JP5367184B2

JP5367184B2 - 腸内コレステロール吸収抑制を通じた高脂血症及び肥満抑制用組成物

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Publication number: JP5367184B2
Application number: JP2012552822A
Authority: JP
Inventors: チャン，サン−ホ; チェ，ス−ヨン; イ，ヨム−ピョ; アン，ジェ−ジン; チョン，ホン−ゴル; クォン，ヒョク−セ; パク，チョン−クム; ペク，ドゥ−ヨン
Original assignee: Bioceltran Co Ltd
Current assignee: Bioceltran Co Ltd
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2011-04-25
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2031-04-25
Also published as: KR20110135332A; EP2581094A2; US8609098B2; WO2011155705A9; JP2013518924A; WO2011155705A2; KR101110313B1; CN102869382A; US20120322987A1; EP2581094A4; WO2011155705A3

Description

本発明は、高脂血症及び肥満抑制用組成物に係り、より詳細には、腸内コレステロール吸収抑制を通じた高脂血症及び肥満抑制用組成物に関する。

コレステロールは、冠状動脈性心血管疾患を誘発する原因物質として知られており、冠状動脈性心血管疾患は、現在、あらゆる死亡原因の３０％以上を占めるものと知られている。

心血管疾患は、従来、脂肪摂取が多く、肥満人口が多い先進国の疾患として認識されていたが、経済水準の発達による食生活の西洋化、運動不足、過労などの原因により大韓民国でその発病率が顕著に増加している。特に、血液中でコレステロールの運搬に関与する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、動脈硬化症の誘発において特異因子と見なされており、酸化したＬＤＬは動脈硬化症誘発作用が強いものと知られている。

一方、肥満は、ほとんど、摂取した熱量のうち、消耗してから余る部分が脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）に転換されて体内の様々な部分、特に皮下組織と腹腔内に蓄積する現象を称し、肥満の原因には、遺伝的要因、環境的要因、エネルギー代謝異常などがあり、肥満の種類には、提供される原因によって単純性（一次性）肥満と症候性（二次性）肥満とに分類することができる。

単純性（一次性）肥満は、肥満患者のほとんどを占めており、カロリーの過多摂取とこれの体内消費不足で余剰エネルギーが体内の脂肪として蓄積して現れる現象として知られている。

症候性（２次性）肥満は、甲状腺機能低下症、副腎皮質ホルモンの過多分泌、多嚢胞性卵巣症候群などのような疾病や経口用避姙薬、トランキライザー、ステロイドホルモン剤、抗ヒスタミン成分が含まれた薬物などによって誘発されるものとして知られている。

肥満は、脂肪組織による腹部圧迫によって便秘と消化不良、胃腸障害などを起こし、糖尿、高血圧、動脈硬化、心臓病、癌などの成人病とその合併症を誘発するだけでなく、自身の身体に対する不平、不安、人格障害、うつ症などの精神的な病気まで誘発するため、万病のもとと言うことができる。

したがって、体内コレステロールの量を減らして、心血管疾患を事前に予防し、万病のもとである肥満を予め予防する必要がある。そのためには、コレステロールの吸収自体を遮断するのが最も効率的な方案と言える。

一方、従来、コレステロールの吸収を阻害するものとして、ゼチーア（Ｚｅｔｉａ）で知られたエゼチミブ（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）という化合物が知られており、その需要が近年増大している。拡大する肥満関連市場を考慮する時、新しい代替素材の開発が要求されている。

そこで、本発明は、根本から腸内で吸収されるコレステロールの量を減らして、高脂血症及び肥満を抑制または予防することができる新しい組成物を開発して提供することにその目的がある。

上記の目的を達成するために、本発明は、第１の形態として、腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）として含む抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を有効成分として含むことを特徴としている、コレステロール吸収抑制用組成物を提供する。

また、本発明は、第２の形態として、腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）として含む抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を有効成分として含むことを特徴とする、肥満予防または抑制用組成物を提供する。

また、本発明は、腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）として含む抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を有効成分として含むことを特徴とする、高脂血症予防または抑制用組成物を提供する。

