CN111304319A - 一种疾病的诊断标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种HBG2基因的检测物在制备用于诊断、预后评估或监测肝癌的产品中的应用。检测个体红细胞中HBG2基因表达量可以诊断个体是否患肝癌、患病风险度、患病危险度分层、预后评估，为临床治疗提供决策支持。

Description

一种疾病的诊断标志物及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及疾病的诊断标志物，优选为肝硬化或肝癌，所述的诊断标志物为红细胞中HBG2基因的表达量，尤其涉及HBG2基因的检测物在制备用于诊断、预后评估或监测肝病的产品中的应用。

背景技术

原发性肝癌具有高发病率、高死亡率的特点。我国原发性肝癌发病率较高，居恶性肿瘤第四位，死亡率居恶性肿瘤第三位，且病情发展极快，被称为“癌中之王”。基于乙型肝炎疫苗接种，乙、丙型肝炎抗病毒药物的应用以及黄曲霉毒素污染减少，原发性肝癌发病率开始慢慢下降。

晚期原发性肝癌的主要治疗方式是全身系统性治疗，包括分子靶向治疗、全身系统化疗及免疫治疗等，有效率不高，尚不能令人满意。而另外一类备受关注的药物是免疫检查点抑制剂，如抗PD-1/PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体，这些药物正处于Ⅲ期临床试验中。但是肝癌的病死率还是非常高。

肝癌的诊断标准：肝癌的高危人群主要包括：具有乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)感染、长期酗酒、非酒精脂肪性肝炎、食用被黄曲霉毒素污染食物、各种原因引起的肝硬化、以及有肝癌家族史等的人群，尤其是年龄40岁以上的男性风险更大。

血清甲胎蛋白(AFP)和肝脏超声检查是早期筛查的主要手段，建议高危人群每隔6个月进行至少一次检查。乙型或丙型肝炎以及肝硬化是肝癌的高危因素，对于肝脏占位性病变的诊断和鉴别诊断有重要的价值。近年来，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)与肝癌的关系越来越引起重视。

AFP在缺乏敏感的影像学方法情况下曾用于肝癌的临床诊断，如果AFP≥400μg/L，在排除妊娠、慢性或活动性肝病以及生殖腺胚胎源性肿瘤情况下，则高度提示肝癌。结合肝癌发生的高危因素、影像学特征以及血清学分子标记物，依据路线图的步骤对肝癌做出临床诊断(见图1)。具体路线如下：

1.有乙型肝炎或丙型肝炎，或者有任何原因引起肝硬化者，至少每隔6个月进行一次超声及AFP检测，发现肝内直径≤2cm结节，动态增强MRI、动态增强CT、超声造影及普美显动态增强MRI四项检查中至少有两项显示有动脉期病灶明显强化、门脉或延迟期强化下降的「快进快出」的肝癌典型特征，则可做出肝癌的临床诊断；对于发现肝内直径＞2cm的结节，则上述四种影像学检查中只要有一项有典型的肝癌特征，即可临床诊断为肝癌。

2.有乙型肝炎或丙型肝炎，或者有任何原因引起肝硬化者，随访发现肝内直径≤2cm结节，若上述四种影像学检查中无或只有一项检查有典型的肝癌特征，可进行肝穿刺活检或每2～3个月密切的影像学随访以确立诊断；对于发现肝内直径＞2cm的结节，上述四种影像学检查无典型的肝癌特征，则需进行肝穿刺活检以确立诊断。

3.有乙型肝炎或丙型肝炎，或者有任何原因引起肝硬化者，如AFP升高，特别是持续增高，应该进行上述四种影像学检查以确立肝癌的诊断，如未发现肝内结节，在排除妊娠、活动性肝病、生殖胚胎源性肿瘤以上消化道癌的前提下，应该密切随访AFP水平以及每隔2～3个月一次的影像学复查。

