾静脉使小鼠接受单次静脉内给予的[¹²⁵I]JR032、[¹²⁵I]70-66-1B或[¹²⁵I]68-32-2在磷酸盐缓冲盐水中的溶液。由给予的剂量制剂的重量及其放射性浓度来计算每只动物接受的放射性剂量。

表8：组织分布研究细节

定量组织分布(阶段A、C和E)

在表中所列举的时间点对个体小鼠放血(在异氟烷/氧气下麻醉心脏穿刺)并处死(颈椎脱位)。处死后，从每具尸体中取出若干组织/器官或者取样(适量的)包括：脑、心脏、肝、肺、肾(皮质)、肌肉(腿外展肌)、皮肤、骨骼(股骨，包括骨髓)和脾脏。也采集血浆的等分试样(约0.05g)以用于测量总放射性浓度。测量每个样品的重量和放射性浓度。

使用COBRA IIγ闪烁计数器(Model 5003)以预设在4分钟的计数模式来测量放射性浓度。通过γ计数器计算机软件使用60天的半衰期来回算(back-calculate)全部计数，并且[¹²⁵I]JR032的参考日期为2013年4月3日，[¹²⁵I]70-66-1B的参考日期为2013年4月11日且[¹²⁵I]68-32-2的参考日期为2013年4月15日。使用每批次的研究样品来测量空白“背景”衰变率并且从每个样品的衰变率中减去。低于所研究的样品中的背景浓度的两倍的放射性量被认为是低于准确定量限(BLQ)。

结果

图30中示出了在给予后的第1小时和第8小时，与JR-032相比，结合物在脑、心脏、肝、肺、肾(皮质)、肌肉(腿外展肌)、皮肤、骨骼(股骨、包括骨髓)和脾脏中的浓度。对于70-66-1B在第1小时，在心脏、肝、肺、脾和骨骼中的浓度低于IDS，在脑、肌肉和皮肤中的浓度类似于IDS，而在肾皮质中的浓度稍高于IDS。对于68-32-2在第1小时，在心脏、肝、肺、脾和骨骼中的浓度低于IDS，并且在脑、肾、肌肉和皮肤中的浓度类似于IDS。在第8小时，JR-032和结合物在各组织中的浓度均较低(除了在第8小时在肝脏中的JR-032)。但是，结合物与JR-032的比较水平类似(尽管在第8小时，70-66-1B在肾皮质中低于IDS)。

在第1小时，结合物在血浆中的浓度低于JR-032，这是假定认为LRP-1受体介导的转胞吞作用加速了从血浆到组织的分布的所预期的结果。在第8小时，JR-032和结合物在血浆中的浓度相似。

整体放射自显影术(阶段B、D和F)

向半合子IDS基因敲除的小鼠(n＝4只动物/阶段)给予单次静脉注射剂量的[¹²⁵I]JR032(阶段B)、[¹²⁵I]70-66-1B(阶段D)或[¹²⁵I]68-32-2(阶段F)后，使用异氟醚麻醉个体小鼠并且在表中所列的时间点从右眼的眶窦采集全血样品。

将各血样(约0.2mL)转移到含有含有肝素抗凝剂的管中，以以最小的延迟进行离心(在约4℃下约2000בg’离心10分钟)，并且将分离的血浆转移到光滑管中。丢弃血细胞。

虽然仍在麻醉中，将小鼠钉在木板上并且通过在约-80℃下的己烷/固体CO₂浴中中冷冻以处死小鼠。除去胡须、腿和尾巴后，将每具冻僵的尸体设置在约-80℃下的2％(w/v)羧甲基纤维素水溶液的均温块中。

将含有七种不同浓度放射性的强化的人体血液(通过将[¹²⁵I]JR032(阶段B)、[¹²⁵I]70-66-1B(阶段D)和[¹²⁵I]68-32-2的放射性标记的溶液加入到从健康人志愿者获得的全血中以产生0.50、1.0、2.5、5、100、1000和2000nCi/mL的标称浓度而获得的)置于钻入到均温块的孔中，以用于构建校准线。

