WO2022244845A1 - 脂質異常関連疾患治療薬 - Google Patents

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WO2022244845A1
WO2022244845A1 PCT/JP2022/020850 JP2022020850W WO2022244845A1 WO 2022244845 A1 WO2022244845 A1 WO 2022244845A1 JP 2022020850 W JP2022020850 W JP 2022020850W WO 2022244845 A1 WO2022244845 A1 WO 2022244845A1
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peptide
vaccine composition
amino acid
seq
acid sequence
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雄一 尾池
潤 森永
大天 深水
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国立大学法人熊本大学
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic drug for dyslipidemia-related diseases, and to a therapeutic drug for dyslipidemia-related diseases using a peptide that promotes antibody production against angiopoietin-like factor 3.
  • the present invention relates to peptide vaccines and peptide vaccine compositions against dyslipidemia-associated diseases.
  • Cardiovascular diseases such as ischemic heart disease and stroke are among the leading causes of death in recent years in the world, and dyslipidemia is an extremely important condition that promotes the onset and progression of these diseases.
  • small dense LDL cholesterol sd-LDL-C
  • LDL-C low-density lipoprotein cholesterol
  • TG triglycerides
  • sd-LDL-C small dense LDL cholesterol
  • ezetimibe NPC1L1 protein inhibitor
  • PCSK-9 inhibitor evolocumab
  • treatment-resistant patients such as those with familial hypercholesterolemia (HoFH)
  • the therapeutic effect is not sufficient and the risk of developing CVD is still high.
  • angiopoietin-like factor 3 (ANGPTL3) is attracting attention as a new therapeutic target.
  • ANGPTL3 is known to play a role in angiogenesis, but it has also been reported to have a lipid control effect via a lipoprotein lipase (LPL) inhibitory effect. It has been reported that ANGPTL3 gene mutation in humans does not show clear pathogenicity, lowers both LDL-C and TG, and suppresses the risk of developing CVD (Non-Patent Document 1). Also, ANGPTL3 and angiopoietin-like factor 4 (ANGPTL4) bind to LPL and exhibit an inhibitory effect, and a functional domain related thereto has been identified and reported (Non-Patent Document 2).
  • angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) has attracted attention as a new therapeutic target for dyslipidemia. is being developed, and in HoFH patients, an additional therapeutic effect to the current treatment has been reported (Non-Patent Document 3).
  • Treatment of dyslipidemia requires long-term use of drugs, and these treatment strategies are expensive, so these treatments raise concerns about increased medical costs and drug adherence. Therefore, development of further therapeutic agents is desired.
  • the purpose of the present invention is to provide a new therapeutic drug for dyslipidemia that targets angiopoietin-like factor 3.
  • the present inventors found that by using a peptide of a specific sequence of angiopoietin-like factor 3 (ANGPTL3) as an immunogen or active ingredient of a vaccine composition, LDL leading to CVD onset risk suppression in mammals administered with the vaccine composition. -The present invention was completed by finding that both C and TG are lowered.
  • the present invention includes the following.
  • a vaccine composition comprising, as an active ingredient, a peptide having a partial sequence of angiopoietin-like factor 3 (ANGPTL3), wherein the peptide is the following peptide: (1) a peptide consisting of 7 to 15 (preferably 7 to 13) amino acids containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (EPKSRFA), and (2) one or two amino acids in the peptide of (1) above a peptide consisting of a deleted/substituted or added amino acid sequence;
  • a vaccine composition which is at least one peptide selected from the group consisting of: [2]
  • the peptide is a peptide consisting of 10 to 15 (preferably 10 to 13) amino acids containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (EPKSRFAMLD), or a peptide in which 1 or 2 amino acids are deleted.
  • the vaccine composition according to [1] above which is a peptide consisting of a substituted or added amino acid sequence.
  • the peptide is a peptide consisting of 13 to 15 amino acids containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (EPKSRFAMLDDVK), or an amino acid sequence in which 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or added in the peptide
  • the vaccine composition according to [1] above which is a peptide consisting of [4] Any one of [1] to [3] above, which, when administered to a mammal, has the ability to reduce both low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and triglyceride (TG) levels in the mammal.
  • [5] The vaccine composition according to any one of [1] to [4] above, which contains two or more of the peptides.
  • [6] The vaccine composition of any one of [1] to [5] above, wherein the peptide is bound or fused to a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is a carrier protein selected from the group consisting of keyhole limpet hemocyanin (KLH), ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), AJP001 peptide, and OSK-1 peptide.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • OVA ovalbumin
  • BSA bovine serum albumin
  • AJP001 peptide AJP001 peptide
  • OSK-1 OSK-1 peptide
  • the dyslipidemia-related diseases include coronary heart disease (CAD), stroke, stroke, arteriosclerosis (e.g., atherosclerosis, Moenckeberg arteriosclerosis), thrombosis, peripheral artery Symptomatic vascular disease, including disease (e.g., peripheral arterial occlusive disease), non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), acute pancreatitis, retinal lipidemia, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, diabetic nephropathy , tendon xanthomas, and exanthematous xanthomas.
  • CAD coronary heart disease
  • arteriosclerosis e.g., atherosclerosis, Moenckeberg arteriosclerosis
  • thrombosis e.g., peripheral artery vascular disease
  • peripheral arterial occlusive disease e.g., non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), acute pancreatitis, retinal lipidemia, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, diabetic nephropathy , tendon
  • LDL-C low-density lipoprotein cholesterol
  • TG triglyceride
  • the present invention provides vaccine compositions containing peptides capable of reducing blood lipid levels in mammals.
  • FIG. Figure 2 shows the amino acid sequence of human ANGPTL3.
  • the underlines and numbers in the figure indicate the positions of the respective peptide sequences corresponding to the three peptide candidates (epitope candidates: E1 to E3) in mouse ANGPTL-3 used in Example 1.
  • FIG. Figure 2 shows the amino acid sequence of mouse ANGPTL3.
  • the underlines and numbers in the figure indicate the positions of the peptide sequences of the three peptide candidates (epitope candidates: E1 to E3) used in Example 1.
  • the position of each peptide sequence used in Example 1 in ANGPTL3 is schematically shown.
  • the dosing schedule for each peptide vaccine composition is shown.
  • KLH vaccine indicates no peptide control (adjuvant (KLH) only).
  • Panel A is the half-maximal antibody titer for each peptide vaccine assessed using the ELISA method. n. s. no significant difference. ⁇ indicates P ⁇ 0.01 vs control.
  • FIG. B shows the result of confirming the induction of anti-ANGPTL3 antibody production by Western blotting. TG, LDL-C and sd-LDL-C levels in serum are shown. n. s. no significant difference. * indicates P ⁇ 0.05 vs control, ⁇ indicates P ⁇ 0.01 vs control. This is the result of confirming the amount of fat accumulated in the liver. n. s. no significant difference. * indicates P ⁇ 0.05 vs control, ⁇ indicates P ⁇ 0.01 vs control.
  • 1 is a graph quantifying the degree of arteriosclerosis in aortas isolated from mice. ⁇ indicates P ⁇ 0.01 vs control. The E3 peptide vaccine was administered to wild-type mice, and the half-maximal antibody titer and serum TG level were measured. n. s. no significant difference.
  • FIG. 2 shows the dosing schedule for E3 and E5 peptide vaccines.
  • Half-maximal antibody titers for each peptide vaccine evaluated using the ELISA method. n. s. no significant difference.
  • the amounts of TG, LDL-C and sd-LDL-C in the serum of immunized mice administered with each peptide vaccine are shown. n. s. no significant difference. It is the result of evaluating the T cell induction activity (proliferation of spleen cells) by E5 peptide. Veh is the vehicle.
  • FIG. 4 shows the dosing schedule of E3 peptide vaccine compositions in spontaneously obese and diabetic mice.
  • Urinary albumin levels (A) and fasting blood glucose levels (B) 18 weeks after the first vaccination are shown. * indicates p ⁇ 0.05, n.p. vs. control. s. indicates no significant difference.
  • Food consumption (A) and body weight (B) at 18 weeks post-vaccination are shown.
  • C shows the weight of livers harvested from mice. * indicates p ⁇ 0.05, n.p. vs. control. s. indicates no significant difference.
  • blood lipids refer to low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), triglycerides (TG), small dense LDL-Cholesterol (sd-LDL-C), or very low density lipoprotein cholesterol (VLDL-C ), or any combination of two, three or four thereof.
  • LDL-C low density lipoprotein cholesterol
  • TG triglycerides
  • sd-LDL-C small dense LDL-Cholesterol
  • VLDL-C very low density lipoprotein cholesterol
  • amino acids When referring to amino acids herein, the one-letter codes A (alanine), R (arginine), N (asparagine), D (aspartic acid), C (cysteine), Q (glutamine), E ( glutamic acid), G (glycine), H (histidine), I (isoleucine), L (leucine), K (lysine), M (methionine), F (phenylalanine), P (proline), S (serine), T ( threonine), W (tryptophan), Y (tyrosine), and V (valine).
  • vaccine or “vaccine composition” are used interchangeably, and mean a composition containing an immunogen that induces an antigen-specific immune response when administered to a mammal.
  • the vaccine compositions of the invention contain peptides as immunogens.
  • the vaccine of the present invention is not limited to those administered prophylactically, and may be administered therapeutically after the onset of disease.
  • Angiopoietin-like factor 3 (ANGPTL3) is a secretory protein that is mainly expressed in the liver, and is so called because of its similar genetic structure to angiopoietin.
