CN113227136A - 用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及如下的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，即，通过将利用尼曼‑匹克C1型类似蛋白1(Niemann‑Pick C1‑Like1，NPC1L1)的重组蛋白质制备的抗原接种于与鸡属于异种动物中来制备异源性抗体后，通过将由上述抗原与异源性抗体结合而成的复合物接种于产蛋鸡中，从而制备卵黄抗体。根据本发明，通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，可通过将抗原‑异源性抗体复合物注入于产蛋鸡中来大量地制备并生产卵黄抗体，由此制备的卵黄抗体，对尼曼‑匹克C1型类似蛋白1(Niemann‑Pick C1‑Like1，NPC1L1)的重组蛋白质的特异性及结合性高而阻断尼曼‑匹克C1型类似蛋白1蛋白质的作用，从而抑制肠内胆固醇的吸收，最终可预防或治疗肥胖。
Description
技术领域
本发明涉及用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，更具体地，涉及如下的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，即，通过将利用尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质制备的抗原接种于与鸡属于异种动物中来制备异源性抗体后，通过将由上述抗原与异源性抗体结合而成的复合物接种于产蛋鸡中，从而制备卵黄抗体。
背景技术
抗体(antibody)为在淋巴组织由B淋巴细胞或B细胞形成的球蛋白类蛋白质，其为干预特异性免疫识别的重要物质之一。抗体具有两种不同的功能，第一种为通过对产生免疫反应的抗原的特定部位进行特异性识别及结合来中和抗原的作用的功能，第二种为通过使抗体与抗原结合而收集用于去除抗原的多种物质和免疫细胞的功能。例如，抗体可以通过与毒素结合而使毒素的简单的化学组成发生变化以中和毒性，且通过附着于侵入的微生物来去除微生物的移动性并妨碍微生物侵入体细胞中。并且，由抗体包围的抗原与补体产生化学链式反应而直接分解侵入的微生物或者引诱吞噬细胞。通过应用这种抗原抗体反应的特异性和高度的亲和度以及可区分数千万种类的抗原的抗体的多样性来开发了如今的包含诊断剂和治疗剂等的多种抗体的医药品(Jim E.Eyles et al.，Vaccine，25，pp73017306，2007)。
另一方面，为了从感染性疾病保护自身或保护子孙而制备出的物质中包含抗体，这种对于疾病的防御机制不仅存在于人类中，而且还存在于多种哺乳类及鸟类中。大部分哺乳类生成约150Kd的IgG，这与人类相似。哺乳类除了生成IgG之外，还生成IgA、IgD、IgE及IgM。
以往，为了制备多种病原性细菌的抗体，广泛使用了由对兔、牛、山羊等哺乳动物进行免疫处理而获得的血清生产病原性细菌特异性抗体的方法。然而，这种方法存在从小的哺乳动物的少量血清中采集抗体的缺点，而且抗体的生产量也非常少。因此，作为容易生产病原性细菌的抗体的方法，当前，利用对产蛋鸡进行免疫处理而生成的抗体移动至产蛋鸡的鸡蛋来采集抗体的方法备受关注。尤其，将存在于产蛋鸡的卵黄中的特异性抗体称为卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin Yolk，IgY)或卵黄抗体，其是作为存在于产蛋鸡的血清中的特异性抗体的免疫球蛋白(IgG)移动至鸡蛋的卵黄而生成的抗体，且在鸡蛋的卵黄中以高浓度的形式堆积。就IgY而言，由于容易被分离，从而能够在各种领域中被利用，尤其，对多种疾病具有预防及治疗效果的IgY的开发及用作药学组合物的充分利用呈增大趋势。
正在活跃地进行将病原性细菌用作抗原从产蛋鸡的鸡蛋中获取卵黄抗体的方法及包含其的组合物的开发，并且活跃地进行利用抗原-抗体复合物的疫苗的制备或用于治疗多种疾病的组合物的开发。具体地，在韩国公开专利第2009-0088121号中记载了在利用抗原-抗体复合物作为疫苗的佐剂时可增强由抗原引起的免疫反应的内容，在论文Phase Itrial of a murine antibody to MUC1 in patients with metastatic cancer(转移性癌症患者对MUC1抗体的I期试验)中告知了在为了治疗癌细胞而利用抗原-异源性抗体复合物时在激活T细胞而治疗癌细胞方面可以显示优异效果的内容(Ann Oncol.2004Dec；15(12)：1825-33)。然而，为了生产大量的卵黄抗体而利用抗原-异源性抗体复合物的方法至今尚未公开。