将均温块安装在保持在约-20℃下的低温恒温器中的切片机的平台上。然后通过尸体以6个层级获得了矢状断面(标称30μm)：

层级A：肾

层级B：内眼眶泪腺

层级C：哈氏腺

层级D：肾上腺

层级E：半脑和甲状腺

层级F：大脑和脊髓

使用Heto Power LL3000冷冻干燥机在-55℃的平均温度下将安装在切片带上的切片在冷冻机中冷冻干燥。将来自每个层级的一个切片暴露于铜和铅衬里的暴露箱中的成像板(Raytek Scientific Ltd,Sheffield UK)上持续七天。使用FLA5000射线发光成像系统(radioluminographysystem)(Raytek Scientific Ltd,Sheffield,UK)扫描成像位置。使用经验证的图像分析软件包(Seescan Densitometry software,version 1.3)来分析电子图像。

将每个层级下的一个重复的冷冻干燥切片(与量化的切片相同)安装在乙酸酯片材上并且在评价图像时用于目视参考之用。

定量测定一些组织(包括脑、肝和肾上腺)中的放射性浓度。对于这些组织，在单个放射自显影中界定每种组织的最大面积以用于测量。表9中给出了该方法中定量的上限和下限。

表9：定量的上限和下限

结果

图31示出在第0.5小时、1小时、4小时和24小时血浆、脑、肝和甲状腺中JR-032、70-66-1B和68-32-2的浓度。在脑中，在0.5小时时，两种结合物的浓度均高于JR-032。在稍后的时间点，JR-032和两种结合物的浓度均较低。另外，在第1小时和24小时，两种结合物的浓度均低于JR-032，而在第4小时类似。JR-032和结合物在肝脏和甲状腺中的水平均远高于在脑中的水平，并且结合物与JR-032的比较水平明显不同于从脑观察到的模式。

表10示出了用15％含水TCA沉淀的血浆样品中的放射性百分比。这示出了与蛋白质如JCR-032或结合物相关联的放射性碘同位素的百分比。

表10：用15％TCA沉淀的血浆样品中的放射性百分比

％沉淀	0.5h	1h	4h	24h
					JR032	96	95	71	78
70-66-1B	83	72	47	73
					68-32-2	89	75	62	75

实施例17

JR-032和结合物的加工

在成纤维细胞中通过各种中间体将艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(90kDa)加工为主要的55kDa中间体，再加工为45kDa成熟形式(Froissart et al.Biochem J.309:425-430,1995)。为了确定结合物是否以与未结合的酶相似的方式加工，通过免疫印迹分析ANG3402和ANG3403的样品并且与JR-032的样品进行比较。

结果

如图32A和图32B所示的，ANG3402和ANG3403类似于未结合的酶的方式被加工。通过比较在MPS-II成纤维细胞中加工的ANG3402和ANG3403与JR-032的样品确认了这种结果(图33)。如图34所示，在血浆中未发生JR-032或结合物的明显加工。

实施例18

结合物对半合子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因敲除的小鼠中的大脑、心脏和肝脏中GAG积累的影响

方案

根据表11，历经4周每周一次，通过注射入尾静脉中向21至23周龄的雄性半合子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因敲除的小鼠(由OrientalBioService Inc.；Minamiyamashiro Laboratory提供)进行给予。将雄性野生型动物(23周龄)用于测试组1中作为对照。

表11：用于GAG积累研究的给予方案

测试组	动物类型	剂量(mg/kg)	给予频率	动物数量
					1.野生型	WT	未给予	未给予	5

2.JR-032	半合	2	一次/周	5
					3.媒介物	半合	2	一次/周	5
4.ANG3403	半合	2	一次/周	5
					5.ANG3402	半合	2	一次/周	5

