CN111289749B

CN111289749B - C型1类尼曼-匹克蛋白检测物在制备筛查肝细胞癌产品中的应用

Info

Publication number: CN111289749B
Application number: CN201811502982.9A
Authority: CN
Inventors: 姜颖; 孙爱华; 贺福初; 李朝英; 周金安; 魏汉东
Original assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2038-12-10
Also published as: CN111289749A

Abstract

本发明公开了一种检测NPC1蛋白含量或活性的系统或检测NPC1基因含量或表达量的系统的新用途。所述用途选自下述至少一种：1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品；2)制备预测癌症预后的产品；3)制备癌症治疗伴随诊断的产品。发明人通过实验证明NPC1在肝癌组织及血清样本中明显高表达，可作为肝癌诊断标志物。NPC1丰度与肝癌患者差的预后正相关，丰度越高，预后越差，可独立或联合SOAT1或联合其他蛋白作为肿瘤尤其肝癌的早诊、预后或指导诊疗的标志物。

Description

C型1类尼曼-匹克蛋白检测物在制备筛查肝细胞癌产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种检测C型1类尼曼-匹克蛋白检测物在制备筛查肝细胞癌产品中的应用。

背景技术

肝脏是体内胆固醇代谢中心，在维持体内胆固醇代谢平衡中发挥了至关重要的作用。肝脏可通过从头合成的方式产生大量的胆固醇。血液胆固醇含量与肝癌发生率明显正相关。细胞内胆固醇的水平对细胞的生长、增殖、分化等生命活动均非常重要。临床研究表明肝癌患者的血清胆固醇含量明显降低。但肝癌组织中的胆固醇水平明显高于癌旁组织。C型1类尼曼-匹克蛋白(NPC1)是细胞内溶酶体及晚期内吞体中一个含有固醇感受域的跨膜糖蛋白，参与内源性胆固醇转运，它能监测细胞胆固醇水平的变化，可能通过改变小泡转运方式或直接参与脂质跨膜转运来调节细胞脂质平衡。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤。全世界每年新发和死亡的肝癌患者55％发生在我国，肝癌疾病负担重，5年生存率仅10％左右。其主要原因是大部分肝癌病人诊断时已属晚期而失去手术机会，但即使是小于3cm的小肝癌,有的患者可生存达10年或20年之久，有些则在一年内死亡，数月内复发。目前临床上常用的肝癌诊断标记物为甲胎蛋白(AFP)。然而，AFP诊断肝癌的敏感度和特异度并不十分理想。寻找敏感的肝癌生物标记物，对于早期诊断肝细胞癌并指导后续的诊疗非常重要。基于肝癌患者组织芯片及血清中具有标志性变化的蛋白质建立一种检测并提示肝癌预后及后续诊疗的检测方法，有助于肝癌的临床诊断。

发明内容

本发明的目的是提供检测C型1类尼曼-匹克蛋白(NPC1)蛋白含量或活性的系统以及检测NPC1基因含量或表达量的系统的新用途。

本发明所提供的检测C型1类尼曼-匹克蛋白(NPC1)蛋白含量或活性的系统以及检测NPC1基因含量或表达量的系统的新用途具体为在下述至少一方面的应用：1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品；2)制备预测癌症预后的产品；3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。

本发明还保护检测NPC1蛋白含量或活性的系统和其联合检测SOAT1(胆固醇酯化酶)蛋白含量或活性的系统在下述至少一方面的应用：1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品；2)制备预测癌症预后的产品；3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。

本发明还保护检测NPC1基因含量或表达量的系统和其联合检测SOAT1(胆固醇酯化酶)基因含量或表达量的系统在下述至少一方面的应用：1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品；2)制备预测癌症预后的产品；3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。

上述应用中，所述检测NPC1蛋白含量或活性的系统包括检测NPC1蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器。

所述检测NPC1基因含量或表达量的系统包括检测NPC1基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。

所述检测NPC1基因含量或表达量所需的试剂包括：特异性扩增NPC1的引物，或特异性检测NPC1的抗体。

上述应用中，所述检测SOAT1(胆固醇酯化酶)蛋白含量或活性的系统包括检测SOAT1(胆固醇酯化酶)蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器。

所述检测SOAT1(胆固醇酯化酶)基因含量或表达量的系统包括检测SOAT1(胆固醇酯化酶)基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。

