CN106957363A - 一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法。所述生长抑素14肽的卵黄抗体是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。所述生长抑素14肽卵黄抗体中IgY的纯度为87％，蛋白浓度可达到9.6mg/mL，生长抑素14肽卵黄抗体的效价为1：64000。由于生长抑素14肽卵黄抗体在特异性、稳定性和生产便利上均优于IgG，不仅可以治疗疾病还能在免疫学检测上发挥作用，也可以实现产业化，作为药物、检测试剂大规模生产，具有很大的应用前景。

Description

一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和免疫学检测领域，更具体地，涉及一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
生长抑素14肽是调节动物生长的小分子多肽。SS是通过抑制垂体生长激素，促卵泡素，促乳素等激素的分泌和抑制消化系统的蛋白酶、消化液的合成与分泌等途径起到抑制动物生长、消化和泌乳的作用。它最初是从羊和猪的下丘脑提取液中分离得到，并于20世纪70年代人工合成，是环状14肽，在Cys3和Cys14之间存在一个二硫键。
制备的生长抑素14肽卵黄抗体可以作为药物，用于促进生长激素、促乳素及一些消化酶的分泌，也可以作为添加剂加入到动物饲料中，达到促进动物生长的目的，提高养殖效率。生长抑素卵黄抗体由于其优于IgG的免疫特性，可用于检测动物或人体中的多种激素水平的异常状态，并来作为诊断疾病的一种检验方式。
由于生长抑素14肽作为半抗原没有免疫原性，其分子量只有1638，单独的多肽不足以激起充分的免疫反应，必须将半抗原与大分子蛋白偶联作为完全抗原才能激发抗原的免疫活性。最普遍使用的偶联载体蛋白是牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)，它们在一些免疫检测实验中作为阻断剂而限制了它们的使用，而KLH在ELISE或Western blotting检测中没有抑制作用从而不影响实验结果。因此，在这种偶联方式制得的抗体具有更广的应用范围。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种生长抑素14肽卵黄抗体。该生长抑素14肽卵黄抗体具有纯度高，免疫性能好以及特异性强的优点。
本发明的另一个目的在于提供一种上述生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法。该方法是通过碳二亚胺法，将血蓝蛋白KLH人工偶联到天然的生长抑素14肽半抗原的N端，制得的完全抗原作为免疫抗原，免疫产蛋母鸡，并从其所产蛋的蛋黄中经PEG或硫酸铵沉淀的纯化得到生长抑素14肽卵黄抗体。
本发明的再一目的在于提供上述的生长抑素14肽卵黄抗体的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种生长抑素14肽的卵黄抗体，是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。
优选地，所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
上述生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，包括如下具体步骤：
S1.免疫抗原的制备：
(1)在pH4.5-5条件下，将血蓝蛋白KLH溶解于无水乙醇，再用蒸馏水稀释后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在4℃下搅拌反应30～60min，得到KLH处理液；
(2)将半抗原生长抑素14肽用20％的乙醇溶解后，300～500μL/秒滴入KLH处理液中，使血蓝蛋白KLH含量与半抗原生长抑素14肽的摩尔量相等，调整pH值为7.0，在4℃下反应20～24h，将产物在4℃下PBS中透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽；
(3)用磷酸盐缓冲液溶解血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽配成1mg/mL的溶液，制得免疫抗原，-20℃冻存备用；
S2.免疫：首次免疫时将免疫抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后，采用鸡翅部多点皮下注射免疫母鸡，用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，首次免疫后每隔14天加强免疫一次，共加强免疫四次；
S3.抗体粗品的制备：在首次免疫后的第20～80天收集鸡蛋，鸡蛋按照天数进行分批，3～4天分为一批处理，鸡蛋先用70％的酒精消毒，打破蛋壳后倾倒掉蛋清液，刺破卵黄膜，得到含有生长抑素14肽的卵黄抗体的卵黄液，即为生长抑素14肽的卵黄抗体粗品；
S4.生长抑素14肽的卵黄抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素14肽的卵黄抗体。