以下、本発明の内容を下記でより詳細に説明する。

本発明は、第１の形態、第２の形態及び第３の形態として、コレステロール吸収抑制用組成物、肥満予防または抑制用組成物、及び高脂血症予防または抑制用組成物を提供し、３つの形態いずれも腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）として含む抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を有効成分として含む。

下記の本発明の実験による場合、腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）として含む抗原に対して製造されたＩｇＹタイプの抗体は、腸内でコレステロールの吸収を有効に阻害するのが確認された（阻害機構は図１を参照）。

以上のようなコレステロールの吸収阻害効果から、本発明の腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）として含む抗原に対して製造されたＩｇＹタイプの抗体は、コレステロールの吸収抑制、及びコレステロールの過多摂取により発生する肥満及び高脂血症の予防または抑制用組成物として製造されて活用され得る。

一方、本発明で使用されるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）タンパク質は、腸内に存在するコレステロール輸送タンパク質であって、一例として、人間は配列番号１に記載された核酸配列、及び配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有する。ＮＰＣ１Ｌ１は、小腸内コレステロールの吸収において重要な役割を行うものと知られており、ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質のエンドサイトーシスリサイクリング（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）によるコレステロールの吸収は、コレステロールの単一方向（体内）吸収を担当するだけでなく、ＨＤＬ、細胞内コレステロール吸収度、血中濃度に影響を受けない。また、ＮＰＣ１Ｌ１は、非エステル化した（ｎｏｎ−ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ）遊離（ｆｒｅｅ）コレステロールを選択的に認識して、肝細胞内へ単方向輸送（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を促進するものと知られている。（Ｊ．ＭａｒｋＢｒｏｗｎａｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００７）４０６,２７３−２８３）。

本発明では、上記のような役割をするＮＰＣ１Ｌ１の役割を遮断するために、これに結合できる抗体を製造するが、ＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）部分のアミノ酸配列の全部、又は一部をエピトープとする抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を製造して使用する。ＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループは、その配列が既に知られているので、生合成または遺伝子組換えを通じてペプチドとして製造し、エピトープとして使用されてもよい。

一方、ＩｇＹは、卵黄に含まれている抗体であって、ＩｇＹの形態で開発された抗体は人体に摂取時に副作用がほとんどないと知られている。ＩｇＹは、抗原をニワトリに注射して製造されることができ、これは、既存に知られている公知の方法であるため、本発明ではその説明を省略する。

一方、本発明で使用された“有効成分”とは、組成物のうち、コレステロールの吸収阻害、高脂血症抑制または肥満抑制などの効果が、本発明で提供する“ＩｇＹタイプの抗体”によることを意味し、この成分以外に、多様な補助成分が保存性、吸収促進などの目的で添加可能なことを意味する。

一方、ＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）は総７個で、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６に記載されたアミノ酸配列を有し、これをエピトープとして抗体が製造されることができる。したがって、本発明でエピトープとして使用可能な内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ部分のアミノ酸配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４及び１６に記載されたアミノ酸配列のうち一つである。

一方、本発明において、ＩｇＹタイプの抗体の製造のために使用される抗原は、抗原性を誘導することができる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）タンパク質が、ＮＰＣ１Ｌ１において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ部分のアミノ酸配列の全部、又は一部に結合されて形成されたものであってもよく、このように分子量を大きくすれば、抗原性を増大させることができる。この時、前記抗原性を誘導することができる担体（ｃａｒｒｉｅｒ）タンパク質は、一例として、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）及びＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）のうち選択されるいずれか一つを使用することができる。

本発明の組成物に有効成分として含まれるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）に対する卵黄由来のＩｇＹタイプの抗体は、腸内でコレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）に付着して、コレステロールとその輸送タンパク質との結合を妨げるため、コレステロールの体内吸収を根本から遮断し、それによって高脂血症及び肥満を予防することができる。