所述检测SOAT1(胆固醇酯化酶)基因含量或表达量所需的试剂包括：特异性扩增SOAT1(胆固醇酯化酶)的引物，或特异性检测SOAT1(胆固醇酯化酶)的抗体。

上述应用中，所述检测所采用的样本为健康人或肝硬化(LC)患者或乙型肝炎患者或癌症患者(如肝细胞癌患者)的血(如血液、血清、血浆)或组织(如肝组织)。

以血为检测样本时，通常可采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血中NPC1浓度或SOAT1浓度。

以组织为检测样本时，通常可采用免疫组化检测组织中NPC1的表达量或SOAT1的表达量。

上述应用中，所述产品可为系统，所述系统可包括试剂和/或仪器。所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。所述试剂盒可为荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒或其它。

本发明还保护一种产品。所述产品具有下述至少一种用途：1)筛查或辅助诊断癌症；2)预测癌症预后；3)癌症治疗的伴随诊断。

本发明所提供的产品，其包括上述的检测NPC1蛋白含量或活性的系统，或检测NPC1基因含量或表达量的系统。

其中，待测样本包括(但不限于)血液、血清、血浆及组织活检物。

在本实施例中，所述用于检测NPC1蛋白浓度的物质为NPC1蛋白抗体，具体为免疫组化、免疫印迹所用NPC1抗体(Abcam公司，货号：ab55706)或ELISA所用NPC1试剂盒(Mybiosource公司，货号：MBS9320668)。当然，也可以为其它类型的抗体或是其他可用于检测NPC1蛋白浓度的物质。

本发明还保护另一种产品。所述产品也具有下述至少一种用途：1)筛查或辅助诊断癌症；2)预测癌症预后；3)癌症治疗的伴随诊断。

本发明所提供的产品，其包括上述检测NPC1蛋白含量或活性的系统和检测SOAT1(胆固醇酯化酶)蛋白含量或活性的系统；

或，上述检测NPC1基因含量或表达量的系统和检测SOAT1(胆固醇酯化酶)基因含量或表达量的系统。

所述产品可为系统；所述系统可包括试剂和/或仪器。所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。所述试剂盒可为荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒或其它。

以NPC1作为标志物的系统在制备筛查或辅助诊断癌症产品中的应用或在制备预测癌症预后产品中的应用或在制备癌症治疗伴随诊断产品中的应用也均属于本发明的保护范围。

以NPC1作为标志物的系统和以SOAT1作为标志物的系统在制备筛查或辅助诊断癌症产品中的应用或在制备预测癌症预后产品中的应用或制备癌症治疗伴随诊断产品中的应用也同样属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述产品可为系统；所述系统可包括试剂和/或仪器。所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。所述试剂盒可为荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒或其它。

以NPC1作为标志物的系统在筛查或辅助诊断癌症中的应用或在预测癌症预后中的应用或在癌症治疗伴随诊断中的应用也属于本发明的保护范围。

以NPC1作为标志物的系统和以SOAT1作为标志物的系统在筛查或辅助诊断癌症中的应用或在预测癌症预后中的应用或在癌症治疗伴随诊断中的应用也同样属于本发明的保护范围。

当然NPC1除了可与SOAT1联合作为标志物筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或进行癌症治疗的伴随诊断外，也可与AFP(甲胎蛋白)或其它蛋白联合使用作为标志物筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或进行癌症治疗的伴随诊断。

在本发明中，所述产品的筛查或诊断对象是健康人或肝硬化(LC)或肝炎患者(如乙肝患者)或癌症患者。

本发明还保护一种筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或作为癌症治疗伴随诊断的方法。

所述方法包括：检测待测者样本中NPC1的含量或表达量，根据所述含量或表达量进行诊断或辅助诊断癌症或预测癌症预后或进行癌症治疗伴随诊断。其中，样本包括(但不限于)血液、血清、血浆及组织活检物。

本发明还保护另一种筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或作为癌症治疗伴随诊断的方法。

所述方法包括：检测待测者样本中NPC1和SOAT1的含量或表达量，根据所述含量或表达量进行筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或作为癌症治疗伴随诊断。