综上，目前肝癌的诊断标志物单一，只有AFP，故进一步开发诊断标志物成为了现阶段的研究热点。例如：专利文献CN110057955A公开了乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法，包括血清样本的收集和贮存、血清样本的处理方法、正相和反相色谱技术条件、质谱数据采集和分析、非靶向代谢组数据处理、有显著性差异的结果筛选、筛选结果的验证和应用等。通过该方法筛选出了乙型肝炎特异性血清标志物，并对这些血清标志物通过PCA分析、OPLS-DA分析及敏感性验证。专利文献CN110057954A公开了血浆代谢标志物在诊断或监测HBV的应用以及将乙型肝炎病毒感染者与非乙型肝炎病毒感染者向区分的试剂盒。

关于HBG2基因，现有研究主要将其用于牙釉质型颅咽管瘤组织或者鼻咽癌的诊断标志物，例如：非专利文献：荧光定量PCR法检测牙釉质型颅咽管瘤组织ADAMDEC1、SCAPER、TRPM2、CGA和HBG2基因，尹华等，《实用临床医学》，2008，公开了在基因转录水平上检测ADAMDEC1、SCAPER、TRPM2、CGA和HBG2基因在牙釉质型颅咽管瘤组织中的表达水平，结果显示，CGA和HBG2基因的表达水平明显下降，说明CGA和HBG2基因的表达水平可以进一步研究是否可以作为颅咽管瘤的标志物。专利文献CN102168129A公开了一种检测鼻咽癌放射敏感性基因的方法及其引物与荧光探针，其中鼻咽癌放射敏感性基因包括HBG2基因。

因此，本发明提供了将HBG2基因作为疾病，尤其是肝病，优选为肝硬化或肝癌的诊断标志物，用于诊断、预后评估或监测肝病，或者用于将肝病与非肝病相区分。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、敏感度高的生物标志物，该生物标志物为红细胞中的HBG2基因，通过检测样本中的HBG2基因的表达量，来独立或辅助判断个体患病与否、监测个体在疾病发展的过程、临床预后评估等。

本发明人通过创造性劳动，确定患者的红细胞中HBG2基因的表达量，较健康个体红细胞中HBG2基因的表达量显著增高，蛋白质水平平均值达2-5倍的差距。且HBG2基因的表达量越高患病的风险度越高。因此本发明提供将红细胞中HBG2基因作为生物标志物，来诊断、预后评估或监测疾病。

具体地，本发明的第一方面，提供了HBG2基因的检测物在制备用于诊断、预后评估或监测疾病的产品中的应用。

优选的，所述的HBG2基因的检测物为检测HBG2基因表达量的检测物。进一步优选包括检测蛋白质水平和/或RNA水平的检测物。

优选的，所述的HBG2可以为细胞、组织、脏器、血液、消化液、咳痰、淋巴液、尿、粪便或肺泡支气管清洗液等。

进一步优选的，所述的HBG2为红细胞中的HBG2。

优选的，所述的HBG2基因的检测物检测红细胞中HBG2基因表达量后与阈值比较。

优选的，所述的阈值可以为蛋白质水平阈值或者RNA水平阈值。

所述阈值优选为蛋白质水平阈值。优选的，所述的蛋白质水平阈值为对照组的1.5-5倍。进一步优选的，所述的蛋白质水平阈值为对照组的2-5倍。特别优选为2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。其中，所述的对照组为若干例健康人红细胞中HBG2基因表达量的平均值。

所述阈值优选为RNA水平阈值。优选的，所述的RNA水平阈值为对照组的1-999倍。进一步优选的，所述的RNA水平阈值为对照组的5-500倍。特别优选为2、5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、999倍及各数字期间的任一倍数。其中，所述的对照组为若干例健康人红细胞中HBG2基因转录RNA量的平均值。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病为肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。

在本发明的一个具体实施方式，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

优选的，所述检测的方法包括但不限于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台。

优选的，所述的产品包括但不限于试剂盒、芯片、药物、引物或探针等。

进一步优选的，所述的芯片上固定有检测HBG2基因表达量的抗体、引物和/或探针。

进一步优选的，所述的药物中包含检测HBG2基因表达量的抗体、引物和/或探针。

进一步优选的，所述的试剂盒中包括所述的芯片、抗体、引物和/或探针。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的引物包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