  • Human angiopoietin-like factor 3 (Human ANGPTL3) and mouse angiopoietin-like factor 3 (Human ANGPTL3) are registered in UniProtKB as Q9Y5C1 (ANGL3_HUMAN) and Q9R182 (ANGL3_MOUSE), respectively.
  • the amino acid sequence of human ANGPTL-3 is shown in SEQ ID NO:1, and the amino acid sequence of mouse ANGPTL-3 is shown in SEQ ID NO:2.
  • the vaccine composition of the present invention contains, as an immunogen (active ingredient), a peptide having the same sequence as a part of the specific region of angiopoietin-like factor 3 (ANGPTL3).
  • the peptide (hereinafter sometimes referred to as the peptide of the present invention) that is an immunogen (active ingredient) contained in the vaccine composition of the present invention has at least 7 consecutive amino acids selected from the 32nd to 44th amino acid sequences of ANGPTL3. or amino acid sequences in which 1 or 2 amino acids have been deleted, substituted, or added to the sequence.
  • the 32nd to 44th amino acid sequence of ANGPTL3 is EPKSRFAMLDDVK (SEQ ID NO: 5) and is common to humans and mice.
  • the peptide of the present invention has a sequence consisting of at least 5 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (EPKSRFA), preferably 7 to 7 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 15 (preferably 7-13), more preferably 10-15 (preferably 10-13), more preferably comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 It is represented by a sequence consisting of 13 to 15 (preferably 13) amino acid residues.
  • Peptides contained in the vaccine composition of the present invention more specifically include any of the following peptides (1) to (3).
  • a peptide consisting of 13 to 15 (preferably 13) amino acids containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (EPKSRFAMLDDVK) or an amino acid in which 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or added in the peptide A peptide consisting of a sequence.
  • the peptide of the present invention is represented by EPKSRFA (SEQ ID NO: 3). In another preferred embodiment of the invention, the peptide of the invention is designated EPKSRFAMLD (SEQ ID NO: 4). In another preferred embodiment of the invention, the peptide of the invention is represented by EPKSRFAMLDDVK (SEQ ID NO: 5).
  • the peptide of the present invention is also a deletion/substitution of 1 or 2 amino acids in the 7-15 amino acid sequence containing any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3-5. or an added amino acid sequence, preferably an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted/substituted or added at a position different from the amino acid sequence (EPKSRFA) shown in SEQ ID NO: 3.
  • substitutions can be conservative or non-conservative amino acid substitutions.
  • a "conservative amino acid substitution” is one in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity); In general, conservative amino acid substitutions do not substantially alter functional properties (eg, binding activity or binding properties) of the peptide.
  • Examples of groups of amino acids with side chains with similar chemical properties are: 1) aliphatic side chains: glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine; 2) aliphatic-hydroxyl side chains: serine and threonine; 3) 4) aromatic side chains: phenylalanine, tyrosine and tryptophan; 5) basic side chains: lysine, arginine and histidine; 6) acidic side chains: aspartate and glutamate; ) Sulfur-containing side chains: cysteine and methionine.
  • Conservative amino acid substitutions refer to substitutions between amino acids within the same class, and non-conservative amino acid substitutions refer to exchanging members of one of these classes for members of another class.
  • Preferred conservative amino acid substitutions are among: valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, and glutamate-aspartate.
  • the vaccine composition of the present invention may contain at least two or more different peptides as described above.
  • the types of peptides to be combined are not particularly limited, and two or more types of peptides arbitrarily selected from the peptides of the present invention described above can be used in combination.
  • the selection and combination of peptides can be appropriately carried out using as an index the suppression of blood lipid levels and/or the preventive or therapeutic effect of the target disease, which is the objective of the present invention.
  • the peptide of the present invention can be produced by known genetic engineering techniques, chemical synthesis methods, and the like. Although not limited to this, the peptides of the present invention can be produced according to chemical synthesis methods, for example, known peptide synthesis methods. Methods for synthesizing peptides include, for example, a solid-phase synthesis method, a liquid-phase synthesis method, and the like. The peptide of the present invention can be isolated and purified by using a combination of techniques such as chromatography, crystallization/precipitation, filtration, and recrystallization.
  • the peptides of the present invention are preferably used in the form of peptides consisting of the given sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5, but shorter or longer sequences can also be used.
  • the peptides of the present invention preferably contain a linker attached to the C and/or N terminus.
  • the linker preferably is or contains a cysteine residue. Addition of a linker, preferably a cysteine residue, to the N- and/or C-terminus of the peptide may, for example, allow conjugation to a carrier and enhance the immunogenicity of the peptide.
  • the peptide of the present invention can be used as an immunogen as it is, it is desirable to immunize it as a complex with a polymer compound with a molecular weight of 10,000 or more. Therefore, when the polypeptide of the present invention is used as an immunogen, it may be conjugated with a macromolecular compound (eg, carrier protein, etc.) by a method known per se.
  • a macromolecular compound eg, carrier protein, etc.
  • the peptides described above eg, polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 3-5, can be synthesized according to the methods described above and conjugated with an immunogen-modulating carrier protein.
  • Immunogen-modulating carrier protein can be used without particular limitation as long as it can confer or enhance immunogenicity by binding to the above-described peptide.
  • Immunogen-modulating proteins include, but are not limited to, bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin (RSA), ovalbumin (OVA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), thyroglobulin (TG). , immunoglobulins, dendrimers (MAP), peptide carriers (e.g., AJP001 peptide (AJP001, a novel helper T-cell epitope, induces a humoral immune response with activation of innate immunity when included in a peptide vaccine, https://onlinelibrary.
  • BSA bovine serum albumin
  • RSA rabbit serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • TG thyroglobulin
  • MAP immunoglobulins
  • peptide carriers e.g., AJP001 peptide (
  • the conjugate can then be used as a preferred immunogen.
  • a complex with KLH is preferably used as the complex.
  • two or more kinds of carriers may be used. Binding of the peptide of the present invention to a carrier can be performed by appropriately referring to known methods.
  • a cysteine residue or a linker containing a cysteine residue is bound to the C and/or N terminus of the peptide of the present invention, while a maleimide group is introduced into the carrier. By activating and reacting them, the carrier-bound peptide of the present invention can be obtained.
  • the peptide of the present invention is formulated with an adjuvant to enhance immunogenicity.
  • the adjuvant substance is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable and compatible with the peptide of the present invention, and adjuvants used in the field of vaccines can be used without limitation.
  • adjuvants include sodium hydroxide, aluminum hydroxide (alm), calcium phosphate, aluminum phosphate, alum, Pepes, carboxyvinyl polymer, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, N-acetyl-muramyl-L-threonyl.
  • thr-MDP N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine
  • nor-MDP N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2 -(1′-2′-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine
  • MTP-PE N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2 -(1′-2′-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine
  • Quill A® lysolecithin, saponin derivatives, saponin-aluminum hydroxide or Quil-A Combinations such as aluminum hydroxide, Pluronic polyols, Montanide ISA-50 (Seppic, Paris, France),
  • IL-2 IL-2, IL-12, GM-CSF
  • lipid A LPS, MF59, neutral liposomes, microparticles, and the like.
  • the vaccine composition of the present invention can be formulated according to methods known and used in the art.
  • the vaccine composition of the present invention contains, in addition to the peptide, carrier and adjuvant of the present invention, any pharmaceutically acceptable ingredients such as additive adjuvants, stabilizers, preservatives, buffers, diluents and the like.
  • can include Stabilizers include, for example, SPGA, carbohydrates (eg, sorbitol, mannitol, starch, sucrose, dextrin, glutamate, glucose, etc.), proteins (eg, dried whey, albumin, casein, etc.), or degradation products thereof. be done.
  • Stabilizers are preferably used when a dry vaccine formulation is produced by freeze-drying.
  • Preservatives include, for example, thimerosal, merthiolate and gentamicin.
  • Buffers include, for example, alkali metal phosphates.
  • Diluents include, but are not limited to, water, aqueous buffers (eg, buffered saline), alcohols, and polyols (eg, glycerol).
  • injectable solvent those commonly used for injections can be used without particular limitation.
  • injectable solvents may contain alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as Polysorbate 80TM and HCO-50;
  • the vaccine composition of the present invention can be formulated into any form of formulation by general pharmaceutical techniques.
  • it can be formulated in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc.
  • injections, suppositories, external skin preparations e.g., ointments, patches
  • agent etc.
  • the vaccine composition of the present invention can be administered to a subject by any route.
  • the vaccine composition of the present invention can be administered intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intranasally, orally, sublingually, subcutaneously, and the like.
  • Vaccine compositions of the invention preferably comprise, in addition to the peptides of the invention, an aluminum salt-based adjuvant such as KLH and alum, preferably formulated for intradermal, subcutaneous, or intramuscular administration, which routes administered via
  • the vaccine composition of the present invention when administered to a mammal, has the effect of reducing blood lipid levels in the mammal.
  • the blood lipids low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), triglycerides (TG), small dense LDL-Cholesterol (sd-LDL-C), or very low-density lipoprotein at least one of cholesterol (VLDL-C) is reduced, preferably LDL-C and TG, more preferably LDL-C, TG and sd-LDL-C, or LDL-C, TG and VLDL-C .
  • the vaccine compositions of the present invention contain antibodies capable of specifically binding to ANGPTL3, particularly specific to the PLP binding region of ANGPTL3, when administered to a mammal. can induce the formation of antibodies that can specifically bind.