另一方面，肥胖是指由大部分摄取的热量中除了被消耗掉的热量之外的剩余的部分转化为脂肪细胞(adipocyte)而导致堆积在体内的多个部位，尤其堆积在皮下组织和腹腔内的现象，作为肥胖的原因存在遗传性因素、环境因素、能量代谢异常等，肥胖的种类根据所提供的原因可以分为单纯性肥胖(simple obesity)和症状性肥胖(secondaryobesity)。
单纯性肥胖占肥胖患者的大部分，单纯性肥胖被告知为由热量的过多摄取和其在体内中的消耗不足剩余能量堆积在体内的脂肪中而出现的现象。症状性肥胖被告知为由如甲状腺功能减退症、肾上腺皮质激素过多分泌、多囊卵巢综合征等疾病或者口服用避孕药、神经安定剂、类固醇激素剂、包含抗组胺成分的药物等引起的。随着报道由这种肥胖引起的多种综合征的危险性，全世界对肥胖治疗的关注也正在增加，但是，事实上对显示显著效果的肥胖治疗剂的开发还是不足。
最近，作为用于通过阻碍胆固醇的吸收来治疗肥胖的肥胖治疗剂，利用了公知为依泽替米贝(Zetia)的依折麦布(Ezetimibe)化合物，但是，包含其的多种肥胖治疗剂被告知为出现发疹、过敏、口干、感觉异常、便秘、失眠、恶心、晕眩症、失眠症等多种副作用。因此，需要开发不仅最小化上述的这些副作用而且可产生显著的肥胖预防或治疗效果的新型肥胖治疗剂。
另一方面，尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的蛋白质为存在于肠内的胆固醇运输蛋白质，在小肠内起到吸收胆固醇的重要作用。根据尼曼-匹克C1型类似蛋白1的蛋白质的内吞再循环(endocytic recycling)的胆固醇的吸收不仅负责胆固醇的单向(体内)吸收，而且不受高密度脂蛋白(HDL)、细胞内胆固醇吸收度、血液浓度的影响。并且，尼曼-匹克C1型类似蛋白1被告知为通过选择性地识别非酯化的(non-esterified)游离(free)胆固醇而向干细胞内促进单向运输(unidirectionaltransport)。
对此，本发明人为了通过与作为胆固醇运输蛋白的尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)结合来阻断其作用以抑制肠内胆固醇的吸收并最终制备可以预防或治疗肥胖的新型卵黄抗体而不断努力的结果，通过将利用尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质制备的抗原接种于与鸡属于异种动物中来制备异源性抗体后，通过将由上述抗原与异源性抗体结合而成的复合物接种于产蛋鸡而制备了卵黄抗体，此时，确认了不仅可以大量地制备并生产对尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)蛋白质的特异性及结合性高的卵黄抗体，而且，在利用其制备疫苗时通过抑制由尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)蛋白质引起的肠内胆固醇的吸收以预防或治疗肥胖，从而完成了本发明。
现有技术文献
韩国KR 10-2009-0088121 A
J.S.de Bono JS et al.，Annals of Oncology.2004Dec；15(12)：1825-33
发明内容
技术问题
因此，本发明的主要目的涉及可以大量地制备并生产对尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的特异性及结合性高的卵黄抗体的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法。
技术方案