其中，样本包括(但不限于)血液、血清、血浆及组织活检物(如肝组织活检物)。

所述NPC1蛋白为人NPC1蛋白。

在上述应用、产品或方法中，所述的癌症包括实体癌症和非实体癌症，包括但不限于肝细胞癌、胆管癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、白血病、皮肤恶性黑色素瘤。

实验证明，NPC1蛋白可作为肝细胞癌(HCC)的肿瘤标志物。基于68对肝癌的转录组数据及包括85个肝癌患者癌及癌旁的组织芯片数据，NPC1转录本及蛋白丰度在肝癌中的表达显著高于癌旁。在肝癌患者血清中，NPC1的丰度(均值7.12ng/ml)显著高于健康对照组(均值2.35ng/ml)、肝炎组(均值3.65ng/ml)和肝硬化组(均值4.31ng/ml)(P<0.01)。当以健康人作为筛查对象时，判定为肝癌患者的阈值为血清NPC1蛋白浓度>3.28ng/ml，此时，其灵敏度为72％、特异度为93.75％。NPC1单独作为HCC筛查标志物的曲线下面积(AUC)是0.87。当以健康人，肝炎和肝硬化人群作为筛查对象时，判定为HCC患者的阈值为血清NPC1蛋白浓度>5.44ng/ml，此时，其灵敏度为46％、特异度为92.86％。曲线下面积(AUC)是0.75。提示NPC1可用从于健康人，肝炎和肝硬化人群中筛选肝细胞癌的标志物。

在本实施例中，所述用于检测NPC1蛋白浓度的物质为NPC1蛋白抗体，具体为免疫组化所用NPC1抗体(Abcam公司，货号：ab55706)或ELISA所用NPC1试剂盒(Mybiosource公司，货号:MBS9320668)。当然，也可以为其它类型的抗体或是其他可用于检测NPC1蛋白浓度的物质。

实验也证明，NPC1蛋白可作为肝细胞癌(HCC)预后评估的标志物。NPC1与肝癌的不良预后密切正相关，丰度越高，患者预后越差(P＝0.01)。NPC1与胆固醇代谢的另一个关键酶SOAT1(胆固醇酯化酶)合用，与肝癌不良预后的关系更显著(P＝0.001)。提示NPC1可以和SOAT1或其他蛋白合用预测肝癌预后。

本实施例中，所用肝癌组织芯片(HLiv-HCC180Sur-05)：生存期肝细胞癌95例：癌95例/癌旁85例。手术时间2006.8－2009.11，随访时间2013.9。随访4－7年。购自上海芯超生物科技有限公司

实验还证明，NPC1的敲低和抑制剂(U18666A)均可显著抑制肝癌细胞的增殖。这提示靶向NPC1可以为NPC1为标志物筛选的恶性度较高的肝癌亚型提供潜在的精准治疗方式。说明NPC1作为标志物不仅可以辅助诊断肝癌，也可以提示肝癌预后，指导肝癌治疗。

本发明所提供的应用，利用在肝细胞癌患者组织和血清中均上调表达的蛋白质NPC1作为诊断标志物试剂盒的制备或者直接作为诊断肝细胞癌的试剂盒，也可以独立或联合其他蛋白(如SOAT1)作为肝癌预后试剂盒的制备或者直接作为诊断肝细胞癌的试剂盒。适用于在生物学、医学和药学领域中对肝细胞癌进行临床检测研究和发病机制研究，具有广泛的实用性。用途包括但不限于：在生物学、医学和药学等领域进行各种肝细胞癌相关检测和研究。

附图说明

图1:NPC1的表达与肝癌的发生及预后密切相关。图1A,基于68对肝癌及配对癌旁的转录组数据及组织芯片数据(图1B)，发现NPC1的转录本及蛋白在肝癌的表达均显著高于其配对癌旁的表达水平(图1B，C)。图1D，对组织芯片中高表达NPC1及低表达NPC1患者进行生存分析。结果表明NPC1蛋白高表达患者总生存期明显低于NPC1低表达患者(P＝0.01)。图1E,对组织芯片中同时高表达NPC1及SOAT1(胆固醇酯化酶)及其他患者进行生存分析。结果表明其与肝癌不良预后的关系更显著(P＝0.001)。提示NPC1可以独立或和SOAT1或和其他蛋白合用预测肝癌预后。非配对Mann-Whitney检验(图1A，C),log-rank检验(图1D，E)。*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