  • the interaction of the antibody with ANGPTL3 reduces the inhibitory activity of LPL by ANGPTL3 in vivo and increases blood lipids (TG, LDL-C, sd-LDL-C, or VLDL-C). preferably TG and LDL-C, more preferably LDL-C, TG and sd-LDL-C, or three of LDL-C, TG and VLDL-C).
  • TG and LDL-C preferably TG and LDL-C, more preferably LDL-C, TG and sd-LDL-C, or three of LDL-C, TG and VLDL-C.
  • a dyslipidemia-related disease as used herein means a disease associated with dyslipidemia.
  • Heterogeneity is a condition in which blood lipids such as low-density cholesterol and triglycerides are higher than normal. Specifically, one definition defines a serum total cholesterol level of 220 mg/dl or higher or a serum triglyceride level of 150 mg/dl or higher.
  • Dyslipidemia causes various diseases caused by elevated blood lipid levels.
  • dyslipidemia-related diseases include coronary heart disease (CAD), stroke, cerebral apoplexy, arteriosclerosis (e.g., atherosclerosis and Moenckeberg arteriosclerosis), thrombosis, and peripheral arterial disease.
  • CAD coronary heart disease
  • stroke cerebral apoplexy
  • arteriosclerosis e.g., atherosclerosis and Moenckeberg arteriosclerosis
  • thrombosis e.g., atherosclerosis and Moenckeberg arteriosclerosis
  • peripheral arterial disease CAD
  • symptomatic vascular disease e.g., peripheral arterial occlusive disease
  • NASH non-alcoholic fatty liver disease
  • acute pancreatitis retinal lipidemia, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, diabetic nephropathy, tendons Xanthomas, exanthema xanthomas, but not limited to.
  • Subjects to whom the vaccine composition of the present invention is administered are mammals that develop dyslipidemia, more specifically, subjects whose blood levels of low-density cholesterol and triglycerides consistently exceed reference values. be.
  • the vaccine composition of the present invention can also be administered to a subject who has developed dyslipidemia but has not yet developed a dyslipidemia-related disease, in order to prevent the development of a dyslipidemia-related disease.
  • the vaccine composition of the present invention can be both prophylactic and therapeutic.
  • Examples of mammals to which the vaccine composition of the present invention is administered include humans, monkeys, cows, horses, goats, dogs, cats, rabbits, rats, mice, and rabbits. Humans are preferred.
  • the dose of the vaccine composition of the present invention is 1 ⁇ g to 5000 mg, preferably 5 ⁇ g to 1000 mg, more preferably 0.1 to 100 mg, still more preferably 0.5 to 100 mg, in terms of the amount of peptide contained in the composition. / immunizing amount to the subject individual.
  • the peptide of the present invention is administered to the subject individual in an amount of 0.1 ng to 100 mg/kg, preferably 1 ng to 10 mg/kg, more preferably 5 ng to 1000 ng/kg, even more preferably 10 ng to 300 ⁇ g/kg body weight. be able to.
  • the amount of peptide to prepare a single-dose formulation is appropriately determined according to the type of peptide, age, body weight, condition and sex of the subject, administration method, degree of immune response in the subject, and other conditions. .
  • the amount of the peptide of the invention that can be mixed with the carrier material to produce a single dose formulation will likewise vary depending on the factors mentioned above.
  • Vaccine dosing regimens can be adjusted to provide the optimal immune response and therapeutic efficacy. For example, various divided doses may be administered daily, the total dose administered may be arbitrarily divided according to the therapeutic regimen, eg, proportionally reduced as indicated by therapeutic exigencies. Also, the dose of the vaccine may be varied accordingly depending on the circumstances, preferably to provide the optimal prophylactic dose-response. For example, the vaccine of the present invention can be administered to a subject at intervals of any period of time, e.g. can do.
  • the vaccine of the present invention is administered 1-10 times, preferably 1-7 times, more preferably 1-5 times, more preferably 3 times or less.
  • This administration (number of immunizations) can provide basal immunity.
  • basic immunization is followed by vaccination, with a time interval of 1 month to 10 years, preferably 1 month to 5 years or less, more preferably 2 months to 2 months. Selected between annual or less.
  • a typical vaccination schedule may include a first dose (post-basal immunization), a dose 4-8 weeks later, and then a total of 3-4 doses over a period of 6 months to 1 year. can. Also, vaccination can then be repeated every 2-10 years. Repeated doses of vaccine are preferably administered to maximize prophylactic and therapeutic effects.
  • the vaccine of the present invention can also be used in combination with other agents for reducing blood low-density cholesterol and/or triglyceride levels in mammals (preferably humans).
  • Other agents include, but are not limited to, statins, hibrate, nicotinic acid, cholesterol uptake inhibitors (eg, ezetimibe), ApoA1 Milano, delipidated HDL, plant sterols, PCSK9 inhibitors, and the like.
  • the dose and administration schedule of the vaccine and other agents of the present invention are appropriately determined according to the age, body weight, condition and sex of the subject, administration method, and other conditions.
  • Example 1 Selection of candidate peptide sequences (epitopes) From the sequence of mouse ANGPTL3 described in SEQ ID NO: 2, the following three peptide candidates were selected based on information such as the molecular structure of ANGPTL3 and the hydrophilicity of amino acids. (epitope candidates 1-3) were determined.
  • FIG. 1 shows the full sequence of human ANGPTL-3 and the location of the peptide sequences corresponding to the above candidate epitopes in mouse.
  • FIG. 3 schematically shows the position of each peptide sequence.
  • Synthesis of a peptide having the above amino acid sequence was requested to Peptide Institute Inc., Osaka, and a synthetic peptide having a carrier protein (Keyhole limpet hemocyanin: KLH) bound to the N-terminus was obtained.
  • Synthetic peptides were conjugated to KLH using N-(6-Maleimidocaproyloxy) succinimide and purified using reverse-phase high-performance liquid chromatography (>98 percent purity).
  • Example 2 Preparation of Peptide Vaccine Composition 8 mg of a compound in which each peptide consisting of E1, E2 or E3 sequences and a carrier protein were bound was dissolved in 4 ml of physiological saline. To further enhance immunogenicity, complete/incomplete Freund's adjuvant (Cat#011-09541, Cat#011-09551, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was then added to saline immediately before using the peptide vaccine. The mixture was mixed with water in the same volume to emulsify to prepare a peptide vaccine composition. Complete Freund's adjuvant was used for the first inoculation, and incomplete Freund's adjuvant was used for the second and subsequent inoculations.
  • complete/incomplete Freund's adjuvant Cat#011-09541, Cat#011-09551, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Example 3 Administration of vaccine composition [B6. Cg-Lepob/J (ob/ob)] (purchased from CLEA Japan) was administered intradermally 100 ⁇ g each for a total of 3 times at 2-week intervals. Taken. Serum was prepared from the blood.
  • Anti-peptide antibodies in serum were measured as follows to confirm the antibody production-inducing activity of each peptide.
  • Each candidate peptide was bound to bovine serum albumin (BSA), which is a carrier protein, and evaluated using the Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) method and the Western blot method by requesting Peptide Research Institute.
  • BSA bovine serum albumin
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • 50 ⁇ l of a carbonate buffer solution containing 5 mg/mL of BSA-ANGPTL3 candidate peptide conjugates (E1, E2, E3) was dispensed to each well on a microplate (Nunc MaxiSorp; Thermo Fisher Scientific). The plate was left overnight in a refrigerator at 4°C to coat the surface of the plate.
  • Nonfasting blood TG and fasting blood NEFA were measured using a LabAssay kit (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the manufacturer's manual.
  • Fasting serum TG, non-fasting serum TG, serum LDL-C and sd-LDL-C were measured by Skylight Biotech Inc. and evaluated by gel filtration HPLC (Miyo Okazaki et al. J Oleo Sci. 2016;65(4):265-82.). The results are shown in FIG. Fasting serum TG did not show significant differences (not shown).
  • E3 peptide reduced nonfasting TG in mouse blood by 52% (Fig. 6A), LDL-C by 41% (Fig. 6B), and small-dense LDL-C (sd-LDL-C) by 49%. (Fig. 6C). This indicated that the dyslipidemia was ameliorated by immunization with the E3 peptide.
  • Liver lipids were extracted with a Lipid Extraction Kit (Cell Biolabs), and the extracted lipids were diluted with 100 ⁇ l of methanol/chloroform mixture.
  • TG was quantified using the Lipid Quantification Kit (Fluorometric) (Cell Biolabs, Inc.) according to the manufacturer's protocol. The measured TG values were corrected for the weight of the liver used for extraction (Fig. 7A).
  • a portion of the collected liver was fixed in 10% neutral buffered formalin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 24 hours, embedded in paraffin, and cut into 4 ⁇ m sections. rice field.
  • RNA indicating the transcription level of each gene in the collected liver was extracted using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol. DNase-treated RNA was reverse transcribed using Prime Script RT reagent Kit (Takara Bio Inc). Quantitative real-time PCR was performed using SYBER Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc).
  • Relative transcript abundance was corrected for mouse 18S rRNA levels (Figs. 7E and 7F). The results are shown in Figures 7A-F. A 47% reduction in hepatic fat accumulation (TG), liver histological NAS, liver injury markers (ALT), and inflammatory markers (IL-6, TNF ⁇ ) were also confirmed to be improved. In addition, as shown in FIG. 7B, in the KLH group, lipid accumulates in the liver and fatty liver (liver tissue appears white) is confirmed, but it is confirmed that it is reduced in the E3 group. .