根据本发明的一个实施方式，本发明提供用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，包括：第一步骤，利用尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质来制备抗原；第二步骤，将上述第一步骤的抗原接种于与鸡属于异种动物的小鼠或兔中来制备异源性抗体；第三步骤，通过结合上述第一步骤的抗原与上述第二步骤的异源性抗体来制备抗原-异源性抗体复合物；第四步骤，将由第一步骤的抗原及第三步骤的复合物混合而成的混合物接种于产蛋鸡中；以及第五步骤，从上述第四步骤的产蛋鸡的卵(egg)中分离针对尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质的卵黄抗体。
卵黄抗体(Immunoglobulin Yolk，IgY)是作为存在于产蛋鸡的血清中的特异性抗体的免疫球蛋白(IgG)移动至鸡蛋的卵黄而生成的抗体，在鸡蛋的卵黄中以高浓度地堆积，且分离容易，从而正在各种领域中被利用。为了大量地制备并生产这种卵黄抗体而进行研究和努力的结果，当将抗原-抗体复合物被利用为佐剂且作为抗体利用异源性抗体时，可增强免疫反应，考虑到这种事实，在利用由抗原与异源性抗体结合而成的复合物来制备卵黄抗体的情况下，确认了可大量地制备并生产对于抗原的免疫反应增强的卵黄抗体，从而完成了本发明。
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，第一步骤中的尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质是，向宿主细胞中导入包含由序列1表示的尼曼-匹克C1型类似蛋白1基因的重组表达载体后，通过表达NPC1L1蛋白质来纯化的。
上述尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)蛋白质为存在于肠内的胆固醇运输蛋白质，为了抑制通过尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)蛋白质的胆固醇的肠内吸收，生产能够与尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)蛋白质结合的新型IgY，并将其用作用于预防或治疗肥胖的疫苗。
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，上述宿主细胞是以往的能够利用于在基因克隆中所利用的任何宿主细胞中，优选地，上述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudomonad)及荧光假单胞菌(P.fluorescens)
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，在上述第二步骤中，作为异种动物，可利用以往为了制备抗体而利用的任何哺乳类，优选地，上述哺乳类为小鼠或兔。
本发明的卵黄抗体的制备方法中，优选地，在上述第四步骤中，抗原及复合物的混合比例为3:0.5～1:0.1。在复合物的比例大于上述比例的情况下，存在对复合物由过多免疫细胞的识别引起的问题，在小于上述比例的情况下，难以发挥根据适用复合物的充分效果。
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，在上述第四步骤中，混合物还包含佐剂(adjuvant)。作为上述佐剂，可以使用弗氏完全佐剂(complete Freund's adjuvant)、弗氏不完全佐剂、阳离子脂质体(lipofectin)、脂质体(lipotaxi)、CaPO4、25％至30％的蔗糖、DEAE-葡聚糖、聚凝胺(polybrene)、皂甙、如氢氧化铝的无机凝胶、溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子(polyanions)、肽(peptides)、如油或碳氢化合物乳液的表面活性物质、二硝基酚等，但并不限定于此。在本发明的实施例中，使用ISA70不完全佐剂(incomplete adjuvant)作为佐剂。
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，上述混合物及佐剂(adjuvant)的混合比例可以为2～3:7～9，优选地，混合比例为3:7。混合物的混合比例越高，产生作为乳化剂的佐剂的功能越下降的问题，从而在与抗原混合时产生水溶性层与脂溶性层分离的现象，因此，维持上述比例是非常重要的。
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，在上述第四步骤中，能够以0.1ml至3ml接种2次至5次，优选地，以0.5ml至1ml接种3次。