JR-032、68-32-2或70-66-1B在媒介物(使用0.22μM无菌注射器过滤的8g/L氯化钠、2.65g/L磷酸二氢钠、1.07g磷酸氢二钠水合物(pH在5.86-6.14的范围内))中给予。在测试组3中，仅给予媒介物。

在完成4周给予之后一周，在20％异氟烷麻醉下通过从腹主动脉放血对存活的动物实施安乐死，并且摘取脑(大脑和小脑)、心脏和肝脏并且使用液氮进行冷冻。将冷冻的组织冻干，切成小片并且称量。加入含有50mg/mL肌动蛋白酶E的0.5mol/L tris HCl缓冲溶液(pH 7.5)，使得总添加剂量为1ml每100mg组织干重。用干浴培养箱在100℃下将混合物加热10分钟。然后加入另外的含有50mg/mL肌动蛋白酶E的0.5mol/L tris HCl缓冲溶液(pH 7.5)，便得组织干重与肌动蛋白酶E的比率为10mg:1mg，并且使用干热灭菌器在60℃将混合物温育约16小时。然后使用干浴培养箱在100℃下将混合物加热10分钟，随后在24℃在约20400g下离心10分钟。除去上清液并冷冻12小时以上。然后将上清液在室温下解冻并且再次在24℃在约20400g下离心10分钟。除去上清液并冷冻。

使用sGAG定量试剂盒(EURO-DIAGNOSTICA)测量在50μl来自每种组织的样品中、在50μl空白样品(注射用水)中和在50μl校准样品(硫酸软骨素B钠盐在注射用水中的溶液，浓度为640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml和20μg/ml)中的GAG浓度两次。

简单地说，向每个样品中加入50μl的8M胍-HCl并且使混合物在室温下反应15分钟。然后加入50μl的SAT溶液(0.3％H₂SO₄和0.75％Triton X-100)并且使混合物在室温下反应15分钟。向每个样品中加入750μl的阿尔新蓝工作溶液(通过以9:5:1的比率混合注射用水、SAT溶液和阿尔新蓝储液(0.1％H₂SO₄和0.4M胍HCl)来制备的)，并且使混合物在室温下反应15分钟。然后在12600g在24℃下将样品离心15分钟，并且弃去上清液。向管中加入500μl DMSO溶液(40％二甲亚砜和0.05M MgCl₂)，并且使用搅拌器在室温下将管中的内容物搅拌15分钟，随后在12600g在24℃下离心15分钟。弃去上清液并且向每个样品中加入500μlGu-Prop(4M胍-HCl，33％1-丙醇和0.25％Triton X-100)。在室温下使用搅拌器将管搅拌15分钟使得沉淀物完全溶解。将200μl的每个样品分配到96孔微孔板的孔中。使用酶标仪在600nm的波长下获取吸光度值。使用分析软件(KC4v3.4DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)通过线性法计算GAG浓度。计算2次测量的GAG浓度的平均值(μg/ml)。

计算校准样品的GAG浓度的准确度。当准确度和相关系数未处于评价标准中时，不计算组织样品的GAG浓度。(准确度的评价标准：变异系数在15％以内(20％对于20μg/ml样品在20％以内)。相关系数的评价标准：0.997或更高(四舍五入至小数点后4位))。

通过下列公式将在组织样品中测量的GAG浓度转化为在各组织的干重量中的浓度：

$\[GAG\]d=\frac{\[GAG\]s\×A}{W}$

[GAG]d＝干组织中的GAG浓度(μg/mL)

[GAG]s＝样品中的GAG浓度(μg/mL)

A＝添加剂量(ml)

W＝干组织重量(mg)

结果

在肝(图35A)和心脏(图35B)中，与仅给予媒介物的半合子基因敲除的小鼠相比，给予JR-032或结合物的半合子基因敲除的小鼠中的GAG浓度显著较低。在给予媒介物或给予JR-032或结合物的半合子小鼠的脑组织中未现观察到GAG浓度的显著差异(图35C)。

