CN102869382A - 通过抑制肠内胆固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的组合物 - Google Patents

通过抑制肠内胆固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开通过遏制肠内胆固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的组合物。本发明组合物中所含的作为活性成分的源自卵黄的IgY型抗NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)抗体与作为肠内胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)粘附，从而干扰胆固醇和该运载蛋白之间的结合，进而基本阻断体内的胆固醇吸收，从而避免高脂血症和肥胖症。

Description

通过抑制肠内胆固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的组合物
技术领域
本发明涉及用于抑制高脂血症和肥胖症的组合物。更具体而言，本发明涉及通过遏制肠内胆固醇吸收而抑制高脂血症和肥胖症的组合物。
背景技术
胆固醇已知是诱发冠心病的因素，已知冠心病占目前所有死因的30%以上。
心血管疾病据认为是脂肪摄入高且肥胖人群大的发展中国家的疾病，在韩国其发病率由于伴随经济水平发展的饮食西方化、缺乏锻炼、工作过劳等快速增加。特别是，涉及血中胆固醇运载的低密度脂蛋白(LDL)被认为是特定的动脉硬化的诱发因素，并且氧化的LDL已知显示出有力的动脉硬化诱发活性。
同时，肥胖症通常认为是消化不良和消耗后剩余的残余卡路里转化为脂肪细胞并存储在身体各部位，特别是皮下组织和腹腔的现象。肥胖症的原因包括遗传因素、环境因素和能量代谢失调等。肥胖症的类型根据发病原因可以划分为单纯性(原发性)肥胖症和症状性(继发性)肥胖症。
大多数肥胖症患者为单纯性(原发性)肥胖症，并且已知由于其体内卡路里摄入过多和缺乏卡路里消耗而导致的过剩能量累积为脂肪所致。
症状性(继发性)肥胖症已知由甲状腺机能减退、肾上腺皮质激素过度分泌和多囊卵巢综合征等疾病，或口服避孕药、镇静剂、类固醇激素和含有抗组胺成分的药物等药物引起。
肥胖症由于脂肪组织的腹部压力而引起便秘、消化不良、胃肠障碍，引发如糖尿病、高血压、动脉硬化、心脏病和癌症等成人疾病及其并发症，以及精神疾病，如与身体有关的不满、焦虑、人格障碍和抑郁。即，肥胖症是各种疾病的诱因。
因此，需要减少身体内吸收的胆固醇的量，从而预防心血管疾病和作为各种疾病诱因的肥胖症。为此，阻断胆固醇的吸收是最有效的方法。
同时，本领域中已知依折麦布(Ezetimibe)是抑制胆固醇吸收的化合物，也被称为“Zetia”。考虑到需求逐渐增加的与肥胖症相关的市场，需要开发新型替代物。
发明内容
技术问题
因此，鉴于上述问题而完成了本发明，本发明的一个目的是开发和提供能够提供降低肠内吸收的胆固醇的量而抑制或预防高脂血症和肥胖症的组合物。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了抑制胆固醇吸收的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IgY型抗体，所述抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1-样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
根据本发明的另一方面，提供了预防或抑制肥胖症的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IgY型抗体，所述抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
根据本发明的又一个方面，提供了预防或抑制高脂血症的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IgY型抗体，所述抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
下面，将更加详细地描述本发明。
本发明的第一第二和第三方面提供了抑制胆固醇吸收的组合物、预防或抑制肥胖症的组合物和预防或抑制高脂血症的组合物。所有这三个方面均包含作为活性成分的IgY型抗体，所述抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
由本发明的下述实验可知，所述IgY型抗体有效抑制了小肠中的胆固醇吸收(抑制机制见图1)，所述抗体的抗原包含NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