优选地，步骤S1中(1)所述血蓝蛋白KLH与无水乙醇的质量体积比为5～6：1mg/mL，所述血蓝蛋白KLH与蒸馏水的质量体积比为1：6～10mg/mL，所述血蓝蛋白KLH和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比1：1.5～2；步骤S1中(2)所述半抗原生长抑素14肽与乙醇溶液的质量体积比为1：1～2mg/mL，所述半抗原生长抑素14肽和KLH处理液的体积比1：50～80；步骤S1中(3)所述冷冻干燥的温度为-60～-80℃，冷冻干燥的时间16～20h。
优选地，步骤S2中所述的免疫抗原与弗氏不完全佐剂的体积比为1：1。
优选地，步骤S4中所述提纯的方法包括如下具体步骤：
S11.卵黄液用PEG/PBS溶液稀释并不断搅拌，静置16～24h后用纱布过滤再离心得到上清液，加入PEG6000溶液搅拌再次沉淀，离心后的沉淀用PBS溶解再进行透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素14肽的卵黄抗体；
或者，
S21.用酸化双蒸水稀释卵黄液并不断搅拌，静置16～24h后离心得到上清液，
S22.上清液用饱和硫酸铵溶液混合搅拌，离心，得到沉淀，
S23.再用PBS溶液溶解步骤S22所得沉淀，加入饱和硫酸铵溶液，搅拌后离心，得到的沉淀用PBS溶解再透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素14肽的卵黄抗体。
优选地，步骤S11中所述卵黄液与PEG/PBS溶液的体积比为1：3～4，所述PEG/PBS溶液的浓度为3％～5％，所述PEG 6000溶液的浓度为10％～15％。
优选地，步骤S21中所述酸化双蒸水是用盐酸调节pH＝4.7～5.6的蒸馏水。
优选地，步骤S21中所述酸化双蒸水与卵黄液的体积比为6～10：1，步骤S22中所述上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1：0.8～1.2，步骤S23中所述步骤S22所得沉淀与PBS溶液的质量体积比为1：10～50mg/mL。
上述的生长抑素14肽卵黄抗体在制备酶联免疫试剂盒以检测生长抑素类药物疫苗中生长抑素的定性检测和动物的饲料的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的生长抑素14肽的卵黄抗体的制备过程简易可实现产业化，其中采用的PEG或硫酸铵沉淀的纯化方法获得的抗体不仅纯度高，同时还保留了抗体的高效价。
2.本发明将没有免疫原性的半抗原生长抑素14肽，与带有很多抗原表位的血蓝蛋白KLH进行偶联，有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应，从而刺激动物体更易产生特异性良好且活性突出的抗体。
3.本发明的生长抑素14肽的卵黄抗体卵黄抗体的特异性高，免疫性能好，抗体的稳定性突出，不仅可制成药物治疗或预防疾病，还可以在养殖技术上作为一种添加剂促进动物生长，同时也在生物诊断和免疫学检测上有广泛的用途。
附图说明
图1为实施例4中生长抑素14肽卵黄抗体的SDS-PAGE电泳图。
图2为实施例5中生长抑素14肽卵黄抗体的效价。
图3为实施例6中生长抑素14肽卵黄抗体的竞争抑制曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中所用弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂分别采购于美国Sigma-Aldrich公司。
实施例中选用的产蛋白羽鸡购于广州良田良沙养殖场。
实施例1生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法
免疫抗原KLH-SS14的制备：将100mg血蓝蛋白KLH溶解于20ml无水乙醇，再用800ml双蒸水稀释后，用盐酸调整pH为5.0，加入200mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)在4℃下搅拌反应30min得到KLH处理液。将10mg半抗原生长抑素14肽用10ml20％乙醇溶解，将半抗原溶液缓以500μL/秒的速率滴入KLH处理液不断搅拌，调整PH为7.0，在4℃下反应24h。反应结束后，溶液在PBS中透析两天，-80℃冷冻干，得到免疫抗原KLH-SS14，在-20℃下冻存。
称取2mg免疫抗原KLH-SS14，用2mlPBS溶解后，配成1mg/mL的溶液，首次免疫时，与2mL弗氏完全佐剂混合，在4℃下乳化20min，制得的乳浊液用来免疫4只母鸡，每只总剂量300μL。采用翅部皮下多点的注射方式，每边翅部分三个点注射。每隔14天后用弗氏不完全佐剂进行加强免疫，共免疫五次。在初免后第20-80天收集鸡蛋，每周取一次，分为两批处理。
实施例2生长抑素14肽卵黄抗体的纯化方法