本发明的卵黄抗体的制备方法的特征在于，上述卵黄抗体的制备方法使卵黄抗体的生产收率增加。
根据本发明一实验例，确认了根据本发明的制备方法的卵黄抗体的生产收率的结果，可以确认，相比于向产蛋鸡中仅注入抗原而制备卵黄抗体(比较例)，在向产蛋鸡中注入抗原及抗原-异源性抗体复合物而制备卵黄抗体的情况下，在卵黄中的抗体含量增加。鉴于难以显著增加抗体的整体生产量的事实，这种结果可教导如下事实，即，在本发明的制备方法中，增加卵黄抗体的生产使抗原-异源性抗体复合物作为抗体生产的佐剂赋予协同效果，从而可大量地制备并生产卵黄抗体(参照实验例3及表5)
并且，根据本发明一实验例，确认了根据本发明的制备方法生产的卵黄抗体的胆固醇吸收能力的结果，可以确认，相比于对照组，在向产蛋鸡中注入抗原-异源性抗体复合物来生产的卵黄抗体(实施例)的情况下，胆固醇吸收率降低。并且，确认到与依折麦布(Ezetimibe)类似地减少，所述依折麦布(Ezetimibe)为以往的用于通过阻碍胆固醇的吸收而治疗肥胖的肥胖治疗剂。这些结果显示，在根据本发明的制备方法制备卵黄抗体的情况下，可以增加针对尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质的特异性卵黄抗体的生成增加，且所生成的IgY与尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质特异性结合，从而可抑制胆固醇的肠内吸收(参照实验例4及图4)。
通过上述本发明的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法制备的卵黄抗体可以用作用于预防或治疗肥胖的疫苗组合物，上述疫苗可以与药剂学上可接受的载体、佐剂或赋形剂一起使用。
作为用于本发明的疫苗的载体，可以使用包含水化的蛋白质、乳糖等一种以上稳定剂的生理学上均衡定制的培养基，可以使用0.01M至0.1M的磷酸缓冲液或0.8％的生理盐水。作为药学上可接受的载体，还可以使用溶液或非溶液、悬浮液、乳液等形态。作为非溶液溶剂的例，可以使用如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油以及如油酸乙酯等注射用有机酯。作为溶液性载体，可以使用如水、醇类溶液、乳液或生理盐水及缓冲培养液等悬浮液。
作为用于本发明的疫苗的赋形剂及稀释剂，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、十六烷醇、硬脂醇、液状石蜡、硬脂酸山梨糖醇酐酯、聚山梨酯60、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及矿物油。
本发明的疫苗可通过口服、直肠、局部、静脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻侧内、吸入、眼球内或皮内路径以常规方式进行给药。非口服给药是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、经皮及动脉内注射及注入的方式。
本发明的疫苗的非口服给药中，优选地，在优选纯度条件下通过对药剂学上可接受的载体，即，在所使用的浓度和给药量中对受体无毒性且可与其他制剂成分化合的物质进行混合来配制成单位给药量的剂型。
并且，本发明的疫苗的剂型可以使用为任何剂型，所制备的剂型可用作口服用剂型、注射用剂型、涂覆用剂型。上述剂型可配制成片剂、胶囊剂、软质胶囊剂、输液剂、颗粒剂、丸剂或注射用形态(溶液、悬浮液或乳浊液)，最优选地，配制成注射用形态。
发明的效果
如上所述，本发明的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，通过将抗原-异源性抗体复合物注入于产蛋鸡中而可以大量地制备并生产卵黄抗体，由此制备的卵黄抗体对尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NPC1L1)的重组蛋白质的特异性及结合性高，因此，阻断尼曼-匹克C1型类似蛋白1蛋白质的作用，从而抑制肠内胆固醇的吸收，最终可预防或治疗肥胖。
附图说明
图1为示出根据实验例1的抗体滴度测定结果的图。