根据上述抑制胆固醇吸收的效果，可以制备所述IgY型抗体并将其用作抑制胆固醇吸收的组合物和预防或抑制由胆固醇的过度吸收引起的肥胖症和高脂血症的组合物，所述抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
并且，本发明所用的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)蛋白是存在于肠内的胆固醇运载蛋白。例如，人类具有序列编号1所示的核酸序列和序列编号2所示的氨基酸序列。NPC1L1已知在小肠内胆固醇吸收中具有重要作用。通过内吞再循环的由NPC1L1蛋白进行的胆固醇吸收有助于单向(体内)吸收，并且不受HDL、细胞内胆固醇吸收和血中浓度影响。而且，NPC1L1已知可选择性识别非酯化的游离胆固醇，并促进向肝癌细胞中的单向运载(J.Mark Brown等，Biochem.J.(2007)406,273-283)。
本发明中，制备了阻断上述NPC1L1作用的抗体，特别是产生并使用了IgY型抗体，所述IgY型抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。由于NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分的序列已知，通过生物合成或遗传重组将该环部分制成肽，并可用作表位。
并且，IgY是卵黄中所含的抗体，并且已知被开发为IgY型的抗体被人体摄入时几乎不具有副作用。可以通过将抗原注射到鸡体内而制备IgY。该方法是本领域中已知的，因此省略了对其的具体说明。
并且，本文所用的术语“活性成分”表示组合物中的胆固醇吸收的抑制效果和对高脂血症或肥胖症的抑制效果源自本发明提供的"IgY型抗体"，并且表示可以添加除这些成分之外的其他各种辅助成分，从而有助于保存性和吸收。
并且，NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环共有7个，其具有由序列编号4、6、8、10、12、14和16表示的氨基酸序列，并被用作制备抗体的表位。因此，本发明中可用作表位的NPC1L1中的向腔突出的环部分中存在的氨基酸序列是由序列编号4、6、8、10、12、14和16表示的氨基酸序列之一。
并且，在本发明中，可以通过将能够引发抗原性的载体蛋白与NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列结合，从而形成用于制备IgY型抗体的抗原。随着分子量增加，抗原性可提高。这时，可以使用选自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)中的一个作为引发抗原性的载体蛋白。
有益效果
本发明组合物中作为活性成分所包含的针对NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)的来自卵黄的IgY型抗体与作为小肠中胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)结合，从而干扰胆固醇和该运载蛋白之间的结合，由此完全阻断体内胆固醇的吸收，进而预防高脂血症和肥胖症。
附图说明
通过下述结合附图进行的详细描述，可以更清楚地理解本发明的上述和其他目标、特征和其他优点，其中：
图1是显示抗NPC1L1IgY抑制胆固醇吸收的机制的示意图；
图2图示了产生IgY的重组抗原的制备和所制备的抗原的免疫原性的测试结果；
图3图示了所产生的重组抗体IgY的电泳结果；
图4图示了重组抗体IgY与抗原的结合能力的蛋白印迹结果；
图5图示了定量显示疫苗是否形成抗体IgY的ELISA结果；
图6图示了利用HepG2细胞系确认IgY与NPC1L1蛋白结合的体外免疫荧光术结果。该结果通过利用共聚焦显微镜以400×放大倍数观察获得；
图7图示了确认小鼠小肠组织中IgY与NPC1L1蛋白结合的体内免疫组织化学结果。该结果通过利用共聚焦显微镜以200×放大倍数观察获得；
图8图示了确认小鼠小肠组织中IgY与NPC1L1蛋白结合的体内免疫荧光术结果。该结果通过利用共聚焦显微镜以200×放大倍数观察获得；
图9图示了利用HepG2细胞系的胆固醇摄入抑制测试结果。图9中，'COM'和'ISA'表示佐剂的种类，并且ISA表示利用“ISA 70佐剂”制备的抗NPC1L1 IgY样品，'COM'表示利用“完全弗氏佐剂(Difco,美国)”制备的抗NPC1L1 IgY样品；和
图10图示了摄入高胆固醇饲料8周中的体重变化(*;p<0.05,**;p<0.01)。
具体实施方式
下文中，为了进一步了解本发明，而提供了下述实施例。本发明的范围不限于下述实施例，并且还包括其技术实质等同方式。
制备例1:重组抗原的制备和适合性的确认
下面，克隆由NPC1L1的整个氨基酸序列中的氨基酸序号373至634表示的共262个氨基酸，以使重组抗原具有序列编号4表示的环1(NPC1L1在腔方向上具有的总计7个环中的第2个环)的氨基酸，从而制备重组抗原(下文称为'蛋白373')。