将实施例1中收集的鸡蛋进行分组，原则是3-4天的鸡蛋分为一批来处理，每批有5-10个不等。每批的处理方法相同。用70％的酒精消毒，打开蛋壳除去蛋清，小心地刺破卵黄膜，让卵黄液从刺破的小孔中流出，并量取体积，每个鸡蛋可以提取15-30ml的卵黄液。首先配制PEG/PBS溶液，1L的PBS加入35g的PEG6000，搅拌使其充分溶解。卵黄液与PEG/PBS溶液以1:3的体积比混合，搅拌30min，用保鲜膜封好于4℃静置16h。用四层纱布过滤，得到上清液，10000r/min，4℃下离心10min，得到清液并量取体积，每批250ml-500ml。清液中加入PEG6000粉末，质量体积比是120:1g/L，并不断搅拌30min，同样离心后的沉淀与PBS以1:1mg/mL质量体积比溶解，用PBS在4℃下透析，-80℃真空冷冻冻干，-20℃保存，所得粉体即为生长抑素14肽卵黄抗体。
实施例3生长抑素14肽卵黄抗体的纯化方法
将实施例1中收集的鸡蛋进行分组，用HCl调节双蒸水的pH为5.0，经过步骤(1)所述的分离卵黄液的方法后量取卵黄液的体积，每批85～240mL，用9倍体积的双蒸水稀释并不断搅拌30min，于4℃静置16h。用四层纱布过滤，得到的清液在8000r/min，20℃下离心20min，得到水溶组分，量取体积，每批450～1000mL。根据水溶组分的体积，以300μL/秒的速率滴加饱和硫酸铵溶液，水溶组分和饱和硫酸铵的体积比是1：1，慢速搅拌30min，让蛋白充分沉淀。同样离心20min，倒掉上清液，每批得到沉淀20～50g，随后用PBS溶解沉淀,质量体积比是1:10g/mL，再以同样的速率滴加入体积一半的饱和硫酸铵溶液，沉淀与饱和硫酸铵溶液的质量体积比是1：5g/mL，溶解并慢速搅拌30min，离心10min，将沉淀物用少量PBS溶解质量体积比1:1mg/mL，PBS透析，-80℃真空冷冻冻干，-20℃保存，所得粉体即为生长抑素14肽卵黄抗体。
实施例4生长抑素14肽卵黄抗体的SDS-PAGE电泳
根据抗体的分子量大小，选用10％的分离胶。先清洗电泳槽，按照SDS-PAGE电泳说明书上的方法配制分离胶，用移液枪小心地从边缘灌注，随后在电泳槽里灌注1mL蒸馏水进行封闭。大概30min凝固后，此时按照说明书上的方法配制浓缩胶。用滤纸吸去电泳槽中的蒸馏水，加入浓缩胶，30min后可以开始电泳。将制得的抗体用PBS稀释至10μL/mL的浓度，与上样缓冲液一起在120℃下煮沸15min使蛋白质变性，以每孔10μL加样。图1为实施例4生长抑素14肽卵黄抗体SDS-PAGE电泳图。其中，M是Marker蛋白，1是是实施例2提纯的卵黄抗体，2是是实施例3提纯的生长抑素14肽卵黄抗体。从图1中可看出，生长抑素14肽卵黄抗体在电解条件下被分离成两个条带，其中重链70kD和轻链25kD，测得其纯度分别为83％和87％。说明本发明制得的抗体纯度好，在提取和纯化过程中有效地去除了卵黄中脂肪、脂蛋白等杂质，得到了鸡的卵黄球蛋白IgY抗体。
实施例5检测生长抑素14肽卵黄抗体的效价
采用间接酶联免疫法：用未经偶联的生长抑素14肽半抗原用CBS碳酸缓冲盐溶液稀释至200ng/mL的浓度后作为包被抗原，每孔100uL包被于96孔板上，37℃水浴下温浴1h，在4℃过夜，用PBST洗板。3％的脱脂奶粉封闭，每孔270μL，温浴1h后洗板。加入倍比稀释的生长抑素14肽卵黄抗体，其中初始浓度为100μg/mL，每孔100μL，共稀释7个浓度，最后一排为PBS空白对照，温浴1h后洗板。加入稀释后的兔抗鸡酶标二抗，每孔100μL，温浴1h后洗板。加入TMB显色液显色15min，最后用硫酸来终止。立即用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度。图2为实施例5中抗生长抑素14肽卵黄抗体的效价图。其中，1是实施例2提纯的生长抑素14肽的卵黄抗体，2是实施例3提纯的生长抑素14肽的卵黄抗体。可以看出生长抑素14肽卵黄抗体的吸光OD值明显大于空白对照的2.1倍，抗体的效价在64000以上。说明制得的生长抑素14肽卵黄抗体具有很好的免疫活性混合亲和力，结合抗原的能力强。
实施例6检测生长抑素14肽卵黄抗体的特异性
采用间接竞争抑制ELISE法：将免疫抗原用CBS碳酸缓冲盐溶液稀释至200ng/mL的浓度作为包被抗原，每孔100uL包被于96孔板上，37℃水浴下温浴1h，在4℃过夜，用PBST洗板。3％的脱脂奶粉封闭，每孔200μL，温浴1h后洗板。在4ml的试管中分别配制稀释后的抗生长抑素14肽半抗原标准品溶液，浓度分别为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.1ng/mL。分别取各浓度的溶液200μl均加入200μL浓度为10μg/mL的生长抑素14肽卵黄抗体，混匀并在37℃水浴锅中孵育30min后，以每孔100μL加样，做3个复孔，最后一排为PBS和抗体的空白对照，温浴1h后洗板。加入稀释后的兔抗鸡酶标二抗，每孔100μL，温浴1h后洗板。加入TMB显色液显色15min，最后用硫酸来终止。立即用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度。图3为实施例6中生长抑素14肽卵黄抗体的竞争抑制曲线。从图3中可知，生长抑素14肽抗体的IC50值为80ng/mL，最低检测限为1ng/mL。说明制备的生长抑素14肽卵黄抗体具有很好的特异性和灵敏性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生长抑素14肽的卵黄抗体，其特征在于，所述生长抑素14肽的卵黄抗体是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。