优选的，所述的产品还包括其他标志物的检测物或者其他诊断、预后评估或监测所用的试剂。

本发明的第二方面，提供了一种用于诊断、预后评估或监测疾病的产品，所述的产品中包含HBG2基因的检测物。

优选的，所述的产品中包含检测HBG2基因表达量的检测物。

优选的，所述的HBG2可以为细胞、组织、脏器、血液、消化液、咳痰、淋巴液、尿、粪便或肺泡支气管清洗液等。

进一步优选的，所述的HBG2为红细胞中的HBG2。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

优选的，所述的产品包括但不限于试剂盒、芯片、药物、抗体、引物或探针等。

进一步优选的，所述的芯片上固定有检测HBG2基因表达量的抗体、引物和/或探针。

进一步优选的，所述的药物中包含检测HBG2基因表达量的抗体、引物和/或探针。

进一步优选的，所述的试剂盒中包括所述的芯片、抗体、引物和/或探针。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的引物包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

优选的，所述的产品还包括其他标志物的检测物或者其他诊断、预后评估或监测所用的试剂。

本发明的第三方面，提供了一种诊断、预后评估或监测疾病的生物标志物，所述的生物标志物为HBG2基因。

优选的，所述的HBG2可以为细胞、组织、脏器、血液、消化液、咳痰、淋巴液、尿、粪便或肺泡支气管清洗液等。

进一步优选的，所述的生物标志物为红细胞中HBG2基因。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

本发明的第四方面，提供了一种HBG2基因在作为诊断、预后评估或监测疾病的生物标志物中的应用。

优选的，所述的HBG2可以为细胞、组织、脏器、血液、消化液、咳痰、淋巴液、尿、粪便或肺泡支气管清洗液等。

进一步优选的，所述的HBG2基因为红细胞中的HBG2基因。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

本发明的第五方面，提供了一种用于诊断、预后评估或监测疾病的核酸或核酸组合物，所述的核酸或核酸组合物包括HBG2基因的检测物。优选的，所述的核酸或核酸组合物为检测HBG2基因表达量的引物和/或探针。

优选的，所述的HBG2可以为细胞、组织、脏器、血液、消化液、咳痰、淋巴液、尿、粪便或肺泡支气管清洗液等。

进一步优选的，所述的检测HBG2基因表达量为检测红细胞中HBG2的表达量。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的引物包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

本发明的第六方面，提供了一种诊断个体是否患有疾病的方法，包括：

1)分析健康人与患者红细胞中HBG2基因的表达量，确定患病的阈值；

2)采用本发明所述的产品检测个体红细胞中HBG2基因的表达量，并将表达量值与阈值相比，表达量值大于阈值为患病，表达量值小于阈值未患病。

优选的，所述的阈值可以为蛋白质水平阈值或者RNA水平阈值。

优选的，所述的蛋白质水平阈值为对照组的1.5-5倍。进一步优选的，所述的蛋白质水平阈值为对照组的2-5倍。特别优选为2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。其中，所述的对照组为若干例健康人红细胞中HBG2基因表达量的平均值。

所述阈值优选为RNA水平阈值。优选的，所述的RNA水平阈值为对照组的1-999倍。进一步优选的，所述的RNA水平阈值为对照组的5-500倍。特别优选为2、5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、999倍及各数字期间的任一倍数。其中，所述的对照组为若干例健康人红细胞中HBG2基因转录RNA量的平均值。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病为肝硬化或肝癌。

本发明的第七方面，提供了一种监测个体在疾病发展过程的方法，包括间隔一定时间检测个体红细胞中HBG2基因的表达量。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

本发明的第八方面，提供了一种疾病的预后评估方法，包括在患者样本组中检测HBG2基因的表达量，取样本组表达量中位值，将其分为低表达组和高表达组；检测预后个体红细胞中HBG2基因的表达量，将表达量在低表达组的患者归为预后低风险组，将表达量在高风险组的患者归为预后高风险组。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

优选的，所述检测的方法包括但不限于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台。

本发明的第九方面，提供了一种筛选肝硬化或肝癌患者的生物标志物的方法，包括提取健康人、肝癌患者、肝硬化患者的外周血，并将外周血中红细胞和血浆分离后，将若干例健康人、肝癌患者、肝硬化患者的红细胞各混合一组，将健康人、肝癌患者、肝硬化患者的血浆混合另一组，分别采用质谱分析差异蛋白，鉴定出不同组红细胞中的差异蛋白，再经软件、非靶向代谢组学数据处理及验证，确定最终的生物标志物。