  • T cell activity after administration of peptide (E3) was assessed as follows. Immunized mice were sacrificed (killed) at the end of the experimental period, spleen cells (10 6 cells/well) were cultured in RPMI1640 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), candidate peptides, KLH and T cells were isolated. Stimulating phytohemagglutinin (PHA) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) was added at a concentration of 10 ⁇ g/ml. After incubating for 48 hours at 37°C and 5% CO 2 , 10 ⁇ l of Cell Counting Kit-8 solution (Dojindo) was added to each well and incubated for 4 hours under the same culture conditions.
  • PHA phytohemagglutinin
  • Splenocyte proliferation was assessed at a wavelength of 450 nm using a reader (Fig. 8A).
  • concentrations of interferon (IFN)- ⁇ , interleukin (IL)-2, IL-4 and IL-10 in the supernatant were measured using ELISA kits (R&D systems) according to the manufacturer's manual (Fig. 8B, C, D and E). The results are shown in Figures 8A-E. No significant induction of cytotoxic immunity by the E3 vaccine was observed.
  • Example 4 Confirmation of therapeutic effect of vaccine composition Using a familial hypercholesterolemia mouse model (Apoe shl mouse), the therapeutic effect of the peptide vaccine of the present invention on dyslipidemia and fatty liver was confirmed.
  • Severe familial hypercholesterolemia model mice were fed a 1% high-cholesterol diet [B6.
  • KOR/StmSlc-Apoe shl] male mice (8 weeks old) were administered 100 ⁇ g of the E3 peptide vaccine composition prepared in Example 2 three times every two weeks according to the schedule shown in FIG. Serum lipid analysis was performed. Blood was collected from the mice on day 42 after the first vaccination, and the half-maximal antibody titer was confirmed by ELISA in the same manner as in Example 3.
  • Severe familial hypercholesterolemia model mice were fed a 1% high-cholesterol diet [B6.
  • KOR/StmSlc-Apoe shl] male mice (8 weeks old) were administered 100 ⁇ g of the E3 peptide vaccine composition prepared in Example 2 three times every two weeks according to the schedule shown in FIG.
  • Arteriosclerosis analysis was performed. Immunized mice were sacrificed (killed) 22 weeks after the first vaccination and the aortas were isolated and Oil Red O stained for visual assessment of atherosclerotic areas.
  • FIG. 12 is a photograph of the stained state of the isolated aorta.
  • Example 5 Confirmation of sustained effect of vaccine (1)
  • the sustained effect of the vaccine composition of the present invention was confirmed as follows.
  • the E3 peptide vaccine composition prepared in Example 2 was administered to wild type mouse C57BL/6JJcl male mice (8 weeks old) at 0, 2 and 4 weeks.
  • blood was collected at 0, 6, 20 and 30 weeks, and the half-maximal antibody titer and serum TG level were measured in the same manner as in Example 3.
  • FIG. 14 shows the antibody titer and serum TG level measurement results. From these results, it was confirmed that vaccination with the peptide vaccine of the present invention significantly increased the antibody titer, and the increase was maintained 30 weeks after the first vaccination.
  • Example 6 Confirmation of sustained effect of vaccine
  • Wild-type mouse C57BL/6JJcl male mice (8 weeks old) were administered the E3 peptide vaccine composition prepared in Example 2 and KLH alone as a control at weeks 0, 2, and 4, and added at week 60.
  • administered Booster shot. Blood samples were collected at weeks 0, 6, 20, 30, 60 and 62, and half-maximal antibody titers and serum TG levels were determined in the same manner as in Example 3.
  • FIG. 15 shows the antibody titer and serum TG level measurement results. From these results, it was confirmed that vaccination with the peptide vaccine of the present invention significantly increased the antibody titer, and the increase was maintained 60 weeks after the first vaccination.
  • Example 7 Optimization of Peptide Vaccine Synthesis of a peptide having the following amino acid sequence was requested to Peptide Research Institute, and a synthetic peptide with KLH bound to the N-terminus was obtained.
  • E5 EPKSRFA (amino acids 32-38) (SEQ ID NO: 3)
  • E3 vaccine and E5 vaccine were administered to ob/ob mice according to the administration schedule shown in FIG. 16 in the same manner as in Example 3, and antibody titers (FIG. 17) and serum lipid profiles (FIG. 18) were confirmed.
  • FIG. 17 antibody production was observed even when the E5 vaccine having a length of 7 amino acids was administered, and the antibody titer was not significantly different from that of the E3 vaccine.
  • Serum lipid profiles were also not significantly different between the E3 and E5 vaccines, as shown in FIG. These results confirmed that the E5 peptide, which is 3 amino acids shorter than the E3 peptide and has a length of 7 amino acids, exhibits similar immune effects. Also, the E5 peptide is less likely to elicit cytotoxic immunity due to its shortened amino acid length. In addition, T cell activity (proliferation of spleen cells) after administration of E5 peptide was similarly evaluated. The results are shown in FIG. As shown in the figure, no significant induction of cytotoxic immunity by the E5 peptide was observed.
  • Example 8 Confirmation of effect using diabetic nephropathy model mouse A study was performed using spontaneous diabetic model mice.
  • Each of the peptide vaccine compositions prepared in Example 2 (E3 peptide vaccine and control KHL vaccine) was administered to mice exhibiting obesity, diabetes and diabetic nephropathy [BKS. Cg-m+/+Lepr db /Jcl (db/db)] (purchased from Clea Japan) was intradermally administered 100 ⁇ g three times every two weeks to 6-week-old mice.
  • FIG. 21 shows the antibody titer measurement results. From these results, it was confirmed that the peptide vaccine of the present invention has an antibody production-inducing activity even in spontaneous diabetes model mice.