图2：基于ELISA试剂盒测定NPC1在健康人、肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中的表达。结果表明NPC1在肝癌患者血清中显著升高(图2A)。提示NPC1可作为从健康人、肝炎和肝硬化人群筛选肝癌的诊断标志物。HCC与健康组人群(图2B))血清NPC1蛋白水平的ROC曲线分析结果表明NPC1可作为从健康人群(AUC＝0.87)筛查肝癌的潜在标志物。HCC与非HCC混合人群(健康组人，肝炎和肝硬化)(图2C))血清NPC1蛋白水平的ROC曲线分析结果表明NPC1可作为从健康及良性肝病人群(AUC＝0.75)筛查肝癌的潜在标志物。

图3：NPC1抑制剂显著抑制U18666A对HepG2、PLC/PRF/5、Huh7及MHCC97H肝癌细胞系增殖。该结果提示NPC1可能作为肝癌治疗的一个靶点，用NPC1筛选出来的恶性度较高的肝癌患者可以靶向NPC1进行精准治疗。非配对Mann-Whitney检验,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。

图4：NPC1抑制剂U18666A显著抑制常见癌症细胞系(宫颈癌Hela细胞系,结肠癌HCT116细胞系，非小细胞肺癌A549细胞系，乳腺癌MCF7细胞系，食管癌ECA109细胞系及白血病Jurkat细胞系)的增殖(图4)。该结果提示用NPC1筛选出来的恶性度较高的癌症患者可以靶向NPC1进行精准治疗。非配对Mann-Whitney检验,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现抑制NPC1蛋白的活性可以在细胞水平和动物水平有效地抑制肝癌的生长。在此基础上完成了本发明。

本发明中的术语：

NPC1

如本文所用，术语“NPC1”或“C型1类尼曼-匹克蛋白”可以互换使用。NPC1在肝癌患者的组织及血清样本中均显著升高，并且，丰度越高患者预后越差，可以作为肝癌，特别是早期肝癌的诊断标志物，并提示患者预后。检测NPC1的方法包括但不局限于荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或抗体。

NPC1抑制剂

如本文所用，术语“NPC1抑制剂”或“C型1类尼曼-匹克蛋白抑制剂”可以互换使用，都是指对NPC1蛋白活性具有抑制效果的化合物，U18666A、或具有相同效应的U18666A衍生物与类似物、或同样具有抑制C型1类尼曼-匹克蛋白效应的化合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

试剂：

NPC1抗体(ab55706)购自Abcam公司；

NPC1抑制剂U18666A，购自Santa公司；

肝癌组织芯片(HLiv-HCC180Sur-05)：生存期肝细胞癌95例：癌95例/癌旁85例。手术时间2006.8－2009.11，随访时间2013.9。随访4－7年。购自上海芯超生物科技有限公司

NPC1 ELISA试剂(MBS9320668)购自Mybiosource公司

细胞培养基(DMEM)和胎牛血清购自Invitrogen公司；

细胞株和组织样本：

HepG2,PLC/PRF/5、Huh7购自协和细胞库(中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心)；

MHCC97H购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所；

用于血清ELISA测定的120例血清样本均来自于复旦大学附属中山医院。其中肝癌血清样本50例，体检正常人血清样本32例,肝炎血清19例，肝硬化患者19例。所有研究对象在抽血前均禁食8h以上，采集空腹静脉血约5ml，室温静置30分钟后以3000r/min离心10分钟，收集血清，-20℃冻存用于NPC1浓度监测。

方法：

一、68对肝癌及癌旁的转录组数据

肝组织样本采用TRIzol试剂盒提取总RNA。用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2500进行测序。整个实验过程由由诺禾致源公司负责并产出数据。二、通过免疫组化检测NPC1在95例HCC及85例癌旁样本的表达差异：

1)烘片：将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时。

2)脱蜡：片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；脱蜡过程如下：

二甲苯两缸，每缸15分钟(按仪器设置时间)；

无水乙醇两缸，每缸7分钟(按仪器设置时间)；

90％酒精1缸，5分钟(按仪器设置时间)；

80％酒精1缸，5分钟(按仪器设置时间)；

3)70％酒精1缸，5分钟(按仪器设置时间)；

4)抗原修复：从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，每次不少于1分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液或者EDTA修复液放至电磁炉上开始加热。