在本发明的具体实施方式中，所述的肝癌患者30例、肝硬化患者30例、健康人30例。

在本发明的一个具体实施方式中，筛选HBG2作为肝硬化或肝癌患者红细胞里癌症标志物。

本发明的第十方面，提供了一种建立诊断、预后评估或监测疾病的模型的方法，所述的方法包括检测健康人与患者的HBG2基因的表达量，确定患病的阈值。

优选的，所述的方法包括：

分别取健康人与患者外周血样本，并分离红细胞；

检测健康人与患者红细胞中的HBG2基因的表达量；

对比健康人与患者红细胞中的HBG2基因的表达量，确定患病阈值。

优选的，所述检测的方法包括但不限于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台。

优选的，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。进一步优选的，所述的疾病选自肝病。特别优选的，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的肝病患者60例、健康人30例。

本发明的第十一方面，提供了一种诊断、治疗、预后评估或监测肝病的药物组合物，所述的药物组合物包括HBG2基因的抑制剂。

优选的，所述的抑制剂包含HBG2基因的表达载体。进一步优选的，所述的HBG2基因的表达载体可以使HBG2表达量降低。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抑制剂为siRNA。

优选的，所述的药物组合物包含敲除HBG2基因的试剂。进一步优选的，所述的敲除HBG2基因的试剂包括但不限于sgRNA或Cas蛋白等。

优选的，所述的药物组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

优选的，所述的药物组合物可以为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂、气雾剂、膜剂、注射剂、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂、小药丸、鼻制剂、肺制剂(吸入剂)、眼睛滴剂等等、口服或胃肠外制剂。其中，所述的片剂包含糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等；胶囊剂包括软胶囊、微胶囊等；控制释放制剂包含瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊等；膜剂包含口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂等；注射剂包含皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射；栓剂包含直肠栓剂、阴道栓剂；胃肠外制剂指在静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠内等给药形式、给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处。

优选的，所述的药物组合物可单独使用，或与其他种类的药物制剂联合使用。

本发明所述的“检测物”包括但不限于探针或引物等PCR检测所用到的试剂，或者缓冲液、酶或流动相等色谱检测所用到的试剂。优选的，所述的检测物为试剂盒、药物、引物、探针或芯片等。

本发明所述的“药学上可接受的载体和/或辅料”包括但不限于填充剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂，缓冲剂、抑菌剂、水和/或非水的无菌悬浮剂等；其中，所述填充剂选自：乳糖、微晶纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素中的一种或两种以上的组合；所述粘合剂选自：淀粉、糊精、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、蔗糖中的一种或两种以上的组合；所述润滑剂选自：蒸馏水、乙醇、淀粉浆中的一种或两种以上的组合；所述的非水的无菌悬浮剂选自助悬剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂或防腐剂等。优选的，所述的载体还可以包括质粒、噬菌体或病毒等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

本发明所述的“自身免疫疾病”包括但不限于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮或干燥综合征。

本发明所述的“病毒”为肝炎病毒、乳头状病毒、单纯孢疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类孢疹病毒4型(EBv)、冠状病毒和流感病毒，优选为肝炎病毒，如乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。

本发明所述“细菌性疾病”包括但不限于麻风病或肺结核。

本发明所述的“个体”包括人和非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猴子、斑马鱼、猪、鸡、兔子等。

本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

本发明所述的“诊断”指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症。

本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。

本发明所述的“监测”指查明疾病的进展或将来可能的进展。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：肝癌的临床诊断标准及路线图。

图2：分别检测肝癌、肝硬化、肝正常对照组的红细胞中HBG2蛋白的表达量，并对比分析整体的组和组之间的比较。

图3：正常人(对照组)、肝硬化、肝癌患者的红细胞中HBG2的Log2蛋白丰度值对比图，结果表明个体重复性好。

图4：Realtime PCR验证，其中，横坐标为样本编号，纵坐标为RNA表达量，结果显示，编号3-8为6例肝癌患者外周血样本，9-14为6例正常人外周血样本，结果表明从RNA水平也显示在外周血HBG2在肝癌组升高。