本発明の抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹがコレステロールの吸収を阻害する機構を示す模式図である。ＩｇＹの生産のための組換え抗原の生産、及び生産された抗原の抗原性を示す実験結果である。生産された組換え抗体ＩｇＹの電気泳動の結果である。生成された組換え抗体ＩｇＹの抗原に対する結合能力を示すウエスタンブロットの結果である。ワクチンの抗体ＩｇＹ形成の有無を定量的に示すＥＬＩＳＡの結果である。ＨｅｐＧ２細胞株を用いてＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に対するＩｇＹの結合を確認させる試験管内（Ｉｎｖｉｔｒｏ）免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の結果である。４００倍の倍率で観察した結果であり、コンフォーカル（Ｃｏｎｆｏｃａｌ）顕微鏡を通じて確認した結果である。マウスの小腸組織内ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に対するＩｇＹの結合を確認させる生体内（ｉｎｖｉｖｏ）免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の結果である。２００倍の倍率で観察した結果であり、光学顕微鏡で観察した結果である。マウスの小腸組織内ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に対するＩｇＹの結合を確認させる生体内（ｉｎｖｉｖｏ）免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の結果である。２００倍の倍率で観察した結果であり、蛍光顕微鏡で観察した結果である。ＨｅｐＧ２細胞株を用いたコレステロール吸収抑制試験の結果である。図９において‘ＣＯＭ’と‘ＩＳＡ’はアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）の種類を意味するもので、ＩＳＡは‘ＩＳＡ７０アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）'を使用して作った抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹサンプルを意味し、‘ＣＯＭ’は‘ＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）'を使用して作った抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹサンプルを意味する。高コレステロール食餌摂取８週間の体重の変化率を示すグラフである。＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１。

以下、本発明の内容を下記の実施例を挙げて説明するが、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定されるものではなく、それと等価の技術的思想の変形までを含む。

製造例１：組換え抗原の製造及び適合性確認

以下では、ＮＰＣ１Ｌ１の全体アミノ酸配列（配列番号２）のうち配列番号４に記載されたループ１（ｌｏｏｐ１、ＮＰＣ１Ｌ１が内腔方向に持つ総７個のループのうち２番目のループ）のアミノ酸を含むように、３７３番から６３４番までの２６２個のアミノ酸をクローニングして組換え抗原（以下、‘３７３タンパク質’と命名）を製造しようとした。

また、ＮＰＣ１Ｌ１の全体アミノ酸配列のうち４１６番から６３５番までの２２０個のアミノ酸をクローニングして組換え抗原（以下、‘４１６タンパク質’と命名）を製造しようとした。

また、ＮＰＣ１Ｌ１の全体アミノ酸配列のうち５０９番から６３３番までの１２５個のアミノ酸をクローニングして組換え抗原（以下、‘５０９タンパク質’と命名）を製造しようとした。

ＩｇＹの生産のための抗原を製造するために、上記のクローニングしたＤＮＡシーケンスそれぞれを、精製用Ｈｉｓ−ｔａｇを持つｐＥＴ−１５ｂベクターのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩクローニングサイトにライゲーションさせた後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ホストでＩＰＴＧを用いて発現させた。

過大発現させた後、Ｈｉｓ６アフィニティカラムを通じて精製し、可溶化させた後、それぞれ得られた組換えタンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウエスタンブロットを行った。

ウエスタンブロットのために使用された抗体は、市販中のａｎｔｉ−ＮＰＣ１Ｌ１マウス単抗体とＨＲＰが結合された抗マウスヤギ抗体を使用した。

実験結果は図２に示す通りである。過大発現後に精製された組換えＮＰＣ１Ｌ１抗原（３７３タンパク質、４１６タンパク質、５０９タンパク質）が、マウスで作られた抗−ＮＰＣ１Ｌ１抗体により反応することによって、主要エピトープを持っている組換えタンパク質として製造されたことが確認され、ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質の機能を抑制するＩｇＹを生産する抗原としての性質も確認された。

実施例：組換え抗原のワクチンを通じたＩｇＹ抗体生産
（１）ワクチン準備
上記製造例１で製造されたもので、組換えされたペプチド形態のＮＰＣ１Ｌ１抗原とフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ、Ｄｉｆｃｏ２６３８１０、ＵＳＡ）とを同量の体積で混合して製造し、アジュバントによる抗体形成に対する差を調べるために、一般的なアジュバントであるＩＳＡ７０と抗原とを同量でシリンジを用いて混合し、特異卵黄抗体の生産のためのワクチンを準備した。