实施例19

结合物对半合子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因敲除小鼠的脑中的GAG积累的影响

方案

根据表12，历经8周，每周两次，通过注射到尾静脉中以5mL体积/kg体重的剂量向18周龄(在收到时)的雄性半合子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因敲除小鼠(由Oriental BioService Inc.；Minamiyamashiro Laboratory提供)给予。在测试组1中使用雄性野生型动物(18周龄)作为对照。

表12：GAG积累给予时间表

测试组	动物类型	剂量(mg/kg)	给予频率	动物数
					1.野生型	WT	未给予	未给予	5
2.媒介物	半合	0	两次/周	5
					3.JR-032	半合	1	两次/周	5
4.JR-032	半合	2	两次/周	5
					5.JR-032	半合	5	两次/周	5
6.70-66-1B	半合	1	两次/周	5
					7.70-66-1B	半合	2	两次/周	5
8.70-66-1B	半合	5	两次/周	5
					9.68-32-2	半合	1	两次/周	5
10.68-32-2	半合	2	两次/周	5
					11.68-32-2	半合	5	两次/周	5

JR-032、68-32-2或70-66-1B在媒介物(20mM磷酸钠,137mM NaCl,pH 6)中给予。在测试组2中，仅给予媒介物。

在完成8周给予之后1周，在20％异氟烷麻醉下将右心房的心耳切开并且使用注射器和针从左心室灌注约30mL盐水。灌注之后，移除脑(大脑和小脑)。将脑分为右脑和左脑。将右脑称重并冷冻，并且将左脑沉浸在10％的中性缓冲福尔马林中。

将固定的左脑矢向修整并且包埋在石蜡中。使用切片刀将石蜡包埋的组织样本切片以在约0.96+/-0.24mm横向部位(切片厚度：4μm)上获得5片切片。使用H&E和LAMP-1染色两片切片。

将冷冻的组织进行冷冻干燥(FZ-Compact,Asahi Life Science Co,Ltd.)，切成小片并且称重。加入含有50mg/mL肌动蛋白酶E的0.5mol/Ltris HCl缓冲溶液(pH 7.5)，使得该溶液的总添加剂量为1ml每100mg组织干重。使用干浴培养箱在100℃下将混合物加热10分钟。然后加入另外的含有50mg/mL肌动蛋白酶E的0.5mol/L tris HCl缓冲溶液(pH 7.5)，便得组织干重与肌动蛋白酶E的比率为50mg:1mg，并且使用干热灭菌器在60℃下将混合物温育16小时。使用干浴培养箱在100℃下将混合物加热10分钟，随后在24℃在约20400g下离心10分钟。弃去上清液并且冷却12小时以上。然后将上清液在室温下解冻并且再次在24℃在约20400g下离心10分钟。除去上清液并且冷冻。

使用sGAG定量试剂盒(EURO-DIAGNOSTICA)测量在50μl来自脑的样品中、在50μl空白样品(注射用水)和在50μl样准样品(硫酸软骨素B钠盐在注射用水中的溶液，浓度为640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml和20μg/ml)中的GAG浓度两次。

简单地说，向每个样品中加入50μl的8M胍-HCl并且在室温下允许混合物反应15分钟。然后加入50μl的SAT溶液(0.3％H₂SO₄和0.75％Triton X-100)并且在室温下使混合物反应15分钟。向每个样品中加入750μl阿尔新蓝工作溶液(通过以9:5:1的比率混合注射用水、SAT溶液和阿尔新蓝储液(0.1％H₂SO₄和0.4M胍HCl)来制备)，并且使混合物在室温下反应15分钟。然后在12600g在24℃下将样品离心15分钟并且弃去上清液。向管中加入500μl的DMSO溶液(40％二甲基亚砜和0.05M MgCl₂)并且使用混合器在室温下将管中的内容物搅拌15分钟，随后在12600g在24℃下离心15分钟。弃去上清液并且向每个样品中加入500μlGu-Prop(4M胍-HCl、33％1-丙醇和0.25％Triton X-100)。使用混合器在室温下将管搅拌15分钟，使得沉淀完全溶解。将200μl的每个样品分配在96孔微孔板中。使用酶标仪在600nm的波长下获得吸光度值。使用分析软件(KC4v3.4DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)通过线性法计算GAG浓度。计算2次测量的GAG浓度的平均值(μg/ml)。