图5：肝癌患者病理组织的免疫组化染色结果，即肝癌组织癌细胞高表达血红蛋白HBG2的结果图。

图6：转染HBG2-RNAi组与野生型组相比，细胞存活率对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中使用的主要试剂、仪器来源如下：

尿素(Urea)(货号：U0631-500G)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)(货号：43815-1G)、羧基氨基甲烷(Tris)(货号：10708976001)、碘乙酰胺(Iodacetamide,IAA)(货号：I1149-5G)、甲酸(Formic acid)(货号：F0507-100ML)、氨水(货号：338818-5ML)购自sigma公司；

胰蛋白酶(trypsin)(货号：HLS TRY001C)购自华利世公司；

质谱级乙腈和水购自Thermo公司；

BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0011)，蛋白酶抑制剂，购自碧云天公司；

超滤离心管(10kD)购自美国PALL公司；

其它试剂均为国产分析纯。

EASY-nLC 1000液相色谱购自美国Thermo公司；

Thermo Q Exactive HF质谱仪购自美国Thermo公司；

Eppendorf冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；

真空冷冻干燥机购自美国Thermo公司；

超声波细胞粉碎机VCX130购自美国Sonics公司。

实施例1

分别取30例肝癌患者年龄54.21±9.96和30例肝正常人年龄54.8±4.37(来源于临床肝癌患者和体检中心的健康人)，取外周血样本分离红细胞和血浆后各自混合，分别检测红细胞和血浆中的HBG2表达量。

检测步骤如下：

1、样品收集-红细胞分离

1)EDTA抗凝血2mL；

2)离心3000转5min后弃血浆层白膜层；

3)加生理盐水5mL混匀洗，离心3000转5min，重复3次，获得压积红细胞。

2、样品准备

取2μL步骤1获得的压积红细胞用于酶切。并分别取1μL混合pool用于建库。将血清和pool样品使用FASP(filter-aided sample preparation)方法进行酶切。

其中，蛋白质酶切(FASP)步骤如下：

样品按体积加入含有终浓度10mM DTT的100μL 50mM碳酸氢铵(ABC)，56℃40min。然后加入10μL 0.5M IAA常温避光30min。加入100μL Urea buffer，12000g离心10min，重复两次。加入100μL 50mM的ABC到超滤管中，12000g离心10min，重复两次。每个样品加入适量胰酶(胰酶：蛋白为1:50)和200μL 50mM ABC。放入37℃的水浴锅酶解16-18h。将超滤管转移到新的收集管中，12000g离心10min收集。往超滤管中再加入100μL ABC，12000g离心10min收集。用nano-drop的蛋白浓度检测模式直接测定。

数据依赖性采集模式(DDA)进行建库步骤如下：

pool样本进行一维高pH反相分离

将合并的肽段用100μL A相溶液溶解并离心，使用注射器吸取上清并注入到上样环里面。按照色谱梯度进行分离收集。

柱子信息：Gemini-NX 5u c18 110A 250x 4.6mm(Phenomenex,Guangzhou,China)

色谱仪器：Shimadzu LC-20AB HPLC Pump system A相：2％ACN pH10

B相：98％ACN,pH 10

紫外检测波长：214nm流速：1000μL/min

色谱梯度：

Stop

根据峰型和时间共收取并合并成10个组分，真空离心浓缩(rotation vacuumChrist RVC2-25，Christ，Germany)。

3、反相液质联用RPLC-MS

DDA分析：将10个组分样品，依次进行LC MSMS检测。将多肽样本溶于25μL的A液(0.1％甲酸的水，含iRT标准肽)中，进样5μL，在EASY-nano-LC 1200色谱系统上以4.5μL/min的流速载样至预柱上，随后以600nL/min的流速在分析柱上进行分离。色谱分离的梯度为：0min-15min，B液(含0.1％甲酸，80％的乙腈)从7％到15％线性上升；15min-85min B液从15％到30％线性上升；85min-110min B液从30％到50％线性上升，然后在2min内B液升至95％并维持到120min。质谱数据的采集使用Thermo Q Exactive HF质谱仪(ThermoScientific)，具体参数设置如下：离子源的喷雾电压设为2.1kV。一级的扫描范围为300-1400m/z、分辨率为60K(@m/z 200)，AGC target为3e⁶，Maximum IT:80ms；二级的分辨率15K(@m/z 200)、Isolation window 1.6Th、AGC target为5e4、maximum IT为40ms、loop count为20，collision energy:30，电荷状态为2-6，动态排除时间为30s。