組換えされたペプチドと担体（Ｃａｒｒｉｅｒ）との接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、マレイミド活性化ＢＳＡ、ＫＬＨコンジュゲーションキット（ＭａｌｅｉｍｉｄｅＡｖｔｉｖａｔｅｄＢＳＡ、ＫＬＨｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎＫｉｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＢＫ１、ＵＳＡ）を用いて試み、その方法は、提供された説明書に基づいて進行した。方法を簡単に説明すると、担体タンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２３０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、８０ｍＭスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、ｐＨ６．６に溶かし、組換えされたペプチドは２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭＥＤＴＡ、８０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．６に溶かして、この二つを混ぜて１２時間以上冷蔵撹拌し、最終的にＳｅｐａｄｅｘＧ−２５Ｍゲル濾過カラムを用いて分離した。

（２）産卵鶏免疫
製造されたワクチンを２２週齢になったＨｙ−ＬｉｎｅＢｒｏｗｎ産卵鶏に１ｍｌずつ胸に筋肉注射し、３週間隔で１次接種した後に２回ブースティング（Ｂｏｏｓｔｉｎｇ）を実施した。

（３）免疫卵黄抗体の分離及び確認
ｉ）免疫卵黄抗体の分離
免疫化された産卵鶏から生産された鶏卵においてＩｇＹの分離は硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ、ｓｉｇｍａＵＳＡ）を用いて分離した。硫酸アンモニウム法はアキタらの方法（Ａｋｉｔａ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄＮａｋａｉ，Ｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓｆｒｏｍｅｇｇｙｏｌｋ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ．J．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．，５７：６２９−６３３、１９９２）によって卵黄の卵膜を除去し、１：４の割合でｐＨ２．５Ｄ．Ｗと希釈して、−２０℃で２日間冷凍させた後、７０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上層液を濾過して水溶性タンパク質を分離した。分離されたタンパク質から、過飽和された硫酸アンモニウム溶液で純粋タンパク質を４℃オーバーナイトして沈殿させた。沈殿された溶液を遠心分離してペレットを得、ＰＢＳで再浮遊した後、４℃ＰＢＳバッファで透析後に分離された抗体サンプルを回収した。

ｉｉ）電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ-ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、５％濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇｇｅｌ）と１０％分離ゲル（ｓｅｐｅｒａｔｉｎｇｇｅｌ）を使用して、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ．Ｕ．Ｋ．ＣｌｅａｖａｇｅｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｈｅａｄｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４．Ｎａｔｕｒｅ、２２７（５２５９）：６８０−６８５、１９７０）に従って実施し、電気泳動の後、ゲルをクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ）Ｒ−２５０溶液で３０分間染色し、脱染緩衝液（ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）を用いて分離されたＩｇＹ抗体を確認した。図３は、生産された組換え抗体ＩｇＹの電気泳動の結果である。

（４）分離されたＩｇＹの抗原との結合能確認
ウエスタンブロッティングを通じて分離されたＩｇＹ抗体のペプチド抗原との結合能を確認したが、その結果、図４で示すように、免疫により生成されたＩｇＹがＮＰＣ１Ｌ１のＣループ部分を含む組換えタンパク質を認識して結合することが確認された。

実験例１：ＥＬＩＳＡ試験方法を用いた抗体形成の有無確認
本実験例では、ＥＬＩＳＡ試験方法を用いて、上記において完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）とＩＳＡ７０アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を使用して作ったワクチン（４１６タンパク質）による抗体形成の有無を定量的に確認した。

ｉ）ＮＰＣ１Ｌ１−ＢＳＡが付いている抗原を、炭酸塩緩衝液（Ｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ）を用いて９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートに４００ｎｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、３７℃、１時間培養して抗原をコーティングした。

ｉｉ）ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％−ＢＳＡでブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を３７℃で１時間の間行った。