图2及图3为示出确认根据实验例2的卵黄抗体的结果的图(图2，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)(12％的凝胶染色剂(gel staining))；图3，蛋白质印迹法(Western-blot)；1，天然鸡IgY蛋白(Natural-IgY protein)(cat#.ab119138)；2，尼曼-匹克C1型类似蛋白1(NPC1L1)-卵黄免疫球蛋白-IgY；3，尼曼-匹克C1型类似蛋白1-卵黄免疫球蛋白+单克隆抗体复合IgY(NPC1L1+mAB complex-IgY))。
图4为示出根据实验例4的胆固醇吸收率测定结果的图(‘ISA’是指佐剂(adjuvant)的种类，ISA是指使用ISA70佐剂(adjuvant)来制备的抗-NPC1N1、抗NPC1N1+mAb处理组)。
图5为示出根据实验例5的体重下降率的测定结果的图。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，因此，不应解释为本发明的范围限定于这些实施例。
将在下列表1中由序列1表示的尼曼-匹克C1型类似蛋白1基因插入蛋白质表达载体后，利用大肠杆菌生产抗原重组蛋白质。
具体地，在装有50μl/ml的卡那霉素(kanamycin)的3ml的LB液体培养基中接种具有尼曼-匹克C1型类似蛋白1基因的一个大肠杆菌BL21(DE3)菌落(E.coli BL21(DE3)colony)并在37℃的温度下振荡培养16小时。在含有50μl/ml的卡那霉素(kanamycin)的1.5L的LB液体培养基中接种15ml的细菌培养液并在37℃的温度下以120rpm振荡培养。若成为对数生长期状态(O.D600nm 0.5～0.6)，则添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)以使最终浓度达到1.0mM，并在37℃的温度下以120rpm追加培养16～18小时。在4℃、6000rpm的条件下离心分离10分钟来回收菌体，利用蛋白质提取缓冲溶液(50mM的NaH2PO4，300mM的NaCl，10％的丙三醇(glycerol)，0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，pH8.0)对菌体进行悬浮后，利用0.1㎎/ml的溶菌酶(Lysozyme)处理并在冰(ice)上进行反应1小时。将反应完的菌体在40W的条件下以打开3秒、关闭7秒的循环的方式反复进行超声波处理30分钟来破碎菌体。分别添加MgCl2和脱氧核糖核酸酶(DNase)并在室温下反应30分钟以使最终浓度达到10mM和20μg/ml。在15000rpm的条件下离心分离30分钟来去除上层液，利用8M的尿素缓冲液(urea buffer)(8M的尿素(urea)，50Mm的NaH2PO4，300mM的NaCl)化开剩余的球团(pellet)。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)分析所获得的最终重组蛋白质溶液。最后，利用1×PBS进行透析。利用BCA蛋白浓度检测法(BCA assay)对通过透析后获得的蛋白质进行定量。
表1
制备例2：小鼠抗体的制备
通过使在上述制备例1中生产的抗原失活来抑制毒性后，进行冷藏保管后使用。使用完全佐剂(complete adjuvant)制备了小鼠抗体制备用疫苗。制备每个抗原的疫苗而根据常规的小鼠抗体制备方法制备了抗体。在生产完后回收的血清(Serum)中利用蛋白A柱(protein-A column)来纯化小鼠抗体。
制备例3：抗原-异源性抗体复合物的制备
为了结合在上述制备例1中生产的抗原与在制备例2中生产的小鼠抗体，进行了如下的试验。在失活的混合疫苗中混合100μg的针对每个抗原生成的小鼠抗体，以在4℃的温度下过夜(Over night)的方式诱导抗原抗体结合。将结合完的样品离心分离并回收后，作为产蛋鸡接种用样品来利用。
制备例4：产蛋鸡接种用疫苗的制备
为了制备混合疫苗，将在制备例1中准备的每个抗原及单克隆抗体复合物(mAbcomplex)与佐剂(adjuvant)以3:7左右的比例混合后，利用均质机(Homogenizer)制备灭活疫苗后，通过无菌检测和失活确认试验来准备用于生产特异性卵黄抗体的混合疫苗。
实施例1：产蛋鸡接种用疫苗的接种