另外，克隆由NPC1L1的整个氨基酸序列中的氨基酸序号416至635表示的共220个氨基酸，从而制备重组抗原(下文称为'蛋白416')。
另外，克隆由NPC1L1的整个氨基酸序列中的氨基酸序号509至633表示的共125个氨基酸，从而制备重组抗原(下文称为'蛋白509')。
将用于制备抗原以产生IgY的各克隆DNA序列连接到具有纯化用His标签的pET-15b载体的Xho I/BamH I克隆位点，然后利用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中表达。
过表达后，将DNA序列在His6亲和柱上纯化，并溶解，用所得重组蛋白进行SDS-PAGE和蛋白质印记。
此处用于蛋白质印记的抗体是商售抗NPC1L1小鼠单克隆抗体和HRP缀合的山羊抗小鼠抗体。
测试结果如图2所示。结果，过表达和纯化的重组NPC1L1抗原(蛋白373、416和509)与来自小鼠的抗NPC1L1抗体反应，由此可知，制备出了作为具有主要表位的重组蛋白的NPC1L1抗原，其具有产生可抑制NPC1L1蛋白功能的抗体性质。
实施例:通过重组抗原的免疫接种来制备IgY抗体
(1)疫苗的制备
将上述制备例1中制备的重组肽型抗体型NPC1L1抗原与弗氏完全佐剂(Difco263810,美国)等体积混合，从而制备疫苗。为了根据佐剂的存在确认抗体形成的差异，利用注射器将ISA70(普通佐剂)和抗原等量混合，从而制备用于产生特定的卵黄抗体的疫苗。
重组肽和载体之间的偶联利用马来酰亚胺激活的BSA和KLH偶联试剂盒(Maleimide Activated BSA,KLH conjugation Kit,Sigma-Aldrich,MBK1,美国)进行，并且该方法根据使用手册进行。下面简述该方法。将载体蛋白在pH 6.6溶于20mM磷酸钠、230mM NaCl、2mM EDTA和80mM蔗糖中，将重组肽于pH 6.6溶于20mM磷酸钠、100mM EDTA和80mM EDTA中，将载体蛋白和重组肽在冷却下混合搅拌12小时以上，并最终在Sepadex G-25M凝胶过滤柱上分离。
(2)产卵鸡的免疫
将所制备疫苗肌肉内注射到22周龄的Hy系棕色产卵鸡中，以3周的间隔一次接种，并加强2次。
(3)免疫-卵黄抗体的分离和确认
i)免疫-卵黄抗体的分离
利用硫酸铵(sigma美国)从经免疫的产卵鸡所产的鸡蛋中分离IgY。所述硫酸铵法如下进行：根据Akita等的方法(Akita,E.M.and Nakai,S.Immunoglobulins fromegg yolk:isolation and purification.J.Food.Sci.,57:629-633,1992)，从卵黄中去除卵膜，以1:4的比例用pH 2.5D.W稀释，并将稀释物在-20℃冷冻2天，将稀释物于7000rpm离心30分钟，并过滤上清液从而分离水溶性蛋白。利用过饱和硫酸铵溶液在4℃过夜，使纯蛋白从所分离的蛋白中沉淀出。将经沉淀的溶液离心从而获得沉淀物，并以PBS重悬，并在4℃以PBS缓冲液透析，从而获得分离的抗体样品。
ii)电泳
根据Laemmli的方法(Laemmli.U.K.Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature,227(5259):680-685,1970)，利用的5%堆积胶和10%分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。电泳后，用考马斯亮蓝R-250溶液将凝胶染色30分钟，并利用脱色缓冲液确认所分离的IgY抗体。图3显示了所制备的重组抗体IgY的电泳结果。
(4)所分离的IgY与抗原结合的确认
通过蛋白质印迹来确认所分离的IgY抗体和肽抗原之间的结合。结果如图4所示，经确认，通过免疫制备的IgY识别了含有NPC1L1的C环部分并且经缀合的重组蛋白。
测试例1:利用ELISA测试方法确认抗体的形成
在该测试例中，根据ELISA测试法确认了利用完全佐剂和ISA 70佐剂制备的疫苗(蛋白416)是否形成抗体。
a)将NPC1L1-BSA-缀合的抗原利用碳酸盐缓冲液以400ng/ml的浓度涂覆在96孔ELISA板上，并在37℃温育1小时以实现完全涂覆。
b)抗原用PBST洗涤3次，并用1%-BSA在37℃封闭1小时。
c)抗原用PBST洗涤3次，以100ul样品处理，并在37℃封闭1小时。
d)抗原用PBST洗涤3次，以作为二抗的100μl抗鸡-IgY-HRP处理，并在37℃封闭1小时。
e)抗原用PBST洗涤3次，向其中加入100μl所制备的底物溶液，并进行颜色反应10分钟，并且以2N硫酸终止反应。
f)利用ELISA读取器确认结果。
根据该测试结果(图5)和以1:10,000的比例稀释的抗体样品的结果，将空白值与ISA70-IgY和COM-IgY比较时，观察到约10倍至15倍的O.D差异。普通IgY和空白样之间没有O.D差异。这表明形成了抗NPC1L1的IgY抗体。