ｉｉｉ）ＰＢＳＴで３回洗浄し、サンプルを１００ｕｌずつ処理し、３７℃で１時間の間培養した。

ｉｖ）ＰＢＳＴで３回洗浄し、２次抗体として、抗−ニワトリ−ＩｇＹ−ＨＲＰを１００ｕｌずつ処理し、３７℃で１時間の間培養した。

ｖ）ＰＢＳＴで３回洗浄し、基質溶液を製造した後、１００ｕｌ入れて発色反応を１０分間進行し、２Ｎ硫酸で反応を停止させた。

ｖｉ）ＥＬＩＳＡリーダで結果値を確認した。

実験結果（図５）、抗体サンプルを１：１０，０００倍希釈した結果の場合、ブランク（Ｂｌａｎｋ）値とＩＳＡ７０−ＩｇＹ、ＣＯＭ−ＩｇＹを比較して見る時、約１０〜１５倍のＯ.Ｄ値の差が現れた。一般ＩｇＹのサンプルＯ.Ｄ値の場合、ブランク値と差がないことから、抗−ＮＰＣ１Ｌ１-ＩｇＹ抗体が形成されたことが分かった。

また、アジュバント間の差による抗体形成の有無には微生物のＯＭＰが含有されたフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ、Ｄｉｆｃｏ２６３８１０、ＵＳＡ））がＩＳＡ７０アジュバントよりも優れた力価を示した。

以上、実施例１のウエスタンブロット実験と本ＥＬＩＳＡ実験の結果から見る時、抗−ＮＰＣ１Ｌ１−ＩｇＹ抗体がよく移行して形成され、抗原に抗体が結合することを確認することができた。

実験例２：試験管内（Ｉｎｖｉｔｒｏ）ＮＰＣ１Ｌ１の免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
卵黄から分離した抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ抗体（４１６タンパク質に対する抗体）が抗原であるＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に結合するか否かを調べるために、ＮＰＣ１Ｌ１を過発現しているものと知られている肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞株を持って、生体内（Ｉｎｖｉｔｒｏ）上で免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を実施した。（ＤａｖｉｅｓＪＰ，ＳｃｏｔｔＣ，ＯｉｓｈｉＫ，ＬｉａｐｉｓＡ，ＩｏａｎｎｏｕＹＡ．ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＰＣ１Ｌ１ｃａｕｓｅｓｍｕｌｔｉｐｌｅｌｉｐｉｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｄｅｆｅｃｔｓａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００５Ａｐｒ１；２８０（１３）：１２７１０−２０．Ｅｐｕｂ２００５Ｊａｎ２５．）
１ｘ１０^４／ｍｌでスライドチャンバ（ｓｌｉｄｅｃｈａｍｂｅｒ）に細胞を広げ、１８時間培養した後に試験を進行した。細胞培養液（ｃｅｌｌｍｅｄｉｕｍ）を取り除いて、３．７％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）し、ＰＢＳＴで洗浄した後、透過緩衝液（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で２０分間処理し、一次抗体として、抗−ＮＰＣ１Ｌ１−ＩｇＹ２．５ｕｇ／ｍｌと商業用抗体（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌａｎｔｉｂｏｄｙ）であるウサギ−抗−ＮＰＣ１Ｌ１（Ｒａｂｂｉｔ−Ａｎｔｉ−ＮＰＣ１Ｌ１、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＵＳＡ）を１／５０で希釈して、それぞれ１時間処理した。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体として、抗−ニワトリＩｇＹ−Ａｌｅｘａ４８８（Ａｎｔｉ−ＣｈｉｃｋｅｎＩｇＹ−Ａｌｅｘａ４８８、Ｂｉｏｔｉｕｍ、ＵＳＡ）と抗−ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ａｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）をそれぞれ１／１００で希釈して、室温（ＲＴ）で１時間処理した後に、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で核を３０分間対比染色（Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）した後、マウンティング（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ）し、マルチフォトン共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｍｕｌｉ−ｐｈｏｔｏｎＣｏｎｆｏｃａｌＬａｓｅｒＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡＮＬＯ、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて結果を観察した。

免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、ＩＦ）の結果（図６）を見ると、一次抗体を処理しない陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）を除いて、抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ抗体が抗原であるＮＰＣ１Ｌ１に結合して細胞質（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）部分で発現していることを確認することができ、卵黄を通じて生産した抗体が標的タンパク質（Ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ）によく結合することを確認することができた。