  • Urinary albumin levels (Fig. 22A) and fasting blood glucose (Fig. 22B) were measured according to standard methods.
  • Vaccines of the present invention are useful for reducing low density lipoprotein cholesterol and triglyceride levels in the blood.

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Abstract

本発明の目的は、アンジオポエチン様因子３を標的とした、脂質異常症の新たな治療薬を提供することである。本発明により、アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）の一部の配列をもつペプチドを有効成分として含むワクチン組成物であって、該ペプチドは、ＥＰＫＳＲＦＡ（配列番号３）、ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ（配列番号４）、およびＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ（配列番号５）からなる群より選ばれる少なくとも一つのペプチドであるワクチン組成物が提供される。

Description

脂質異常関連疾患治療薬
　本発明は、脂質異常関連疾患の治療薬に関し、アンジオポエチン様因子３に対する抗体産生を促進するペプチドを用いた脂質異常関連疾患の治療薬に関する。本発明は、脂質異常関連疾患に対するペプチドワクチンおよびペプチドワクチン組成物に関する。
　虚血性心疾患や脳卒中等の心血管疾患（ＣＶＤ）は、世界における近年の死因上位を占めるが、脂質異常症はこれらの発症及び進展を促進する極めて重要な病態である。心血管疾患治療には、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）とトリグリセリド（ＴＧ）の両方の血中濃度を低下させることにより、動脈硬化病態の増悪因子であるsmall dense LDL cholesterol（ｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ）を減少させる必要がある。現在、脂質異常症の治療選択として、スタチン系薬剤（ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬）、エゼチミブ（ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質阻害薬）、またはエボロクマブ（ＰＣＳＫ－９阻害薬）などが併用されているが、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）など治療抵抗性の患者においては、治療効果が十分でなく、ＣＶＤ発症リスクは依然として高い。
　さらに、脂質異常症患者では動脈硬化を強く惹起するｓｄ－ＬＤＬ（small dense LDL）粒子の血中濃度が高いことが知られており、フィブリン酸誘導体やナイアシンによる血中のＴＧ濃度の低下に伴う血中ｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ値の低下がＣＶＤリスクを低減する上で重要とされる。すなわち、ＬＤＬ－ＣとＴＧを同時に低下させ、ＣＶＤ発症リスクを抑制するする治療法が求められている。
　このような中、新たな治療標的としてアンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）が着目されている。ＡＮＧＰＴＬ３の役割として血管新生作用が知られているが、そのほか、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）阻害作用を介した脂質制御作用が報告されている。ヒトにおけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子変異は、明らかな病原性を示さず、かつ、ＬＤＬ－ＣとＴＧをともに低下させ、ＣＶＤ発症リスクを抑制することが報告されている（非特許文献１）。また、ＡＮＧＰＴＬ３およびアンジオポエチン様因子４（ＡＮＧＰＴＬ４）はＬＰＬに結合し阻害作用を示すが、それに関連する機能ドメインが同定され報告されている（非特許文献２）。
　近年、脂質異常症の新たな治療標的としてアンジオポエチン様因子質３（Angiopoietin-like protein 3：ＡＮＧＰＴＬ３）が注目され、それに対する、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡを用いたＡＮＧＰＴＬ３抑制による薬剤開発が進められ、ＨｏＦＨ患者において、現行治療への上乗せ治療効果が報告されている（非特許文献３）。しかし、脂質異常症の治療は薬剤の長期使用が必要であること、また、これらの治療戦略は高額であることから、これらの治療は医療費に対する負担増加や薬剤アドヒアランスに関する懸念点が残る。そのため、更なる治療薬の開発が望まれている。
Frederick E Dewey ら、N Engl J Med. 2017 Jul 20;377(3):211-221 E-Chiang Lee ら、J Bio Chem. 2009；284(20):13735-13745 Raal FJら、N Engl J Med. 2020; 383(8):711-720
　本発明の目的は、アンジオポエチン様因子３を標的とした、脂質異常症の新たな治療薬を提供することである。
　本発明者らは、アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）の特定の配列のペプチドをワクチン組成物の免疫原または有効成分として用いることにより、ワクチン組成物を投与した哺乳類において、ＣＶＤ発症リスク抑制につながるＬＤＬ－ＣとＴＧをともに低下させることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下のものを含む。
［１］アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）の一部の配列をもつペプチドを有効成分として含むワクチン組成物であって、該ペプチドは、以下のペプチド：
（１）配列番号３（ＥＰＫＳＲＦＡ）に示されるアミノ酸配列を含む７～１５（好ましくは７～１３）のアミノ酸からなるペプチド、および
（２）上記（１）のペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
からなる群より選ばれる少なくとも一つのペプチドであるワクチン組成物。
［２］前記ペプチドは、配列番号４（ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ）に示されるアミノ酸配列を含む１０～１５（好ましくは１０～１３）のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［１］に記載のワクチン組成物。
［３］前記ペプチドは、配列番号５（ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ）に示されるアミノ酸配列を含む１３～１５のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［１］に記載のワクチン組成物。
［４］哺乳動物に投与すると、哺乳動物において、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）とトリグリセリド（ＴＧ）の両方のレベルを減少させる能力を有する、上記［１］～［３］のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
［５］２またはそれ以上の前記ペプチドを含む上記［１］～［４］のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
［６］前記ペプチドが、医薬的に許容しうる担体に結合または融合している上記［１］～［５］に記載のワクチン組成物。
［７］前記担体が、スカシ貝、Keyhole limpet hemocyanin（ＫＬＨ）、Ovalbumin（ＯＶＡ）、Bovine serum albumin（ＢＳＡ）、ＡＪＰ００１ペプチド、およびＯＳＫ－１ペプチドからなる群より選択されるキャリアタンパク質である、上記［６］に記載のワクチン組成物。
［８］脂質異常関連疾患の治療または予防のための上記［１］～［７］に記載にワクチン組成物。
［９］前記脂質異常関連疾患は、冠動脈性心疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、卒中性脳発作、動脈硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症、メンケベルグ型動脈硬化症）、、血栓症、末梢動脈疾患を含む症候性の血管疾患（例えば、末梢動脈閉鎖性疾患）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、急性膵炎、網膜脂血症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病性腎症、腱黄色腫、および発疹性黄色腫から選ばれる疾患である上記［８］に記載のワクチン組成物。
［１０］ＥＰＫＳＲＦＡ（配列番号３）、ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ（配列番号４）、およびＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ（配列番号５）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも一つのペプチド。
［１１］哺乳動物に投与すると、哺乳動物において、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）とトリグリセリド（ＴＧ）の両方のレベルを減少させる能力を有する、上記［１０］に記載のペプチド。
［１２］ペプチドと免疫原調整用キャリアタンパク質が結合した結合体であって、ペプチドは上記［１０］または［１１］に記載のペプチドであり、キャリアタンパク質は、スカシ貝ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin：ＫＬＨ）、Ovalbumin（ＯＶＡ）、Bovine serum albumin（ＢＳＡ）、ＡＪＰ００１ペプチド、およびＯＳＫ－１ペプチドからなる群より選択されるキャリアタンパク質である、結合体。
［１３］脂質異常関連疾患の治療または予防のために哺乳類に投与されることを特徴とする上記［１２］に記載の結合体。
　本発明により、哺乳動物において、血中脂質のレベルを減少させる能力を有するペプチドを含むワクチン組成物が提供される。
ヒトＡＮＧＰＴＬ３のアミノ酸配列を示す。図中の下線および番号は、実施例１で用いたマウスのＡＮＧＰＴＬ－３における３つのペプチド候補（エピトープ候補：Ｅ１～Ｅ３）に対応するそれぞれのペプチド配列の位置を示している。 マウスＡＮＧＰＴＬ３のアミノ酸配列を示す。図中の下線および番号は、実施例１で用いた３つのペプチド候補（エピトープ候補：Ｅ１～Ｅ３）のそれぞれのペプチド配列の位置を示している。 ＡＮＧＰＴＬ３における、実施例１で用いた各ペプチド配列の位置を模式的に示している。 各ペプチドワクチン組成物の投与スケジュールを示している。ＫＬＨ ｖａｃｃｉｎｅは、ペプチドを含まない対照（アジュバンド（ＫＬＨ）のみ）を示す。 図Ａは、ＥＬＩＳＡ法を用いて評価した各ペプチドワクチンの最大半量抗体価である。ｎ．ｓ．は有意差なし。†は、対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。図Ｂは、ウエスタンブロットにより、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体の産生誘導を確認した結果である。 血清中のＴＧ、ＬＤＬ－Ｃ、およびｓｄ－ＬＤＬ－Ｃの量を示している。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊は対照に対し、Ｐ＜０．０５、†は対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 肝臓の脂肪蓄積量を確認した結果である。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊は対照に対し、Ｐ＜０．０５、†は対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 脾臓細胞の増殖を評価した結果である。Ｅ３ワクチン接種によるＴ細胞活性を測定した結果を示す。Ｖｅｈはビヒクル、ｎ．ｓ．は有意差なし。＊は対照に対し、Ｐ＜０．０５、†は対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 家族性高コレステロール血症マウスモデルを用いたＥ３ペプチドワクチン組成物の投与スケジュールを示している。 ＥＬＩＳＡ法を用いて評価したペプチドワクチンの最大半量抗体価である。