另外，对于由佐剂之间的差异导致的抗体形成，与ISA 70佐剂相比，含有微生物的OMP的弗氏完全佐剂(Difco 263810,美国)展示出更优的滴度。
由实施例1的蛋白质印记和测试例1中ELISA的测试结果可知，很好地形成了抗NPC1L1的IgY抗体，并且抗体与抗原结合。
测试例2：体外NPC1L1免疫荧光术
为了确认分离自卵黄的抗NPC1L1的IgY抗体(蛋白416的抗体)是否与作为抗原的NPC1L1蛋白结合，将已知可过表达NPC1L1的肝癌细胞系(HepG2细胞系)用于体外免疫荧光术(Davies JP，Scott C,Oishi K,Liapis A,Ioannou YA.Inactivation ofNPC1L1 causes multiple lipid transport defects and protects against diet-inducedhypercholesterolemia.J Biol Chem.2005年4月1日;280(13):12710-20.2005年1月25日电子出版)。
将细胞以1×104/ml的浓度接种在载玻片室中，温育18小时，然后测试。去除细胞培养基，以3.7%的甲醛固定细胞，以PBST洗涤，用渗透缓冲液(0.2%TritonX-100)处理20分钟，将均为2.5ug/ml的抗NPC1L1的IgY(一抗)和兔抗NPC1L1(Santa Cruz,美国)(商售抗体)以1/50的比例稀释，并以各稀释抗体处理细胞。用PBS洗涤细胞，将抗鸡的IgY-Alexa488(Biotium,美国)(二抗)和抗兔的IgG-Alexa488(Invitrogen,美国)均以1/100的比例稀释，于室温(RT)用各个经稀释的抗体处理细胞1小时，并以PBS洗涤，用Hoechst33258对核反染色30分钟并封固，利用多光子共聚焦激光扫描显微镜(LSM 510 METANLO,Carl Zeiss,德国)观察结果。
由免疫荧光术(IF)的结果(图6)可知，除了未以一抗处理的阴性对照之外，抗NPC1L1的IgY抗体与作为抗原并在细胞质中表达的NPC1L1结合，由卵黄制备的抗体与靶蛋白结合良好。
测试例3:体内免疫组织化学和免疫荧光术
由所述结果可知，抗NPC1L1的IgY (蛋白416的抗体)在体外结合NPC1L1蛋白，为了确认抗NPC1L1的IgY是否与小肠内实际存在的NPC1L1蛋白结合，利用小鼠小肠组织进行了免疫组织化学(IHC)分析和免疫荧光术(IF)。
(1)体内免疫组织化学
为了确定分离自卵黄的抗NPC1L1的IgY是否与NPC1L1蛋白结合，对小鼠小肠组织进行了免疫组织化学分析。
Altmann等(Altmann SW，Davis HR Jr，Zhu LJ,Yao X,Hoos LM,Tetzloff G，IyerSP，Maguire M,Golovko A,Zeng M,Wang L,Murgolo N,Graziano MP.Niemann-PickC1 Like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption.Science.2004年2月20日;303(5661):1201-4)报道大量小肠NPC1L1分布在小肠近端部分。
因此，收集小鼠小肠，分离除十二指肠以外的近端部分的空肠，并以PBS洗涤除去肠道内存在的食物，以4%的多聚甲醛固定，利用自动组织处理机(Leica,德国)以石蜡固定，包埋(Leica,德国)以制备石蜡块，并以组织切片机(Leica,德国)切割为5μm的尺寸，从而产生用于免疫染色的载玻片样品。
将载玻片以二甲苯脱石蜡，在乙醇系列溶液(100%、95%、90%、80%、70%、50%)中水合，以PBS洗涤，以0.3%的H2O2处理，从而去除内源性过氧化物酶，以5%的标准血清(Vector,美国)封闭，以预定浓度的分离自卵黄的抗NPC1L1的IgY(2.5μg/ml)和商售抗体(兔抗NPC1L1,1/50,Santa Cruz,美国)作为一抗进行处理，在4℃温育过夜。以PBS洗涤样品，以稀释的(1/100)二抗(抗鸡生物素、抗兔生物素，Vetor,美国)于室温(RT)处理2小时，以PBS洗涤，并利用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vetor,美国)使ABC温育2小时。ABC与DAB溶液(Vetor,美国)反应2分钟至5分钟，以PBS洗涤，以苏木精(Vector,美国)反染色，以D.W洗涤，以乙醇系列溶液脱水，以二甲苯处理并封固，利用光学显微镜(Carl Zeiss,德国)观察结果。
(2)体内免疫荧光术