计算校准样品的GAG浓度的准确度。当准确度和相关系数并不处于评价标准中时，不计算组织样品中的GAG浓度。(准确度的评价标准：变异系数在15％以内(对20μg/ml样品在20％以内)。相关系数的评价标准：0.997或更高(四舍五入至小数点后4位))。

通过以下公式将在脑样品中测量的GAG浓度转换为在脑的干重中的浓度：

$\[GAG\]d=\frac{\[GAG\]s\×A}{W}$

[GAG]d＝干组织中的GAG浓度(μg/mg)

[GAG]s＝样品中的GAG浓度(μg/ml)

A＝添加剂量(ml)

W＝干组织重量(mg)

结果

图36是示出每个结合物在每种剂量下的GAG降低的图表(表示为JR-032实现的降低的百分比)。实施例17中所描述的研究的同一结合物所实现的GAG降低也被包括在本图表中以用于比较)。

其他实施方式

在本说明书中所提及的所有专利、专利申请和出版物均在此通过引用而并入本文，包括2012年11月30日提交的美国临时申请号61/732,145和2013年6月6日提交的美国临时申请号61/831,919，其程度如同指出每件独立地专利、专利申请或出版物均具体地且独立地通过引用而并入。

Claims (67)

1.一种化合物，包含(a)少于150个氨基酸的肽或肽靶向部分和(b)选自由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、具有IDS活性的IDS片段或IDS类似物组成的组中的酶，其中所述靶向部分能够将所述酶、片段或类似物运输穿过血脑屏障，其中所述化合物表现出IDS酶活性，其中所述靶向部分和所述酶、片段或类似物经由接头连接，并且其中连接所述酶和所述肽靶向部分的所述接头能够通过点击化学反应对之间的点击化学反应来形成并且所述接头不具有以下结构：

2.权利要求1的化合物，其中所述接头选自由以下各项组成的组中：含单氟环辛炔(MFCO)的接头、含二氟环辛炔(DFCO)的接头、含(DBCO)的接头、含环辛炔(OCT)的接头、含二苯并环辛炔(DIBO)的接头、含二芳基氮杂环辛炔(BARAC)的接头、含二氟苯并环辛炔(DIFBO)的接头和含二环[6.1.0]壬炔(BCN)的接头。

3.权利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分包含至少70％同一于SEQ ID NO:1-105和107-117中任一项的氨基酸序列。

4.权利要求3的化合物，其中所述靶向部分包含血管肽素-2(SEQ IDNO:97)的序列。

5.权利要求4的化合物，其中所述靶向部分可选地包含SEQ ID NO:97中记载的氨基酸的一个或多个D-异构体。

6.权利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分包含式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中：

X3为Asn或Gln；

X4为Asn或Gln；且

X5为Phe、Tyr或Trp；

其中所述靶向部分可选地包含式Ia中记载的氨基酸的一个或多个D-异构体。

7.权利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分包含式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)，其中：

X3为Asn或Gln；

X4为Asn或Gln；

X5为Phe、Tyr或Trp；

Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；且

Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；并且

其中所述靶向部分可选地包含式Ib、Z1或Z2中记载的氨基酸的一个或多个D-异构体。

8.权利要求7的化合物，其中所述靶向部分包含式Ib、Z1或Z2中记载的氨基酸的至少三个D-异构体。

9.权利要求8的化合物，其中所述靶向部分具有式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr。

10.权利要求8的化合物，其中所述靶向部分具有式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr。

11.权利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分包含式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)，

其中：

X1为Lys或D-Lys；

X2为Arg或D-Arg；

X5为Phe或D-Phe；且

X6为Lys或D-Lys；且

其中，X1、X2、X5或X6中的至少一个是D-氨基酸。

12.权利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分包含式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)，