†は、対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 血清中のＴＧ（絶食時および非空腹時）、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＬＤＬ－Ｃおよびｓｄ－ＬＤＬ－Ｃの量を示している。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊は対照に対し、Ｐ＜０．０５、†は対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 マウスから単離した大動脈の写真である。左が対照群（ＫＬＨ投与群）であり、右がペプチドワクチン投与群（Ｅ３）である。 マウスから単離した大動脈の動脈硬化の程度を定量化したグラフである。†は、対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 野生型マウスにＥ３ペプチドワクチンを投与し、最大半量抗体価および血清ＴＧ量を測定した結果を示している。ｎ．ｓ．は有意差なし。＊は対照に対し、Ｐ＜０．０５、†は対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 野生型マウスにＥ３ペプチドワクチンを投与し、初回投与から６０週間後に、最大半量抗体価および血清ＴＧ量を測定した結果を示している。 Ｅ３およびＥ５ペプチドワクチンの投与スケジュールを示している。 ＥＬＩＳＡ法を用いて評価した各ペプチドワクチンの最大半量抗体価である。ｎ．ｓ．は有意差なし。 各ペプチドワクチンを投与した免疫マウスの血清中のＴＧ、ＬＤＬ－Ｃ、およびｓｄ－ＬＤＬ－Ｃの量を示している。ｎ．ｓ．は有意差なし。 Ｅ５ペプチドによるＴ細胞誘導活性（脾臓細胞の増殖）を評価した結果である。Ｖｅｈはビヒクルである。Ｖｅｈに対し、＊はｐ＜０．０５、†はｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意差なし、を示す。 肥満および糖尿病を自然発症するマウスへのＥ３ペプチドワクチン組成物の投与スケジュールを示している。 ＥＬＩＳＡ法を用いて評価したペプチドワクチンの最大半量抗体価である。†は、対照に対し、Ｐ＜０．０１を示す。 ワクチン初回接種から１８週目の尿中アルブミン量（Ａ）および空腹時の血糖値（Ｂ）を示す。対照に対し、＊はｐ＜０．０５を、ｎ．ｓ．は有意差なし、を示す。 ワクチン接種から１８週目の時点での摂餌量（Ａ）および体重（Ｂ）を示している。Ｃは、マウスから採取した肝臓の重量を示している。対照に対し、＊はｐ＜０．０５を、ｎ．ｓ．は有意差なし、を示す。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。また、本発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書中に引用されそして本明細書の一部を構成するものである。
　本明細書において、数値範囲を示す「Ａ～Ｂ」の記載は、端点であるＡおよびＢを含む数値範囲を意味する。また、「ＡないしＢ」についても同様である。
　本明細書において血中脂質とは、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ）、small dense LDL-Cholesterol（ｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ）、または超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）、あるいはそれらの２つ、３つまたは４つの組み合わせを意味する。
　本明細書中でアミノ酸を示す場合は、１文字表記である、Ａ（アラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｃ（システイン）、Ｑ（グルタミン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｇ（グリシン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｙ（チロシン）、Ｖ（バリン）で表す。
　本明細書において「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、互いに置換可能な用語として用いられ、哺乳類に投与することにより抗原特異的免疫反応を引き起こす免疫原を含む組成物を意味する。本発明のワクチン組成物は、免疫原としてペプチドを含む。本発明のワクチンは、予防的に投与されるものに限定されず、疾患が発症した後に治療的に投与されるものであってもよい。
　アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）は、主に肝臓に発現する分泌タンパク質であり、アンジオポエチンと遺伝子構造が類似しているためにそのように呼ばれる。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢに、ヒトアンジオポエチン様因子３（Ｈｕｍａｎ　ＡＮＧＰＴＬ３）とマウスアンジオポエチン様因子３（Ｈｕｍａｎ　ＡＮＧＰＴＬ３）は、それぞれ、Ｑ９Ｙ５Ｃ１（ＡＮＧＬ３＿ＨＵＭＡＮ）、Ｑ９Ｒ１８２（ＡＮＧＬ３＿ＭＯＵＳＥ）として登録されている。ヒトＡＮＧＰＴＬ－３のアミノ酸配列を配列番号１に、マウスＡＮＧＰＴＬ－３のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　本発明のワクチン組成物は、アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）の特定の領域の配列の一部と同じ配列をもつペプチドを免疫原（有効成分）として含む。本発明のワクチン組成物に含まれる免疫原（有効成分）であるペプチド（以下、本発明のペプチドという場合がある。）は、ＡＮＧＰＴＬ３の３２番目～４４番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも７の連続する配列または該配列において１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列を含む。ＡＮＧＰＴＬ３の３２番目～４４番目のアミノ酸配列は、ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ（配列番号５）であり、ヒトおよびマウスで共通である。
　本発明のペプチドは、配列番号３（ＥＰＫＳＲＦＡ）に示されるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも５つの連続するアミノ酸残基からなる配列を有し、好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む７～１５（好ましくは、７～１３）の、より好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む１０～１５（好ましくは、１０～１３）の、さらに好ましくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む１３～１５（好ましくは１３）のアミノ酸残基からなる配列で示される。
　本発明のワクチン組成物に含まれるペプチドは、より具体的には、以下の（１）～（３）の何れかのペプチドを挙げることができる。
（１）配列番号３（ＥＰＫＳＲＦＡ）に示されるアミノ酸配列を含む７～１５（好ましくは、７～１３）のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
（２）配列番号４（ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ）に示されるアミノ酸配列を含む１０～１５（好ましくは、１０～１３）のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
（３）配列番号５（ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ）に示されるアミノ酸配列を含む１３～１５（好ましくは１３）のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
　本発明の好ましい一つの態様において、本発明のペプチドは、ＥＰＫＳＲＦＡ（配列番号３）で示される。本発明の好ましい別の一つの態様において、本発明のペプチドは、、ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ（配列番号４）で示される。本発明の好ましい別の一つの態様において、本発明のペプチドは、ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ（配列番号５）で示される。
　本発明の別の一つの態様において、本発明のペプチドはまた、配列番号３～５に示されるいずれかのアミノ酸配列を含む７～１５のアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列で示され、好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＥＰＫＳＲＦＡ）とは異なる場所において１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列で示される。
　置換されるアミノ酸残基および置換のための位置は、ワクチンとしての本発明の効果を損なわない限り特に制限されないが、種々の要因に基づき実験的に選択される。置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されるものであり、一般に、保存的アミノ酸置換は、ペプチドの機能的特性（例えば、結合活性や結合特性）を実質的に変化させない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニンおよびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、並びに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニン、を含む。保存的アミノ酸置換は、同じクラス内でのアミノ酸間の置換を意味し、非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを意味する。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびグルタミン酸－アスパラギン酸間での置換である。
　本発明のワクチン組成物は、上記した少なくとも２つ以上の異なるペプチドを含んでもよい。組み合わせるベプチドの種類は特に限定されず、上記した本発明のペプチドから任意に選択される２つまたはそれ以上の種類のペプチドを組み合わせて用いることができる。ペプチドの選択および組み合わせは、本発明の目的である血中脂質レベルの抑制、および／または対象疾患の予防効果あるいは治療効果を指標として適宜行うことができる。
　本発明のペプチドは、公知の遺伝子工学的手法や化学合成法などによって作製できる。これに限定されないが、本発明のペプチドは、化学合成法、例えば、公知のペプチド合成方法に従って作製することができる。ペプチドの合成方法としては、例えば、固相合成法、液相合成法等があげられ、合成反応後は、ペプチド合成分野において通常用いられる精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、晶析・析出、ろ過、再結晶等の技術を組み合わせて用いることにより、本発明のペプチドを単離・精製できる。
　本発明のペプチドは、所定の配列である配列番号３、配列番号４、または配列番号５からなるペプチドの形態で用いられるのが好ましいが、より短いかまたはより長い配列を用いることもできる。たとえば、ＮまたはＣ末端（好ましくはＣ末端）から一つのアミノ酸を欠失させ、免疫原性ならびにＬＤＬおよびＴＧの減少に関して、事実上同等のワクチンを達成することが可能である。より大きな、例えば２つ以上のアミノ酸の欠失も可能である。また、本発明ペプチドの特性を有意に変化させることなく、ＮまたはＣ末端（好ましくはＣ末端）にアミノ酸残基を付加することも可能である。ＮまたはＣ末端におけるアミノ酸残基の付加は、付加部位への天然のアミノ酸残基のさらなる付加であるのが好ましい。
　本発明のペプチドは、好ましくはＣおよび／またはＮ末端に結合したリンカーを含む。リンカーは、好ましくはシステイン残基であるかまたはシステイン残基を含む。ペプチドのＮおよび／またはＣ末端にリンカー、好ましくはシステイン残基を付加すると、例えば担体との結合を可能とし、該ペプチドの免疫原性を増強させることができる。