为了确认分离自卵黄的抗NPC1L1的IgY是否结合NPC1L1蛋白，对小鼠小肠组织进行了免疫荧光术。利用二甲苯对组织石蜡二甲苯进行脱石蜡，在乙醇系列溶液(100%、95%、90%、80%、70%、50%)中水合，以PBS洗涤，以0.3%的H2O2处理，从而去除内源性过氧化物酶，以5%的标准血清(Vector，美国)封闭，以预定浓度的分离自卵黄的抗NPC1L1的IgY(2.5μg/ml)和商售抗体(兔抗NPC1L1,1/50,Santa Cruz,美国)作为一抗进行处理，在4℃温育过夜。以PBS洗涤样品，以均为1/100稀释的作为二抗的抗鸡IgY-Alexa488(Biotium,美国)和抗兔IgG-Alexa488(Invitrogen,美国)于室温处理2小时，以PBS洗涤，以Hoechst33258对核反染色，并安装，利用光学显微镜(Carl Zeiss,德国)观察结果。
(3)测试结果
由图7和图8所示的结果可知，抗NPC1L1的IgY抗体强烈表现在整个回肠绒毛远端部分，并表现在除绒毛远端部分的近端部分，并且通过IF确认了在绒毛远端部分的上皮细胞中以线的形式强烈发射荧光。
由这些结果可知，本发明制备的IgY即使在小肠中也确实进行了结合。
测试例4:抗NPC1L1的IgY抗体的胆固醇摄入测试
为了确定抗NPC1L1的IgY(蛋白416的抗体)的效力和效果，利用Hep G2细胞进行了胆固醇摄入测试。
利用含10%FBS(Difco,美国)的DMEM(Difco,美国)培养基将Hep G2细胞以2×105/ml的密度在24孔板中温育18小时，以不同浓度(5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml)的抗NPC1L1的IgY进行处理，且作为阳性对照以10μg/ml的已知作为胆固醇摄入抑制剂的依折麦布(Ezetimibe)进行处理。将各样品在37℃预温育1小时，然后移走，并向其中加入新鲜培养基，随后洗涤。以50μM的放射性同位素标记的[3H]-胆固醇处理样品3小时。将细胞以不含脂肪酸的含0.1%BAS的PBS溶液洗涤，以HBSS(Difco,美国)收集，以含1%Triton X-100(Sigma,美国)的HBSS溶解细胞，利用Beckmen LS6500闪烁计数器测定放射剂量，利用作为对照组的IgY施用组进行比较和测试。
由图9的结果可知，与未经处理的对照组相比，作为阳性对照的依折麦布在浓度为10μg/ml时显示出显著降低(p<0.05)，IgY在浓度为25μg/ml时显示出胆固醇摄入的显著降低(p<0.05)。图9中，'COM'和'ISA'表示佐剂的类型，“ISA”表示利用“ISA70佐剂”的抗NPC1L1的IgY处理组，而'COM'表示利用“完全弗氏佐剂(Difco,美国)”的抗NPC1L1的IgY处理组。
这些结果表明，所制备的抗NPC1L1的IgY抗体有效结合NPC1L1蛋白，并且结合的IgY显著抑制了NPC1L1的胆固醇摄入。即，本发明的抗NPC1L1的IgY是具有与依折麦布相同效果的抗体，依折麦布是已知作为常规胆固醇摄入抑制剂的药物。
测试例5:抗NPC1L1的IgY抗体的动物实验
为了确认与小肠胆固醇运载蛋白NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)结合的抗NPC1L1的IgY抗体(蛋白416的抗体)的有效性，进行了动物实验。
(1)实验动物
此处所用的实验动物是获自KOATECH (韩国)的5周龄C57BL/6雌性小鼠，将这些动物驯养7天，在测试前一天将动物分组(n=10)，以所有实验组的平均重量相同的状态进行分组。实验动物在聚碳酸酯笼(宽26cm，长42cm，高18cm)中饲养，并在以无菌蒸馏水和饲料喂养的同时使上述动物与实验动物(Purina Korea,Inc.)交配，除正常组之外的所有组自由进食可导致动脉粥样硬化的膳食(获自Central Lab.Animal Inc.D12336,Research diets,INC.，美国)，从而使其在实验期内摄入高浓度的胆固醇。实验动物根据春川生物产业基金会(Chuncheon bioindustry foundation)的实验动物伦理委员会的指示进行测试。
(2)实验组和实验材料的管理
使所有实验组的平均重量相同，进行实验组分组。将动物共分为5组，大致分为未经处理的正常组和高胆固醇饲料施用组，高胆固醇饲料的对照组，和根据IgY的施用而划分的IgY对照组和IgY施用组。IgY的施用量为50mg/kg动物体重和250mg/kg动物体重，对于IgY对照组以250mg/kg动物体重的量施用抗幽门螺旋杆菌的IgY，对于正常组和对照组施用PBS。
(3)体重的测量
根据个体识别方法利用动物用耳冲器在实验动物的耳朵上进行标记，测定相对于100%的实验初始重量的重量增加百分数。每周于预定时间测定重量一次。
(4)统计学处理
利用GraphPad 4.0prism程序通过单向ANOVA测试确定实验结果的显著性，并相对于施用高胆固醇饲料的对照组进行表示。
(5)实验结果
由图10可知，作为施用高胆固醇饲料的结果，实验后3周时重量增长百分比快速增高，并且在6周后观察到显示宽曲线的重量增长百分比；假设实验初始重量为100%，施用高胆固醇饲料的对照组显示出重量增加41%，而施用抗NPC1L1的IgY的组显示出重量增加30%和29%，这表明由饲料引起的体重增加百分比显著降低(p<0.01)。