5)阻断：使用商品化的即用阻断剂，将阻断剂滴在片子上，计时10-15分钟。

6)按1:20000加入一抗：取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；冰箱中取出一抗，放入离心机里7200转离心不少于30秒；取出一抗，按1：2000抗体稀释液稀释滴加一抗，室温孵育，计时30分钟。

7)加兔二抗：将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；滴加二抗即用工作液，室温孵育，计时30分钟；时间到后用PBS冲洗3次，每次不少于1分钟。

8)DAB显色：从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mlDAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；在片子上滴加稀释后的DAB，观察显色强度，最长显色5分钟，到时后自来水冲洗5分钟。

9)苏木素复染、封片：在片子上滴加哈氏苏木素(SIGMA)1分钟，时间到后在0.25％的盐酸酒精中浸没不少于2秒，用自来水冲洗大于2分钟，室温晾干后封片。

三、采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中NPC1浓度

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清样品中NPC1的浓度，每组血清样本设置3个重复，使用多功能酶标仪中检测OD值，以3个重复的均值作为此组样本的最终OD值。分别比较肝癌组与正常组及肝硬化组的NPC1表达水平。

四、CCK8实验

1)第一天，60mm培养皿中细胞常规胰酶消化计数后，5000个细胞/孔，接种4个96孔板。

2)第二天，大约培养24hour后,细胞生长处于对数期,更换新的加入不同浓度SOAT1抑制剂的培养液,100μl/孔，分别设10μM 20μM浓度组及对照组,对照组为1‰的DMSO，每组设3个重复孔。取一个96孔板加入10％的CCK8，100μl/孔，1小时后450nm波长测0小时的OD值，无细胞孔为空白背景。

3)第三天，取一个96孔板加入10％CCK8，1小时后450nm波长测24小时的OD值。

4)第四天，取一个96孔板加入10％CCK8，1小时后450nm波长测48小时的OD值。

5)第五天，最后一个96孔板加入10％CCK8，1小时后450nm波长测72小时的OD值。

6)汇总所有时间点OD值，绘制生长曲线。

五、统计分析：

所有分析均使用GraphPad Prism软件完成。P<0.05认为有显著性差异。

实施例1、NPC1在肝癌的高表达与肝癌的发生及预后密切相关

为了证实NPC1在肝癌高表达的现象，发明人利用68对肝癌及癌旁的转录组数据分析NPC1在癌及癌旁的表达，发现NPC1的转录本在癌样本中显著高表达(图1A)。发明人利用肝癌组织芯片(95肝癌/85配套癌旁)检测NPC1蛋白在HCC明显高表达(图1B，C)，NPC1高表达患者总生存期明显低于NPC1低表达患者(P＝0.01)(图1D)。对组织芯片中同时高表达NPC1及SOAT1(胆固醇酯化酶)及其他患者进行生存分析(图1E)。结果表明其与肝癌不良预后的关系更显著(P＝0.001)。提示NPC1可以独立或和SOAT1或和其他蛋白合用预测肝癌预后。非配对Mann-Whitney检验(图1A，C),log-rank检验(图1D，E)。*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

实施例2、NPC1在肝癌血清样本中显著升高

为了证实NPC1在肝癌高表达的现象，发明人利用人血清样本基于ELISA试剂盒检测NPC1在不同人群的表达(图2)。NPC1蛋白表达水平在肝癌组、正常组、肝炎组和肝硬化患者组患者组的血清样本中的ELISA检测结果：在肝癌患者血清中，NPC1的丰度(均值7.12ng/ml)显著高于健康对照组(均值2.35ng/ml)和肝炎组(均值3.65ng/ml)和肝硬化组(均值4.31ng/ml)(P<0.01)。对各组样本中NPC1蛋白含量进行统计学分析(非配对Mann-Whitney检验)，发现血清NPC1蛋白在肝癌组与正常组/肝炎组/肝硬化组均有显著性差异(P<0.01)(图2A)。提示NPC1可作为从健康人、肝硬化人群、肝炎人群筛选肝癌的诊断标志物。