　本発明のペプチドは、そのまま免疫原として用いることも可能であるが、分子量１万以上の高分子化合物との複合体として免疫することが望ましい。従って、本発明のポリペプチドは、免疫原として使用するとき、自体公知の方法により高分子化合物（例、キャリアタンパク質など）との複合体としてもよい。上記したペプチド、例えば、配列番号３～５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを上記記載の方法に従って合成し、免疫原調整キャリアタンパク質との複合体を形成させることができる。免疫原調整キャリアタンパク質は、上記したペプチドに結合することにより、免疫原性を付与または増強することができるものであれば特に制限なく使用することができ、公知の免疫原調整キャリアタンパク質を本発明において使用することができる。免疫原調整タンパク質は、これに限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin：ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン、デンドリマー（ＭＡＰ）、ペプチド担体（例えば、ＡＪＰ００１ペプチド（AJP001, a novel helper T-cell epitope, induces a humoral immune response with activation of innate immunity when included in a peptide vaccine、https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1096/fba.2019-00056 参照）、ＯＳＫ－１ペプチド（ＷＯ２０１６／０４７７６３参照））、破傷風トキソイド、Ｂ型肝炎コア抗原等のキャリアタンパク質を挙げることができる。当該複合体は、その後、好ましい免疫原として用いることができる。複合体としては、ＫＬＨとの複合体が好ましく用いられる。また、担体は、２種以上を用いてもよい。本発明のペプチドと担体の結合は、公知の方法を適宜参照して行うことができる。これに限定されないが、例えば、上記したように、本発明のペプチドのＣおよび／またはＮ末端にシステイン残基またはシステイン残基を含むリンカーを結合し、一方、担体にはマレイミド基を導入して活性化し、それらを反応させることにより、担体が結合した本発明のペプチドを得ることができる。
　本発明の好ましい態様においては、本発明のペプチドは、免疫原性を高めるためにさらにアジュバンドを加えて製剤化される。アジュバンド物質としては、医薬的に許容されかつ本発明のペプチドと相溶性であれば特に限定されないが、ワクチンの分野において用いられているアジュバンドを制限なく使用できる。アジュバンドとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム（アルム）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）、リゾレシチン、サポニン誘導体、サポニン－水酸化アルミニウムもしくはＱｕｉｌ－Ａ水酸化アルミニウムのような組み合わせ、プルロニックポリオール、モンタニドＩＳＡ－５０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂａｙｏｌ（登録商標）およびＭａｒｋｏｌ（登録商標）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ）、リピドＡ、ＬＰＳ、ＭＦ５９、中性リポソーム、ミクロ粒子等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のペプチドとアジュバンドの混合または結合は、公知の方法を適宜参照して行うことができる。
　本発明のワクチン組成物は、当該技術当分野において公知でかつ使用されている方法に従って、製剤化することができる。本発明のワクチン組成物は、本発明のペプチド、担体、およびアジュバンドの他に、薬学的に許容される任意の成分、例えば、添加補助剤、安定剤、防腐剤、緩衝剤、希釈剤等を含むことができる。安定化剤として、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（例：ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストリン、グルタミン酸塩若しくはグルコースなど）、タンパク質（例：乾燥乳清、アルブミン若しくはカゼインなど）またはそれらの分解産物が挙げられる。安定剤は、乾燥ワクチン製剤を凍結乾燥により製造する場合に好ましく用いられる。防腐剤としては、例えば、チメロサール、メルチオレートおよびゲンタマイシンが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、アルカリ金属リン酸塩が挙げられる。希釈剤としては、これらに限定するものではないが、水、水性バッファー（例えば、緩衝食塩水）、アルコール、およびポリオール（例えば、グリセロール）が挙げられる。
　本発明のワクチン組成物を注射用製剤として製剤化する場合、注射用溶剤として、注射剤に一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられるがこれらに限定されない。注射用溶剤は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
　本発明のワクチン組成物は、一般的な製薬手法により任意の形状の製剤に製剤化することができる。例えば、経口投与用に、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態に製剤化でき、また、被経口投与用に、注射剤、坐剤、皮膚外用剤（例えば、軟膏剤、貼付剤等）等の形態に製剤化できる。これらの製剤化のための方法は公知であり、本発明においてもそれらを用いることができる。
　本発明のワクチン組成物は、任意の経路により対象に投与できる。例えば、本発明のワクチン組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、鼻内、経口、舌下、皮下などに投与することができる。
　本発明のワクチン組成物は、好ましくは本発明のペプチドに加えてＫＬＨおよびアルムなどのアルミニウム塩系アジュバンドを含み、好ましくは皮内、皮下、または筋肉内投与用に製剤化され、それらの経路を介して投与される。
　本発明のワクチン組成物は、哺乳動物に投与されると、哺乳動物において血中脂質のレベルを減少させる効果をもたらす。本発明のワクチン組成物の投与により、血中脂質である低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ）、small dense LDL-Cholesterol（ｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ）、または超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）の少なくとも一つが、好ましくは、ＬＤＬ－ＣおよびＴＧが、より好ましくは、ＬＤＬ－Ｃ、ＴＧおよびｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ、またはＬＤＬ－Ｃ、ＴＧおよびＶＬＤＬ－Ｃが減少する。
　この理論に拘束される訳ではないが、本発明のワクチン組成物は、哺乳動物に投与されると、ＡＮＧＰＴＬ３と特異的に結合することができる抗体、特に、ＡＮＧＰＴＬ３のＰＬＰとの結合領域に特異的に結合することができる抗体の形成を誘導することができる。該抗体とＡＮＧＰＴＬ３の相互作用は、インビボで、ＡＮＧＰＴＬ３によるＬＰＬの阻害活性を減少させ、血中脂質（ＴＧ、ＬＤＬ－Ｃ、ｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ、またはＶＬＤＬ－Ｃ
の少なくとも一つ、好ましくはＴＧとＬＤＬ－Ｃ、より好ましくはＬＤＬ－Ｃ、ＴＧおよびｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ、またはＬＤＬ－Ｃ、ＴＧおよびＶＬＤＬ－Ｃの３つ）のレベルを減少させる効果をもたらす。その結果、低密度コレステロールやトリグリセリドの上昇に起因する脂質異常関連疾患の治療効果を発揮できる。
　本明細書における脂質異常関連疾患とは、脂質異常症に関連して生じる疾患を意味する。異質異常症とは、血中の低密度コレステロールやトリグリセリドなどの脂質が、基準よりも多い状態のことをいう。具体的には、一つの定義によると、血清総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ以上または血清トリグリセリド値が１５０ｍｇ／ｄｌ以上と定義されている。脂質異常症は、血中の脂質レベルの上昇に起因する様々な疾患を引き起こす。例えば、脂質異常関連疾患として、冠動脈性心疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、卒中性脳発作、動脈硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症やメンケベルグ型動脈硬化症）、、血栓症、末梢動脈疾患を含む症候性の血管疾患（例えば、末梢動脈閉鎖性疾患）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、急性膵炎、網膜脂血症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病性腎症、腱黄色腫、発疹性黄色腫、を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明のワクチン組成物を投与する対象は、脂質異常症を発症している哺乳類動物、より具体的には、血中の低密度コレステロールやトリグリセリドのレベルが一定に基準値を超えている対象である。本発明のワクチン組成物は、脂質異常症を発症しているが、脂質異常関連疾患をまだ発症していない対象に対し、脂質異常関連疾患の発症を予防するために投与することもでき、また、脂質異常関連疾患を既に発症している対象に対し、脂質異常関連疾患を治療するために投与することもできる。よって、本発明のワクチン組成物は、予防薬でもあり、また治療薬でもあり得る。
　本発明のワクチン組成物を投与する対象である哺乳動物は、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ウサギなどが挙げられる。好ましくは、ヒトである。
　本発明のワクチン組成物の投与量は、該組成物に含まれるペプチドの量にて、１μｇ～５０００ｍｇ、好ましくは５μｇ～１０００ｍｇ、より好ましくは０．１～１００ｍｇ、さらに好ましくは０．５～１００ｍｇ／免疫の量で対象個体に投与される。あるいは、本発明のペプチドは、０．１ｎｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｎｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５ｎｇ～１０００ｎｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１０ｎｇ～３００μｇ／ｋｇ体重の量で対象個体に投与することができる。
　単回用量の製剤を作製するためのペプチドの量は、ペプチドの種類、投与対象の年齢、体重、状態および性別、投与方法、対象における免疫反応の程度、その他の条件に応じて適宜決定される。単回用量の製剤を作製するために担体物質と混合することができる本発明のペプチドの量も同様に、上記要因に応じて適宜変化しうる。
　ワクチンの投薬計画は、最適な免疫反応および治療効果をもたらすように調節することができる。例えば、種々の分割用量を毎日投与する、投与される総容量を治療計画に従って任意に分割する、例えば、治療の緊急性に応じて比例的に減少させることもできる。また、ワクチンの用量は、状況に応じて適宜変更することもでき、好ましくは、最適予防用量反応をもたらすように変更することもできる。例えば、本発明のワクチンは、抗ＡＮＧＰＴＬ３の抗体レベルに応じて、任意の期間、例えば、数日、１、２あるいは３週間、または１、２あるいは数カ月間、または数年の間隔で対象に投与することができる。
　本発明の好ましい態様において、本発明のワクチンは、１～１０回、好ましくは１～７回、さらに好ましくは１～５回、より好ましくは３回以下で投与される。この投与（免疫回数）により、基礎免疫をもたらすことができる。特に好ましい態様においては、基礎免疫の後に続くワクチネーションを行うことであり、その時間間隔は、１ヶ月～１０年間、好ましくは１カ月間～５年間あるいはそれ以下、より好ましくは２カ月間～２年間またはそれ以下の間で選択される。典型的なワクチネーションスケジュールは、最初の投与後（基礎免疫付与後）、４～８週間後の投与、およびそれに続く６カ月～１年間の期間にわたる、計３～４回の投与をあげることができる。また、次いで、ワクチネーションを２～１０年間ごとに反復することもできる。ワクチンの反復投与は、予防的効果および治療的効果を最大にするようにして行うのが好ましい。
　本発明のワクチンは、哺乳動物（好ましくはヒト）において、血中の低密度コレステロールおよび／またはトリグリセリドのレベルを低減するための他の薬剤を組み合わせて用いることもできる。他の薬剤としては、例えば、スタチン、ヒブラート、ニコチン酸、コレステロール取り込み阻害剤（例えばエゼチミブ）、ＡｐｏＡ１ Ｍｉｌａｎｏ、脱脂ＨＤＬ、植物ステロール、ＰＣＳＫ９阻害剤等をあげることができるが、これらに限定されない。本発明のワクチンおよび他の薬剤の投与量および投与スケジュールは、投与対象の年齢、体重、状態、および性別、投与方法、その他の条件に応じて適宜決定される。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ペプチド配列（エピトープ）候補の選択
　配列番号２に記載のマウスのＡＮＧＰＴＬ３の配列から、ＡＮＧＰＴＬ３の分子構造およびアミノ酸の親水性などの情報をもとに、以下に示す３つのペプチド候補（エピトープ候補１～３）を決定した。
Ｅ１：ＳＲＶＤＰＤＬＳＳ（１７番目～２５番目）（配列番号６）
Ｅ２：ＫＹＮＫＰＲＴＫＳＲ（４１６番目～４２５番目）（配列番号７）
Ｅ３：ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ（３２番目～４１番目）（配列番号４）