2.根据权利要求1所述的生长抑素14肽卵黄抗体，其特征在于，所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
3.根据权利要求1或2所述生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1.免疫抗原的制备：
(1)在pH4.5-5条件下，将血蓝蛋白KLH溶解于无水乙醇，再用蒸馏水稀释后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在4℃下搅拌反应30～60min，得到KLH处理液；
(2)将半抗原生长抑素14肽用20％的乙醇溶解后，300～500μL/秒滴入KLH处理液中，使血蓝蛋白KLH含量与半抗原生长抑素14肽的摩尔量相等，调整pH值为7.0，在4℃下反应20～24h，将产物在4℃下PBS中透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽；
(3)用磷酸盐缓冲液溶解血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽配成1mg/mL的溶液，制得免疫抗原，-20℃冻存备用；
S2.免疫：首次免疫时将免疫抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后，采用鸡翅部多点皮下注射免疫母鸡，用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，首次免疫后每隔14天加强免疫一次，共加强免疫四次；
S3.抗体粗品的制备：在首次免疫后的第20～80天收集鸡蛋，鸡蛋按照天数进行分批，3～4天分为一批处理，鸡蛋先用70％的酒精消毒，打破蛋壳后倾倒掉蛋清液，刺破卵黄膜，得到含有生长抑素14肽的卵黄抗体的卵黄液，即为生长抑素14肽的卵黄抗体粗品；
S4.生长抑素14肽的卵黄抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素14肽的卵黄抗体。
4.根据权利要求3所述的生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述血蓝蛋白KLH与无水乙醇的质量体积比为5～6：1mg/mL，所述血蓝蛋白KLH与蒸馏水的质量体积比为1：6～10mg/mL，所述血蓝蛋白KLH和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比1：1.5～2；步骤S1中(2)所述半抗原生长抑素14肽与乙醇溶液的质量体积比为1：1～2mg/mL，所述半抗原生长抑素14肽和KLH处理液的体积比1：50～80；步骤S1中(3)所述冷冻干燥的温度为-60～-80℃，冷冻干燥的时间16～20h。
5.根据权利要求3所述的生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的免疫抗原与弗氏不完全佐剂的体积比为1：1。
6.根据权利要求3所述的生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述提纯的方法包括如下具体步骤：
S11.卵黄液用PEG/PBS溶液稀释并不断搅拌，静置16～24h后用纱布过滤再离心得到上清液，加入PEG6000溶液搅拌再次沉淀，离心后的沉淀用PBS溶解再进行透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素14肽的卵黄抗体；
或者，
S21.用酸化双蒸水稀释卵黄液并不断搅拌，静置16～24h后离心得到上清液，
S22.上清液用饱和硫酸铵溶液混合搅拌，离心，得到沉淀，
S23.再用PBS溶液溶解步骤S22所得沉淀，加入饱和硫酸铵溶液，搅拌后离心，得到的沉淀用PBS溶解再透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素14肽的卵黄抗体。
7.根据权利要求6所述的生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S11中所述卵黄液与PEG/PBS溶液的体积比为1：3～4，所述PEG/PBS溶液的浓度为3％～5％，所述PEG 6000溶液的浓度为10％～15％。
8.根据权利要求6所述的生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S21中所述酸化双蒸水是用盐酸调节pH＝4.7～5.6的蒸馏水。
9.根据权利要求6所述的生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S21中所述酸化双蒸水与卵黄液的体积比为6～10：1，步骤S22中所述上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1：0.8～1.2，步骤S23中所述步骤S22所得沉淀与PBS溶液的质量体积比为1：10～50mg/mL。
10.权利要求1所述的生长抑素14肽卵黄抗体在制备酶联免疫试剂盒以检测生长抑素类药物疫苗中生长抑素的定性检测和动物的饲料的应用。
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