通过向25周龄的海兰褐鸡(Hyine-brown)类产蛋鸡中接种所制备的疫苗来完成产蛋鸡接种。在胸肌中接种1ml，以3周为间隔接种3次。接种组如下列表2所示。并且，疫苗的组成如表3所示。
表2
表3
| 组 | 疫苗组成 | 比例 |
| 对照组 | － | |
| 比较例 | 尼曼-匹克C1型类似蛋白1 | 1 |
| 实施例 | NPCLN1+单克隆抗体复合物<sup>1)</sup> | 1:1 |
1)：单克隆抗体复合物＝(NPC1L1+小鼠抗-NPC1L1-IgG)(mAb complex＝(NPC1L1+mouse anti-NPC1L1-IgG))
实验例1：确认是否形成抗体
1)ELISA包被抗原的制备
在8000rpm的条件下离心分离在制备例1中所生产的抗原50分钟。离心分离后丢弃上层液，利用HEPES缓冲液使球团(pellet)再悬浮(suspension)后经过超声波破碎(sonication)进行溶解(Lysis)来获得上层液，并将获得的上清液在8000rpm、4℃的条件下进行离心来获得上层液。向所获得的上层液中添加1％的N-月桂酰肌氨酸(N-Laurolysarcosine)(SIGMA，L-9150)以使最终浓度达到0.01％后，在室温下处理10分钟。经过处理后，在15000rpm、4℃的条件下实行离心50分钟来去除N-月桂酰肌氨酸(SIGMA，L-9150)，再次利用50ml的HEPES缓冲液再次进行悬浮而在15000rpm、4℃的条件下离心分离50分钟来回收OMP。利用BCA法对蛋白质进行定量后，包被所回收的抗原以使浓度达到200ng/ml而使用于抗体滴度测定。
2)利用ELISA的抗体滴度测定
利用间接ELISA方法(Indirect ELISA method)测定了卵黄中的特异性卵黄抗体的滴度。首先，将抗原稀释于包被缓冲液(coating buffer)中并按照每个孔(well)为100μl包被(Coating)于96孔的聚苯乙烯板(96well polystyrene plate)且在4℃的温度下过夜(over night)(或者，在37℃的温度下放置1小时)。利用PBS-T(磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer saline)，0.05％的吐温20(Tween 20)，pH 7.4)洗涤后利用含有BSA的PBS缓冲液在37℃的温度下封闭(blocking)1小时，并以如上述的方法进行洗涤。分别以2倍(2×)稀释阴性对照物、阳性对照组及样品并向每个孔(Well)中放入100μl，在37℃的温度下静置1小时。经过1小时后，洗涤3次，将适当量的第二抗体(anti-chicken：Sigma，U.S.A)稀释于PBS中并向每个孔(Well)中分株100μl后，在37℃的温度下进行反应1小时。之后，洗涤3次，向每个孔(Well)中分株100μl的底物(substrate)(OPD，sigma)后，在室温下进行反应约10分钟，分株50μl的终止液(Stop solution)来终止反应，在450nm的波长条件下利用酶联免疫检测仪(ELISA reader)测定每个孔(well)的吸光度，并用ELISA值(value)表示。在所测定的结果中将阴性的值乘以2后代入所处理的卵黄的测定值而在下列表4及图1中表示了分析数据(Data)的滴度。
表4
其结果，如上述表4所示，在将异源性抗体与抗原结合并将其与额外的抗原一起接种于产蛋鸡中的实施例中，在第一次至第三次的接种中抗体的滴度在整体上相比于比较例非常高。
实验例2：卵黄抗体的确认
为了从所接种的卵黄中利用硫酸铵(Ammonium sulfate)分离抗体后确认分离纯度，进行了试验。
具体地，通过回收在按每个组(对照组、比较例及实施例)生产的卵黄中显示最高抗体滴度的经过2～3周的鸡蛋来从卵黄中分离IgY。分离卵黄与卵白而仅收集卵黄后，在所回收的卵黄中用净化水(D.W)稀释并搅拌30分钟。对与净化水一起搅拌的样品反复进行冷冻和解冻来分离脂质，且回收水溶性蛋白质样品。向所回收的样品中添加硫酸铵(Anmoniumsulfate)后，在4℃下冷藏保管以使卵黄抗体沉淀。回收在冷藏过程中沉淀18小时的样品，在4℃、6000rpm的条件下进行离心分离来回收后，利用PBS对于向回收的抗体样品中用PBS进行再悬浮的样品进行透析来获得最终样品。利用BCA蛋白质定量试剂盒(kit)对所获得的样品进行定量后，在12％的SDS-PAGE凝胶中确认分离纯度，并将其结果表示在图2、图3中。