当以健康人作为筛查对象时，判定为HCC患者的阈值为血清NPC1蛋白浓度>3.28ng/ml，此时，其灵敏度为72％、特异度为93.75％。NPC1单独作为HCC筛查标志物的曲线下面积(AUC)是0.87(图2B)。当以健康人，肝炎和肝硬化人群作为筛查对象时，判定为HCC患者的阈值为血清NPC1蛋白浓度>5.44ng/ml，此时，其灵敏度为46％、特异度为92.86％。曲线下面积(AUC)是0.75(图2B)。优于文献报道的AFP单用的AUC值(0.65-0.73)(Luo,P.et al.ALarge-scale,multicenter serum metabolite biomarker identification study forthe early detection of hepatocellular carcinoma.Hepatology.29561(2017).)提示NPC1可用从于健康人，肝炎和肝硬化人群中筛选肝细胞癌的标志物。

上述两个判别诊断的浓度阈值为ROC曲线的最大约登指数对应的阈值。以健康人和HCC患者、非HCC的人群(健康人和乙肝和肝硬化患者)和HCC患者的判别诊断对应的阈值、灵敏度、1-特异度和约登指数详见表1及表2(最大约登指数及对应阈值粗体标注)。

表1以健康人为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数

表2以非HCC的人群(健康人和乙肝和肝硬化患者)为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数

实施例3、NPC1抑制剂能抑制肝癌细胞的生长

在本实施例中，发明人研究了NPC1抑制剂在抑制肝癌细胞生长中的作用。结果表明NPC1抑制剂U18666A能显著抑制肝癌细胞(HepG,PLC/PRF/5，Huh7,MHCC97H)的增殖(图3)。说明NPC1可明显抑制肝癌细胞系的增殖，提示NPC1可作为肝癌治疗的一个靶点。

实施例4、NPC1抑制剂能抑制癌症细胞的生长

在本实施例中，发明人研究了NPC1抑制剂在常见癌症细胞生长中的作用。

结果表明NPC1抑制剂U18666A显著抑制常见癌症细胞系(宫颈癌Hela细胞系,结肠癌HCT116细胞系，非小细胞肺癌A549细胞系，乳腺癌MCF7细胞系，食管癌ECA109细胞系及白血病Jurkat细胞系)的增殖(图4)。说明NPC1可明显抑制癌症细胞系的增殖，提示NPC1可能作为癌症治疗的一个靶点。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110>北京蛋白质组研究中心

<120>C型1类尼曼-匹克蛋白检测物在制备筛查肝细胞癌产品中的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 59

<212>RNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223>shRNA

<400>1

ccggccacaa gttctatacc atattctcga gaatatggta tagaacttgt ggttttttg 59

Claims

1.检测C型1类尼曼-匹克蛋白的蛋白含量或活性的系统或检测C型1类尼曼-匹克蛋白基因含量或表达量的系统在下述至少一方面的应用：1）制备筛查或辅助诊断癌症的产品；2）制备预测癌症预后的产品；3）制备癌症治疗的伴随诊断产品；所述癌症为肝癌。

2.检测C型1类尼曼-匹克蛋白的蛋白含量或活性的系统和检测胆固醇酯化酶含量或活性的系统或检测C型1类尼曼-匹克蛋白基因含量或表达量的系统和检测胆固醇酯化酶基因含量或表达量的系统在下述至少一方面的应用：1）制备筛查或辅助诊断癌症的产品；2）制备预测癌症预后的产品；3）制备癌症治疗的伴随诊断产品；所述癌症为肝癌。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测C型1类尼曼-匹克蛋白的蛋白含量或活性的系统包括检测C型1类尼曼-匹克蛋白的蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器；

所述检测C型1类尼曼-匹克蛋白基因含量或表达量的系统包括检测C型1类尼曼-匹克蛋白基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测C型1类尼曼-匹克蛋白基因含量或表达量所需的试剂包括：特异性扩增C型1类尼曼-匹克蛋白的引物，或特异性检测C型1类尼曼-匹克蛋白的抗体。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测所采用的样本为健康人或肝硬化患者或肝炎患者或癌症患者的血或组织；

所述产品包括系统，所述系统包括试剂和/或仪器；所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条；所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒或ELISA试剂盒。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述检测胆固醇酯化酶蛋白含量或活性的系统包括检测胆固醇酯化酶蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器；所述检测胆固醇酯化酶基因含量或表达量的系统包括检测胆固醇酯化酶基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述检测胆固醇酯化酶基因含量或表达量所需的试剂包括：特异性扩增胆固醇酯化酶的引物，或特异性检测胆固醇酯化酶的抗体。