其中：

X1为Lys或D-Lys；

X2为Arg或D-Arg；

X5为Phe或D-Phe；

X6为Lys或D-Lys；和

X7为Tyr或D-Tyr；且

其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个为D-氨基酸。

13.权利要求1或2的化合物，其中所述靶向部分包含式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)，

其中：

X1为Lys或D-Lys；

X2为Arg或D-Arg；

X5为Phe或D-Phe；

X6为Lys或D-Lys；

X7为Tyr或D-Tyr；

Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；且

Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；

其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个为D-氨基酸；且

其中，所述靶向部分可选地包含Z1或Z2中记载的氨基酸的一个或多个D-异构体。

14.权利要求1-13中任一项的化合物，其中所述接头为含二环[6.1.0]壬炔(BCN)的接头。

15.权利要求1-13中任一项的化合物，其中所述接头为含单氟环辛炔(MFCO)的接头。

16.一种具有以下通用结构的化合物：

其中R¹为：

其中，酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数并且其中附接至酶的NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

17.权利要求16的化合物，其中一个或多个附接至酶的NH基团来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。

18.权利要求17的化合物，其中附接至酶的一个或多个NH基团来源于对应于全长人类IDS同种型a的赖氨酸199和/或赖氨酸376的伯氨基基团。

19.权利要求16至18中任一项的化合物，其中n为1。

20.权利要求16至18中任一项的化合物，其中n为2。

21.一种如在权利要求16-20中任一项中限定的式III的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间。

22.一种具有以下通用结构的化合物：

其中R¹为：

其中，酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数，并且其中附接至酶的NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

23.一种如在权利要求22中限定的式VI的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间。

24.权利要求23的化合物的群体，其中n的平均值为约2.3。

25.权利要求22至24中任一项的化合物或化合物的群体，其中附接至酶的一个或多个NH基团来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。

26.权利要求25的化合物或化合物的群体，其中附接至酶的一个或多个NH基团来源于对应于全长人类IDS同种型a的赖氨酸199和/或赖氨酸479的伯氨基基团。

27.一种具有以下通用结构的化合物：

其中R²为：

其中，酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数，并且其中附接至酶的在NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

28.一种如在权利要求27中限定的式VII的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间。

29.权利要求28的化合物的群体，其中n的平均值为约2.3、约4.4或约5.0。

30.一种具有以下通用结构的化合物：

其中R²为：

其中，酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数，并且其中附接至酶的NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

31.一种如在权利要求30中限定的式VIII的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间。

32.权利要求31的化合物的群体，其中n的平均值为约4.9。

33.权利要求30至32中任一项的化合物或化合物的群体，其中附接至酶的一个或多个NH基团来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。

34.权利要求33的化合物或化合物的群体，其中附接至酶的一个或多个NH基团来源于对应于全长人类IDS同种型a的赖氨酸199、赖氨酸211和赖氨酸376的伯氨基基团中的一个或多个。

35.一种具有以下通用结构的化合物：

其中R³为：

其中酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为1和6之间的整数，并且其中附接至酶的NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

36.一种如在权利要求35中限定的式IX的化合物的群体，其中n的平均值在1和6之间。

37.权利要求36的化合物的群体，其中n的平均值为约1.3。

38.一种具有以下通用结构的化合物：

其中，酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为经由接头附接至IDS的血管肽素-2部分的数目并且为1和6之间的整数，附接至An₂Cys的S部分表示血管肽素-2-Cys中的半胱氨酸上的侧链硫化物，并且其中附接至酶的NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

39.一种如在权利要求38中限定的式X的化合物的群体，其中n的平均值在0.5和6之间。

40.权利要求39的化合物的群体，其中n的平均值为约0.8。

41.一种具有以下通用结构的化合物：

其中，酶表示IDS、IDS的活性片段或IDS的活性类似物，其中n为经由接头附接至IDS的血管肽素-2部分的数目并且为1和6之间的整数，其中Cys-An₂为Cys-血管肽素-2，附接至Cys-An₂的S部分表示Cys-血管肽素-2中的半胱氨酸上的侧链硫化物，并且其中附接至酶的NH基团来源于所述酶中的伯氨基基团的反应。