其结果，如图2中可以确认，试验结果显示，分离结果与市售的经纯化的卵黄抗体并没有多大差异，而且，通过蛋白质印迹(Western-blot)试验确认的结果都是抗体蛋白，因此，认为抗体的纯分离进行得非常好。
实验例3：根据产蛋鸡接种的抗体含量测量
利用高效液相色谱(HPLC)进行卵黄抗体定量试验。使用艾博抗(abcam)公司的普通鸡IgY(normal chicken IgY)作为用于定量的IgY标准物质(Abcam Cat No ad119138)。选取作为标准溶液的普通IgY(normal IgY)并在12000rpm的条件下进行离心分离而使用上层液。利用蒸馏水将离心分离的标准溶液稀释为5种浓度来制作标准曲线。将标准溶液稀释为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml的浓度来使用。将卵黄液稀释为0.2mg/ml的浓度后利用振荡机解冻5分钟。在3000rpm的条件下离心分离上述溶液5分钟选取上层液，并利用0.45μm的注射器式过滤器过滤上层液，之后利用HPLC对所过滤的上层液进行测量。将标准溶液按照浓度(1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL)在高效液相色谱中进行测量，从而绘制根据标准溶液的浓度的线性曲线图而求出绘制的线性曲线图的线性公式，将在高效液相色谱中测定的试验溶液的值导入线性公式来进行计算，并将其结果表示在表5中。
表5
其结果，如上述表5中可以确认，相比于疫苗未接种组(对照组)，疫苗接种组的卵黄抗体的含量增加，相比于比较例，实施例的卵黄内抗体含量增加。
实验例4：胆固醇的吸收能力测定
利用Hep G2细胞实行了根据本发明的实施例制备的卵黄抗体的胆固醇的吸收能力试验。
具体地，利用在24孔板中添加有10％的FBS(Difco公司，美国)的培养基以2×105/ml的密度培养Hep G2细胞18小时后，按各个浓度(5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)处理抗NPC1L1IgY，作为阳性对照组，将公知为胆固醇吸收阻碍剂的伊折麦布(Ezetimibe)以10μg/ml来进行处理，由此进行了比较。
在37℃的温度下经过1小时后回收样品，添加新的培养液进行洗涤。添加附着有放射线同位素的[3H]-胆固醇并处理3小时。利用添加有0.1％的无脂肪酸(fatty acid-free)BAS的PBS洗涤细胞，利用HBSS(Difco公司，美国)收集细胞后，利用添加有1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma公司，美国)的HBSS进行细胞溶解(cell lysis)，利用LS6500闪烁计数器(Scintillation Counter)测量辐射剂量，从而将IgY未处理组作为对照组来进行比较，其结果表示在图4中。
其结果，如图4所示，相比于没有进行任何处理的对照组，在作为阳性对照组使用的10μg/ml的EZM浓度中呈现出显著(p＞0.05)降低的结果。并且，包含NPC1N1抗原的疫苗(比较例)和包含NPC1N1抗原及NPC1N1抗原-异源性抗体复合物的疫苗(实施例)也从25μg/ml的浓度呈现出显著降低胆固醇吸收的结果。
实验例5：动物试验
进行了用于确认与作为肠内胆固醇运输蛋白质的NPC1L1(Niemann-Pick C1Like1)结合的抗-NPC1L1 IgY(比较例)和抗NPC1N1+mAb IgY(实施例)的功效的动物试验。
1)试验动物
将从KOATECH株式会社(KOATECH株式会社，韩国(Korea))购买的5周龄C57BL/6雌性小鼠用作试验动物，购买动物后经过检疫和7天的驯化期间后，在进行试验的一天前，按每组分配10只，使所有试验组之间的平均体重匹配成相同，以此方式进行了分配。在聚碳酸酯笼(polycarbonate cage，宽26cm、长42cm、高18cm)中饲养试验动物，使动物们自由摄取灭菌的净化水和试验动物用饲料(韩国普瑞纳公司)来进行饲养，使除了正常组之外的其余的所有组自由摄取从韩国LAB ANIMAL株式会社购买的引起动脉粥样化饮食(Atherogenicdiet，D12336，Research diets有限公司，美国)，以使在试验期间摄取高浓的胆固醇。根据韩国春川生物产业振兴院的试验动物伦理委员会的方针对试验动物进行了试验。