另外，为了确认IgY的施用效果，施用抗幽门螺旋杆菌的IgY的组没有显示出所施用IgY对体重增加的抑制效果。
因此，可以认为IgY有效地作用于小肠胆固醇运载蛋白NPC1L1，从而显著抑制体重增长。
虽然为了阐释的目的已经披露了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员可理解的是在不背离所附权利要求中限定的本发明的范围和实质的情况下，可以进行各种变化、增加和替换。
【序列表自由文字】
Seq.No.1表示编码人的小肠中存在的胆固醇运载蛋白NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)的核酸序列。
Seq.No.2表示编码人的小肠中存在的胆固醇运载蛋白NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)的氨基酸序列。
Seq.No.4、6、8、10、12、14和16表示NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的7个环的氨基酸序列。
Seq.No.3、5、7、9、11、13和15分别表示编码Seq.No.4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列的核酸序列。
Figure IDA00002322649400011
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Claims (12)

1.一种抑制胆固醇吸收的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IgY型抗体，所述IgY型抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述向腔突出的环部分中的部分氨基酸序列是由选自序列编号4、6、8、10、12、14和16中的一个序列表示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，通过将能够引发抗原性的载体蛋白与NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列结合，从而形成所述抗原。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述能够引发抗原性的载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)。
5.一种预防或抑制肥胖症的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IgY型抗体，所述IgY型抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述向腔突出的环部分中的氨基酸序列是由选自序列编号4、6、8、10、12、14和16中的一个序列表示的氨基酸序列。
7.如权利要求5所述的组合物，其中，通过将能够引发抗原性的载体蛋白与NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列结合，从而形成所述抗原。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述能够引发抗原性的载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)。
9.一种预防或抑制高脂血症的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IgY型抗体，所述IgY型抗体的抗原包含作为小肠胆固醇运载蛋白的NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列作为表位。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述向腔突出的环部分中的氨基酸序列是由选自序列编号4、6、8、10、12、14和16中的一个序列表示的氨基酸序列。
11.如权利要求9所述的组合物，其中，通过将能够引发抗原性的载体蛋白与NPC1L1(尼曼-匹克C1样1)中的向腔突出的环部分中的全部或部分氨基酸序列结合，从而形成所述抗原。
12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述能够引发抗原性的载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)。
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