42.一种如在权利要求41中限定的式XI的化合物的群体，其中n的平均值在0.5和6之间。

43.权利要求42的化合物的群体，其中n的平均值为约0.9。

44.一种具有以下通用结构的化合物：

其中A为酶，所述酶选自由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、具有IDS活性的IDS片段或具有IDS活性的IDS类似物组成的组；附接至A的NH基团来源于A中的伯氨基基团的反应；n为1和8之间的整数；并且B为羟基、可选取代的C_1-10烷基、可选取代的C_1-10烯基、可选取代的炔基、可选取代的芳基、杂环、可选取代的C_1-10烷氧基、可选取代的C_1-10烷基氨基、可选取代的C_3-10环烷基、可选取代的C₄-₁₀环烯基、可选取代的C_4-10环炔基、氨基酸或2-5个氨基酸的肽。

45.权利要求44的化合物，其中B为氨基酸、2-5个氨基酸的肽或选自：

46.权利要求44的化合物，其中B为：

47.一种如在权利要求44中限定的式XIII的化合物的群体，其中n的平均值在1和8之间。

48.权利要求46至47中任一项的化合物或化合物的群体，其中附接至A的一个或多个NH基团来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。

49.权利要求48的化合物或化合物的群体，其中附接至A的一个或多个NH基团来源于对应于全长人类IDS同种型a的赖氨酸199、赖氨酸240、赖氨酸295、赖氨酸347、赖氨酸479和赖氨酸483的伯氨基基团中的一个或多个。

50.权利要求49的化合物或化合物的群体，其中附接至A的一个或多个NH基团来源于对应于全长人类IDS同种型a的赖氨酸199、赖氨酸479和赖氨酸483的伯氨基基团中的一个或多个。

51.权利要求44的化合物，其中B为：

52.一种如在权利要求51中限定的式XIII的化合物的群体，其中n的平均值在1和8之间。

53.权利要求51或52的化合物或化合物的群体，其中附接至A的一个或多个NH基团来源于一个或多个赖氨酸残基的伯氨基基团。

54.权利要求53的化合物或化合物的群体，其中附接至A的一个NH基团来源于对应于全长人类IDS同种型a的赖氨酸479的伯氨基基团。

55.权利要求1至54中任一项的化合物或化合物的群体，其中IDS或所述IDS片段具有人类IDS同种型a的氨基酸序列或其片段，或者其中所述IDS类似物与全长人类IDS同种型a的序列具有至少70％的同一性。

56.权利要求55的化合物或化合物的群体，其中IDS具有人类IDS同种型a的序列或者同种型a的成熟形式(同种型a的氨基酸26-550)。

57.一种包含一种或多种纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒被结合到权利要求1-56中任一项的化合物或化合物的群体。

58.一种组合物，包含权利要求1-56中任一项的化合物或化合物的群体的脂质体制剂。

59.一种药物组合物，包含权利要求1-56中任一项的化合物或化合物的群体以及药学上可接受的载体。

60.一种治疗或预防性治疗患有粘多糖贮积症II型(MPS-II)的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者给予权利要求1-56中任一项的化合物或化合物的群体或者权利要求57-59中任一项的组合物。

61.权利要求60的方法，其中所述受试者具有严重形式的MPS-II。

62.权利要求60的方法，其中所述受试者具有轻度形式的MPS-II。

63.权利要求60的方法，其中所述受试者具有神经性症状。

64.权利要求60的方法，其中所述受试者在五岁龄以下开始治疗。

65.权利要求64的方法，其中所述受试者在三岁龄以下开始治疗。

66.权利要求65的方法，其中所述受试者是婴儿。

67.权利要求60至66中任一项的方法，其中所述给予包括胃肠外给予。