DIA分析：每例样品各取2μg肽段，分别掺入适量iRT标准肽段，每个样品进行1次2hDIA质谱测试。在EASY-nano-LC 1200色谱系统上以4.5μL/min的流速载样至预柱上，随后以300nL/min的流速在分析柱上进行分离，色谱分离的梯度为：0min-15min，B液(含0.1％甲酸，80％的乙腈)从7％到15％线性上升；15min-85min B液从15％到30％线性上升；85min-110min B液从30％到50％线性上升，然后在2min内B液升至95％并维持到120min。质谱数据的采集使用Thermo Q Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)，具体参数设置如下：离子源的喷雾电压设为2.1kV。300-1400m/z，分辨率为60K(@m/z 200)，AGC target为3e⁶，Maximum IT:80ms；在该扫面范围内使用45个可变窗口分别采集二级质谱，二级分辨率30K(@m/z 200)、AGC target为3e6、maximum IT为45ms、MS2 Activation为HCD(collisionenergy:28)。

数据分析：质谱采集的DDA原始数据导入到Spectronout Pulsar X(Biognosys公司)建立DDA谱图库，建库参数使用默认最优参数“BGS factory setting”。然后将DIA原始数据导入到Spectronout Pulsar X进行蛋白质定性定量分析。建库参数：Peptides FDR\PSMs FDR\Proteins FDR均为1％，每个peptides选择至少三个，至多选择最优6个子离子生成库谱图。定量参数：iTR标曲采取非线性拟合(Local(Non-Linear)Regression)；蛋白鉴定使用Precursor Qvalue Cutoff 0.01，Protein Qvalue Cutoff 0.01，p值校正KernelDensity Estimator；蛋白定量使用子离子峰面积，至少选择三个子离子的平均强度定量；差异分析使用Students t-test。

结果显示，混合肝癌患者血浆中HBG2表达量和肝正常人没有差异，混合肝癌患者红细胞里HBG2表达是肝正常人红细胞含量的2倍左右。

实施例2

分别取28位肝癌患者，28位肝硬化患者，28位肝正常人，按照实施例1的检测步骤检测HBG2表达量，进行单病例验证。

结果见表1及图2，肝癌患者外周血红细胞中HBG2表达量明显大于肝硬化患者外周血红细胞中HBG2表达量，肝硬化患者外周血红细胞中HBG2表达量明显大于肝正常人外周血红细胞中HBG2表达量，差异均具有显著性。

表1肝癌、肝硬化及肝正常组外周血红细胞中HBG2质谱肽段表达量比较

实施例3 Realtime PCR验证肝癌外周血里HBG2的表达与正常人的差异

提取6例肝癌患者外周血的RNA，6例正常人的外周血RNA，分别编号并检测HBG2的表达含量，确定编号对应的是肝癌患者还是正常人。同时将检测结果与AFP数据及免疫组化方法对比。

其中HBG2引物如下：

5’-CCCAGAGGTTCTTTGACAGC-3’(SEQ ID NO：1)

5’-TTCTCAGGATCCACATGCAG-3’(SEQ ID NO：2)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO：4)

检测步骤：采用25μL反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μL，正反向引物(5μM)各1μL，模板cDNA 2.0μL，无酶水8.5μL。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃30s，72℃45s)×40个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示。

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

结果如图4显示，外周血HBG2的realtime差异在肝癌组和正常人组差异显著，其中，6例肝癌患者(编号3-8)中4例HBG2比正常人高几倍甚至几十倍。HBG2检测出超过一半的患者，而且和AFP在一些病例上互补。6例肝癌患者AFP数据(1396，878，3161，1696，3，19μg/L)最后2例AFP数据在正常范围内(0-20μg/L)，但是HBG2的数值明显升高。