実験例３：生体内（ｉｎｖｉｖｏ）免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）及び免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
上記の結果から、試験管内（Ｉｎｖｉｔｒｏ）で抗−ＮＰＣ１Ｌ１-ＩｇＹがＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に結合することを確認した。実際に小腸内に存在するＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に結合するか否かを確認するために、マウスの小腸組織を持って、免疫組織化学（ＩＨＣ）と免疫蛍光（ＩＦ）をそれぞれ実施した。

（１）生体内（ｉｎｖｉｖｏ）免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方法
卵黄から分離した抗−ＮＰＣ１Ｌ１-ＩｇＹ（４１６タンパク質に対する抗体）がＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に結合するか否かを調べるために、マウスの小腸組織において免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を実施した。

Ａｌｔｍａｎｎら（ＡｌｔｍａｎｎＳＷ、ＤａｖｉｓＨＲＪｒ、ＺｈｕＬＪ、ＹａｏＸ、ＨｏｏｓＬＭ、ＴｅｔｚｌｏｆｆＧ、ＩｙｅｒＳＰ、ＭａｇｕｉｒｅＭ、ＧｏｌｏｖｋｏＡ、ＺｅｎｇＭ、ＷａｎｇＬ、ＭｕｒｇｏｌｏＮ、ＧｒａｚｉａｎｏＭＰ．Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１Ｌｉｋｅ１ｐｒｏｔｅｉｎｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｆｏｒｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４Ｆｅｂ２０；３０３（５６６１）：１２０１−４）は、小腸内ＮＰＣ１Ｌ１の分布が小腸近位部（ＳｍａｌｌＩｎｔｅｓｔｉｎｅＰｒｏｘｉｍａｌ）の部分に多く存在すると報告した。

したがって、マウスの小腸を採取して、十二指腸部分を除外した中心部の空腸（Ｊｅｊｕｎｕｍ）部位を採取してＰＢＳで洗浄し、腸管内の飲食物を除去した後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、自動組織処理機（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、パラフィン固定後に包埋（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）してパラフィンブロックを作った後、組織微細切片器（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて５μｍに切片して、免疫染液用スライドサンプルを作製した。

スライドは、キシレン（Ｘｙｌｅｎｅ）で脱パラフィン処理した後、エタノールシリーズ（１００％、９５％、９０％、８０％、７０％、５０％）で含水し、ＰＢＳで洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼ（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去するために、０．３％Ｈ_２Ｏ_２処理後、５％正常血清（ＮｏｒｍａｌＳｅｒｕｍ、Ｖｅｃｔｏｒ、ＵＳＡ）でブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）処理し、一次抗体は、卵黄から分離した抗−ＮＰＣ１Ｌ１−ＩｇＹ（２．５ｕｇ／ｍｌ）と商業用抗体（ウサギ−抗−ＮＰＣ１Ｌ１、１／５０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＵＳＡ）をそれぞれ濃度別に処理し、４℃オーバーナイト培養した。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体を（Ａｎｔｉ−ＣｈｉｃｋｅｎＢｉｏｔｉｎ、Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｖｅｔｏｒ、ＵＳＡ）１／１００で希釈して、室温（ＲＴ）で２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮＡＢＣＫｉｔ（Ｖｅｔｏｒ、ＵＳＡ）を用いてＡＢＣを２時間培養させた。ＤＡＢ（Ｖｅｔｏｒ、ＵＳＡ）溶液を２〜５分間反応させ、ＰＢＳで洗浄した後、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ、Ｖｅｔｏｒ、ＵＳＡ）で対比染色（Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）を行い、Ｄ．Ｗで洗浄した後、エタノールシリーズで脱水とキシレン処理後、マウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）し、光学顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて結果を観察した。