2)给药试验组及试验物质
使所有试验组之间的平均体重匹配成相同之后，分了试验组。将试验组共分为5组，大致分为没有进行任何处理的正常组(普通)和高胆固醇饲料给药组(对照组)，且分为对于高胆固醇饲料的对照组(IgY对照组)及根据给药IgY的IgY对照组(抗幽门螺杆菌IgY)和抗-NPC1L1 IgY(比较例)、NPC1L1抗原-异源性抗体复合物(实施例)给药组。IgY对照组中向每kg的动物体重给药抗幽门螺杆菌(Anti-Helicobacter pylori)IgY250mg，正常组及对照组中给药PBS。
3)测量体重
根据个体识别法并利用动物用耳钳对试验动物的耳朵进行个体识别标记，将开始试验当时的体重视为100％来测量体重的增加率。每次在相同的时间测量体重，试验期间中一周一次地测量体重。
4)统计处理
利用GraphPad 4.0prism程序对试验结果的显著性验证进行单因素方差分析(OneWay ANOVA-Test)，对给药高胆固醇饮食的对照组表示显著性。
5)试验结果
如图5所示，给药高胆固醇饮食的结果，试验第三周开始呈现出体重增加率急剧上升的趋势，然后，第六周之后，呈现出由缓慢的曲线表示的体重增加率。当将开始试验时的体重视为100％时，作为摄取胆固醇饮食的组的对照组(对照组)呈现出46％的体重增加率，与此相比，给药抗-NPC1L1-IgY(比较例)的组中呈现出33％的体重增加率，在给药NPC1L1抗原-异源性抗体复合物(实施例)的组中呈现出31％的体重增加率，从而显著减少了通过摄取饮食的体重增加率。并且，为了了解因给药IgY而产生的影响，在给药抗幽门螺杆菌IgY的组(IgY对照物)中并未出现因给药IgY而产生的抑制体重增加的效果。因此判断为，通过NPC1L1+mAb IgY(实施例)有效地作用于作为肠内胆固醇运输蛋白质的尼曼-匹克C1型类似蛋白1中而使所增加的体重显著下降。
Claims (8)
1.一种用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其中，包括：
第一步骤，利用尼曼-匹克C1型类似蛋白1的重组蛋白质来制备抗原；
第二步骤，将所述第一步骤的抗原接种于与鸡属于异种动物的小鼠或兔中而制备异源性抗体；
第三步骤，通过结合所述第一步骤的抗原与所述第二步骤的异源性抗体而制备抗原-异源性抗体复合物；
第四步骤，将由第一步骤的抗原及第三步骤的复合物混合而成的混合物接种于产蛋鸡中；以及
第五步骤，从所述第四步骤的产蛋鸡的卵中分离针对尼曼-匹克C1型类似蛋白1的重组蛋白质的卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述第一步骤中的尼曼-匹克C1型类似蛋白1的重组蛋白质是向宿主细胞中导入包含由序列1表示的尼曼-匹克C1型类似蛋白1基因的重组表达载体后通过表达尼曼-匹克C1型类似蛋白1的蛋白质而纯化的重组蛋白质。
3.根据权利要求2所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、假单胞菌及荧光假单胞菌。
4.根据权利要求1所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在所述第四步骤中，抗原及复合物的混合比例为3:0.5～1:0.1。
5.根据权利要求1所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在所述第四步骤中，混合物还包含佐剂。
6.根据权利要求1所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在所述第四步骤中，混合物还包含佐剂。
7.根据权利要求1所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在所述第四步骤中，以0.1ml至3ml接种2次至5次。
8.根据权利要求1所述的用于通过抑制胆固醇吸收来预防或治疗肥胖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述卵黄抗体的制备方法使卵黄抗体的生产收率增加。
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