HBG2在肝癌组织内表达，故采用免疫组化方法，使用抗体检测，1：200浓度，进行肝癌患者病理组织的免疫组化染色，具体步骤如下：

切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行。缓冲液洗3min/2次。为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block中孵育10-15min。缓冲液洗5min/2次。滴加Ultra V Block，在室温下孵育5min以封闭非特异性的背景染色。缓冲液洗5min/2次。滴加一抗工作液37℃孵育1-2h。缓冲液洗5min/2次。滴加Primary Antibody Enhancer(增强子)，在室温下孵育20min。缓冲液洗5min/2次。HRPPolymer(酶标二抗)，在室温下孵育30min。缓冲液洗5min/2次。

向1mL DAB Plus Substrate(或AEC Plus Substrate)中滴加1-2滴DAB PlusChromogen(或AEC Plus Chromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育3-15min。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。结果见图5所示。

实施例4敲除HBG2基因对HEPG2的影响

在肝癌细胞系HEPG2中敲除HBG2基因，HEPG2的增殖受影响。敲除HBG2基因的步骤如下：

1、肝癌细胞系HEPG2细胞培养

人肝癌细胞株HEPG2以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染步骤

HBG2的RNAi序列见表2。

表2 HBG2的RNAi序列

1)转染前一天，将肝癌细胞4000/100μL每孔接种于96孔板中。

2)取1μL转染试剂，用24μL的buffer稀释，轻轻混合均匀；

3)取2μL siRNA，用24μL的buffer稀释，轻轻混合均匀；

4)稀释的siRNA与稀释的转染试剂轻轻混合，室温孵育15min；

5)将混合液每孔10μL加入含有细胞及培养液的孔板中，轻轻摇晃孔板，使混合。

3、CCK8验证肝癌细胞系增殖率

1)将对数增殖期的HEPG2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞；

2)实验分三组，分别是空白组、转染HBG2-1组、HBG2-2组和HBG2-3组，阴性NC组(无靶点RNAi)每组设3个复孔；gfp蛋白组，作为转染效率提示。

3)分别在转染24h后加入10μL/孔CCK8试剂；

4)2h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

结果显示：空白组同空载组无明显差异，而转染HBG2-RNAi组的细胞生长速度明显低于空载体组的细胞生长速度，即基因敲除HBG2后，HEPG2细胞的增值率受到了影响，同时图6中显示，转染HBG2-RNAi组与野生型组相比，肝癌细胞存活率明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明抑制HBG2的表达能够抑制肝癌细胞的生长。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 北京瑞康我科技有限公司

<120> 一种疾病的诊断标志物及应用

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccagaggtt ctttgacagc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctcaggat ccacatgcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccucugcca ucaugggcat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ugcccaugau ggcagaggct t 21

Claims (10)

1.HBG2基因的检测物在制备用于诊断、预后评估或监测疾病的产品中的应用，其特征在于，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的HBG2基因的检测物为检测HBG2基因表达量的检测物；优选的，所述的检测物包括探针、引物、缓冲液、酶或流动相。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的HBG2为红细胞中的HBG2。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的HBG2基因的检测物检测红细胞中HBG2基因表达量后与阈值比较。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肝病，所述的肝病选自病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、肝脓肿或酒精性肝炎；优选的，所述的肝病选自肝硬化或肝癌。

6.一种用于诊断、预后评估或监测疾病的产品，其特征在于，所述的产品中包含HBG2基因的检测物，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。

7.HBG2基因在作为诊断、预后评估或监测疾病的生物标志物中的应用，其特征在于，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的HBG2基因为红细胞中的HBG2基因。

9.一种建立诊断、预后评估或监测疾病的模型的方法，其特征在于，所述的方法包括检测健康人与患者的HBG2基因的表达量，确定患病的阈值，其中，所述的疾病选自肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述的方法包括：

分别取健康人与患者外周血样本，并分离红细胞；

检测健康人与患者红细胞中的HBG2基因的表达量；

对比健康人与患者红细胞中的HBG2基因的表达量，确定患病阈值。

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