（２）生体内（ｉｎｖｉｖｏ）免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）方法
卵黄から分離した抗−ＮＰＣ１Ｌ１−ＩｇＹがＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に結合するか否かを調べるために、マウスの小腸組織において免疫蛍光を実施した。組織パラフィンスライドはキシレンで脱パラフィン処理した後、エタノールシリーズ（１００％、９５％、９０％、８０％、７０％、５０％）で含水し、ＰＢＳで洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼを除去するために、０．３％Ｈ_２Ｏ_２処理後、５％正常血清（Ｖｅｃｔｏｒ、ＵＳＡ）でブロッキング処理し、一次抗体は、卵黄から分離したＮＰＣ１Ｌ１−ＩｇＹ（２．５ｕｇ／ｍｌ）と商業用抗体（Ｒａｂｂｉｔ−Ａｎｔｉ−ＮＰＣ１Ｌ１、１／５０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＵＳＡ）をそれぞれ濃度別に処理し、４℃でオーバーナイトインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体として、抗−ニワトリＩｇＹ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｂｉｏｔｉｕｍ、ＵＳＡ）と抗−ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）をそれぞれ１／１００で希釈して、室温で２時間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で核を対比染色した後にマウンティングし、蛍光顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて結果を観察した。

（３）実験結果
図７及び図８の結果を見ると、全体的に回腸絨毛末端部に強く発現していることを確認することができ、絨毛末端部の他にも内側でも発現していることが確認された。ＩＦの場合、絨毛末端上皮細胞部分において強く線の形態で蛍光発現をしていることを確認することができた。

以上の結果から、本発明で生産されたＩｇＹが実際に小腸組織においても結合する事実を確認することができた。

実験例４：抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ抗体のコレステロール吸収能測定（ＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｕｐｔａｋｅＡｓｓａｙ）
抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ（４１６タンパク質に対する抗体）の効能効果を調べるために、ＨｅｐＧ２細胞を用いてコレステロール吸収能試験を実施した。

ＨｅｐＧ２細胞を、２Ｘ１０^５／ｍｌの密度で、２４ウェルプレートに１０％ＦＢＳ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）培地を用いて１８時間培養した後、抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹを濃度別に（５、２５、５０ｕｇ／ｍｌ）処理し、陽性対照群として、コレステロール吸収阻害剤と知られたエゼチミブ（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）を１０ｕｇ／ｍｌで処理して比較した。サンプルは、それぞれ３７℃で１時間前培養した後に取り除き、新しい培養液を添加して洗浄した。放射性同位元素が付着された［^３Ｈ］−コレステロールを５０ｕＭ濃度で添加し、３時間を処理した。細胞を０．１％脂肪酸フリー（ｆａｔｔｙａｃｉｄ−ｆｒｅｅ）ＢＡＳが添加されたＰＢＳで洗浄し、ＨＢＳＳ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）で細胞を集めた後に、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）が添加されたＨＢＳＳで細胞溶解（ｃｅｌｌｌｙｓｉｓ）を行い、放射線量をベックマン（Ｂｅｃｋｍｅｎ）ＬＳ６５０0シンチレーションカウンター（ＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＣｏｕｎｔｅｒ）で測定して、ＩｇＹ未処理群を対照群として比較分析した。

図９の結果を見ると、なんにも処理していない対照群に比べて陽性対照群として使用したエゼチミブが１０ｕｇ／ｍｌの濃度において有意的に（ｐ＜０．０５）減少した結果が現れ、ＩｇＹも２５ｕｇ／ｍｌの濃度からコレステロールの吸収を有意的に（ｐ＜０．０５）減少した結果を示す。図９で、‘ＣＯＭ’と‘ＩＳＡ’はアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）の種類を意味するもので、ＩＳＡは‘ＩＳＡ７０アジュバント’を使用して作った抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ処理群を意味し、‘ＣＯＭ’は、‘ＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）'を使用して作った抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ処理群を意味する。

このような結果は、生産された抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ抗体がＮＰＣ１Ｌ１タンパク質に效果的に結合し、結合されたＩｇＹによってＮＰＣ１Ｌ１によるコレステロールの吸収が有意的に抑制することを意味する。すなわち、本発明の抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹが既存にコレステロール吸収抑制剤と知られている薬物であるエゼチミブと同じ効果を有する抗体であることを意味する。

実験例５：抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ抗体の動物試験
腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１Ｌｉｋｅ１）に結合する抗−ＮＰＣ１Ｌ１ＩｇＹ抗体（４１６タンパク質に対する抗体）の効能を調べるための動物実験を進行した。

（１）試験動物
試験動物は（株）コアテック（ＫＯＡＴＥＣＨ、韓国）から購入した５週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを使用し、動物の入手後、検疫と７日間の馴化期間を経て、試験実施一日前にグループ別に１０頭ずつ分離して、全ての試験群間の平均体重を同一に合せて群の分離を実施した。実験動物はポリカーボネートケージ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅｃａｇｅ、幅２６cm、長さ４２cm、高さ１８cm）で飼育し、滅菌された精製水と実験動物用飼料（ＰＵＲＩＮＡＫＯＲＥＡ製）を自由摂食させながら飼育し、正常群を除外した残りの全てのグループは、中央実験動物（株）で購入したアテロジェニック食餌（Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｄｉｅｔ、Ｄ１２３３６、Ｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｅｔｓ、ＩＮＣ．ＵＳＡ）を自由摂食させて、高濃度のコレステロールを試験期間中に摂取するようにした。試験動物は春川バイオ産業振興院の実験動物倫理委員会の方針によって試験を進行した。

（２）試験群及び試験物質投与
全ての試験群間の平均体重を同一に合せた後に試験グループを分けた。試験グループは全て５グループに分離し、なんにも処理していない正常群と高コレステロール飼料投与群とに大別し、高コレステロール飼料に対する対照群、及びＩｇＹ投与によるＩｇＹ対照群とＩｇＹ投与群に分けた。ＩｇＹは動物の体重ｋｇ当り５０ｍｇと２５０ｍｇを投与し、ＩｇＹ対照群は、抗−ヘリコバクターピロリ（Ａｎｔｉ―Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）ＩｇＹを動物の体重ｋｇ当り２５０ｍｇを投与し、正常群及び対照群はＰＢＳを投与した。

（３）体重測定
試験動物は個体識別法によって動物用耳パンチを用いて耳に個体識別標識を施し、体重は試験開始当時の体重を１００％と見て、体重増加率を測定した。体重は毎回同じ時間に測定し、試験期間中、１週間に１回体重を測定した。

（４）統計処理
試験結果に対する有意性の検証はＧｒａｐｈＰａｄ４．０ｐｒｉｓｍプログラムを用いてＯｎｅＷａｙＡＮＯＶＡ−Ｔｅｓｔを進行し、高コレステロール食餌を投与した対照群に対して有意性を表示した。

（５）試験結果
図１０で示すように、高コレステロール食餌を投与した結果、試験３週目から体重増加率が急激に上がる傾向を示し、その後、６週目以後に緩やかな曲線を示す体重増加率を示し、試験開始体重を１００％と見た時、高コレステロール食餌摂取群である対照群グループが４１％の体重増加を示し、それに比べて抗−ＮＰＣ１Ｌ１−ＩｇＹを投与したグループでは３０％と２９％の増加率を示して、食餌による体重増加率を有意的に減少させた（ｐ＜０．０１）。

また、ＩｇＹの投与による影響を調べるために、抗−ヘリコバクターピロリＩｇＹを投与したグループではＩｇＹの投与に起因した体重増加抑制の効果は現れなかった。

したがって、腸内コレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１に対してＩｇＹが效果的に作用して、増加する体重を有意的に抑制させたことと判断することができた。

配列番号１は、人間の腸内に存在するコレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）を暗号化する核酸配列である。

配列番号２は、人間の腸内に存在するコレステロール輸送タンパク質であるＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）のアミノ酸配列である。

配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６は、ＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、内腔（ｌｕｍｅｎ）側に突出して形成されたループ（ｌｏｏｐ）７個のアミノ酸配列である。

配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６のアミノ酸配列をそれぞれ暗号化する核酸配列である。

Claims

腸内コレステロール輸送タンパク質である配列番号2のアミノ酸配列を有するＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、４１６番から６３５番までのアミノ酸配列をエピトープとして含む抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を有効成分として含むことを特徴とする、肥満予防または抑制用組成物。
腸内コレステロール輸送タンパク質である配列番号2のアミノ酸配列を有するＮＰＣ１Ｌ１（Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１−Ｌｉｋｅ1）において、４１６番から６３５番までのアミノ酸配列をエピトープとして含む抗原に対するＩｇＹタイプの抗体を有効成分として含むことを特徴とする、高脂血症予防または抑制用組成物。