　図２にマウスＡＮＧＰＴＬ－３の全配列、およびそれぞれの候補ペプチド配列の位置を示す。図１は、ヒトＡＮＧＰＴＬ－３の全配列、およびマウスにおける上記エピトープ候補に対応するペプチド配列の位置を示す。図３は各ペプチド配列の位置を模式的に示している。
　上記のアミノ酸配列のペプチドの合成をペプチド研究所（Peptide Institute Inc.、大阪）に依頼し、キャリアタンパク質（Keyhole limpet hemocyanin：ＫＬＨ）がＮ末端に結合した合成ペプチドを入手した。合成ペプチドは、N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimideを用いてＫＬＨに結合し、逆相高速液体クロマトグラフィー法を用いて精製した（純度９８パーセント以上）。
（実施例２）ペプチドワクチン組成物の調製
　Ｅ１、Ｅ２またはＥ３の配列からなるそれぞれのペプチドとキャリアタンパクが結合した化合物８ｍｇを、生理食塩水４ｍｌに融解した。
　次いで、さらに免疫原性を高めるために、完全／不完全フロイントアジュバンド（Ｃａｔ＃０１１－０９５４１、Ｃａｔ＃０１１－０９５５１、富士フイルム和光純薬株式会社）を、ペプチドワクチンを使用する直前に生理食塩水と同容量混合してエマルジョン化し、ペプチドワクチン組成物を調製した。初回接種時は完全フロイントアジュバンドを、接種２回目以降は不完全フロイントアジュバンドを用いた。
（実施例３）ワクチン組成物の投与
　図４に示す投与スケジュールにて、実施例２で調製したペプチドワクチン組成物のそれぞれを、肥満および脂質異常症を示すマウス［Ｂ６．Ｃｇ－Ｌｅｐｏｂ／Ｊ（ｏｂ／ｏｂ）］（日本クレアから購入）に対し、２週間おきに計３回１００μｇずつ皮内投与し、初回ワクチン接種から４２日目にマウスから血液、肝臓および脾臓を採取した。血液からは血清を調製した。
　血清中の抗ペプチド抗体を以下のようにして測定し、各ペプチドの抗体産生誘導活性を確認した。
　ペプチド研究所に依頼し、各候補ペプチドをキャリアタンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させ、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay （ＥＬＩＳＡ）法とウエスタンブロット法を用いて評価した。まずＥＬＩＳＡ法では、マイクロプレート（Nunc MaxiSorp; Thermo Fisher Scientific社）に５ ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ－ＡＮＧＰＴＬ３候補ペプチド結合体（Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３）を含む炭酸緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ分注し４℃の冷蔵室に一晩安置し、プレートの表面をコーティングした。５％のスキムミルクを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングした後、上記の調製した血清をブロッキングバッファーで１００～３２５，０００倍に希釈した溶液を添加した。４℃で一晩安置した後、プレートをHorseradish peroxidase（ＨＲＰ）で標識したマウスＩｇＧ特異的抗体（Cat# NA931, GE Healthcare社）と室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質３，３’－５，５’－テトラメチルベンジジン（Cat# T4444, Sigma-Aldrich社）で発色させ、１Ｎ 硫酸で発色反応を停止させた。その後、マイクロプレートリーダー（iMark, Bio-Rad, Hercules, California）を用いて４５０ｎｍで吸光度を検出した。最大半量抗体価は、各サンプルの希釈範囲の中で最も高い吸光度に合わせて決定した（図５Ａ）。
　次にウエスタンブロット法を行った。リコビナントマウスＡＮＧＰＴＬ３（R&D Systems）とＢＳＡ－候補ペプチド結合体（Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３）をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Merck Millipore）にブロッティングした。５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした後、膜をCan Get Signal Solution 1（東洋紡株式会社）で１，０００倍に希釈したそれぞれのペプチドで免疫したマウスから得られた血清、またはCan Get Signal Solution 1で１，０００倍に希釈した抗ＢＳＡ抗体（Abcam Cat# ab79827, RRID:AB_1603068; Abcam）とインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰで標識したマウスＩｇＧ特異的抗体（GE Healthcare社）でインキュベートした後、化学発光イメージングシステム（Ｌｉｌｂｅｒ社）を用いて化学発光シグナルを検出した（図５Ｂ）。
　結果を図５ＡおよびＢに示す。各ペプチドに対する特異的な抗体産生が誘導されたことが確認された。
　非絶食時の血中ＴＧおよび絶食時の血中ＮＥＦＡは，LabAssay kit（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いて、メーカーのマニュアルに従って測定した。絶食時の血清ＴＧ、非空腹時の血清ＴＧ、血清ＬＤＬ－Ｃまたはｓｄ－ＬＤＬ－Ｃなどの量はスカイライトバイオテック社に測定を依頼し、ゲルろ過ＨＰＬＣ法により評価した（岡崎三代ら. J Oleo Sci. 2016;65(4):265-82.）。結果を図６に示す。絶食時の血清ＴＧは有意な差は示さなかった（図には示さず）。Ｅ３ペプチドにおいてマウス血液中の非空腹時ＴＧが５２％低下（図６A）、ＬＤＬ－Ｃが４１％低下（図６B）、ｓｍａｌｌ－ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ－Ｃ（ｓｄ－ＬＤＬ－Ｃ）が４９％低下した（図６C）。これにより、Ｅ３ペプチドを免役することにより、脂質異常が改善することが示された。
　採取した肝臓を用いて、以下のようにして肝臓の脂肪蓄積量を確認した。
　肝臓の脂質は、Lipid Extraction Kit (Cell Biolabs社)で抽出し、抽出した脂質を１００μｌのメタノール／クロロホルム混合液で希釈した。ＴＧは、Lipid Quantification Kit（Fluorometric）（Cell Biolabs, Inc.）を用いて、メーカーのプロトコルに従って定量した。測定したＴＧ値は、抽出に使用した肝臓の重量で補正した(図７Ａ)。
　組織学的な評価のため、採取した肝臓の一部を１０％中性緩衝ホルマリン液（富士フイルム和光純薬株式会社）中で２４時間固定し、パラフィン中に埋包し、４μｍの切片に切り出した。切片ヘマトキシリン・エオジン染色を施し（図７Ｂ）、Nonalcoholic fatty liver disease activity score（ＮＡＳ）を用いて脂肪沈着や肝細胞の障害の程度を評価した（図７Ｃ）。血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルはＳＲＬ社に依頼して測定した（図７Ｄ）。
　採取した肝臓における各遺伝子の転写レベルを示すトータルＲＮＡは，ＴＲＩｚｏｌ試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて，メーカーのプロトコルに従って抽出した。ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡをPrime Script RT reagent Kit（Takara Bio Inc）を用いて逆転写した。SYBER Premix Ex Taq II（Takara Bio Inc）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。相対的な転写産物の量は，マウスの１８Ｓ ｒＲＮＡレベルで補正した（図７Ｅと図７Ｆ）。
　結果を図７Ａ～Ｆに示す。肝臓の脂肪蓄積量（ＴＧ）が４７％低下、肝組織学的ＮＡＳ、肝障害マーカー（ＡＬＴ）、および炎症マーカー（ＩＬ－６，ＴＮＦα）も改善したことが確認された。また、図７Ｂに示されるように、ＫＬＨ ｇｒｏｕｐでは肝臓に脂質が蓄積し脂肪肝（肝臓組織が白く抜けて見える）が確認されるが、Ｅ３ ｇｒｏｕｐではそれが減少していることが確認される。
　ペプチド（Ｅ３）の投与後のＴ細胞活性を以下のようにして評価した。
　免疫したマウスを実験期間の最後に犠牲にし（殺し）、脾臓細胞（１０６ 細胞／ウェル）をＲＰＭＩ１６４０培地（富士フイルム和光純薬株式会社）で培養し、候補ペプチド、ＫＬＨ、および、Ｔ細胞を刺激するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（富士フイルム和光純薬）を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8 溶液（同仁堂）を各ウェルに１０μｌずつ添加し、さらに同じ培養条件下で４時間インキュベートした、その後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長で脾臓細胞の増殖を評価した（図８Ａ）。また、上清中のインターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－４およびＩＬ－１０の濃度を、ＥＬＩＳＡキット（R&D systems）を用いて、製造元のマニュアルに従って測定した（図８Ｂ、Ｃ、ＤとＥ）。結果を図８Ａ～Ｅに示す。Ｅ３ワクチンによる細胞障害性免疫の有意な誘導を認めなかった。
（実施例４）ワクチン組成物の治療効果の確認
　家族性高コレステロール血症マウスモデル（Ａｐｏｅshlマウス）を用い、本発明のペプチドワクチンの脂質異常症および脂肪肝に対する治療効果を確認した。
　重症な家族性高コレステロール血症モデルマウスである、１％高コレステロール食負荷した［Ｂ６．ＫＯＲ／ＳｔｍＳｌｃ－Ａｐｏｅ ｓｈｌ］雄マウス（８週齢）に対し、図９に示すスケジュールにて、実施例２で調製したＥ３ペプチドワクチン組成物を、２週間おきに計３回１００μｇずつ投与し、血清脂質解析を行った。
　初回ワクチン接種から４２日目にマウスから血液を採取し、実施例３と同様にして、ＥＬＩＳＡ法により最大半量抗体価を確認した。結果を図１０に示す。また、実施例３と同様にして、絶食時のＴＧ、非空腹時のＴＧ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＬＤＬ－Ｃおよびｓｄ－ＬＤＬ－Ｃの量を測定した。結果を図１１に示す。Ｅ３ペプチドの投与群において、マウス血液中の非空腹時ＴＧ、ＶＬＤＬ－Ｃ、およびＬＤＬ－Ｃが顕著に低下していた。
　これらの結果より、家族性高コレステロール血症マウスモデルを用いた場合も同様に、Ｅ３ペプチドを免役することにより、ＫＬＨのみの対照群と比較して、各血中脂質濃度が減少し、脂質異常が改善することが示された。
　重症な家族性高コレステロール血症モデルマウスである、１％高コレステロール食負荷した［Ｂ６．ＫＯＲ／ＳｔｍＳｌｃ－Ａｐｏｅ ｓｈｌ］雄マウス（８週齢）に対し、図９に示すスケジュールにて、実施例２で調製したＥ３ペプチドワクチン組成物を、２週間おきに計３回１００μｇずつ投与し、動脈硬化解析を行った。
　初回ワクチン接種から２２週目に免疫したマウスを犠牲にし（殺し）、大動脈を単離し、動脈硬化領域を視覚的に評価するためにオイルレッドＯ染色を施した。図１２は、単離した大動脈の染色状態の写真である。ＫＬＨのみの対照群では動脈硬化が進行し、血管に脂質が蓄積していることが観察されるのに対し、Ｅ３ペプチドを免疫したマウスでは、動脈硬化が軽減していることが確認された。動脈硬化の程度を定量化したグラフを図１３に示す。ペプチドワクチン投与群（Ｅ３）では動脈硬化の進展が軽減しているのが確認された。
（実施例５）ワクチンの持続効果の確認（１）
　本発明のワクチン組成物の持続効果を以下のようにして確認した。
　野生型マウスＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ ｍａｌｅ ｍｉｃｅ（８週齢）に、実施例２で調製したＥ３ペプチドワクチン組成物を、０、２、４週目に投与した。また、０、６、２０、３０週目に採血し、実施例３と同様にして、最大半量抗体価および血清ＴＧ量を測定した。抗体価および血清ＴＧ量の測定結果を図１４に示す。この結果より、本発明のペプチドワクチンの接種により、抗体価は有意に上昇し、その上昇は、初回接種から３０週間後も維持されていることが確認された。
（実施例６）ワクチンの持続効果の確認（２）
　野生型マウスＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ ｍａｌｅ ｍｉｃｅ（８週齢）に、実施例２で調製したＥ３ペプチドワクチン組成物および対照としてＫＬＨのみを、０、２、４週目に投与し、さらに６０週目に追加投与（Ｂｏｏｓｔｅｒ ｓｈｏｔ）した。０、６、２０、３０、６０および６２週目に採血し、実施例３と同様にして、最大半量抗体価および血清ＴＧ量を測定した。抗体価および血清ＴＧ量の測定結果を図１５に示す。この結果より、本発明のペプチドワクチンの接種により、抗体価は有意に上昇し、その上昇は、初回接種から６０週間後も維持されていることが確認された。血中ＴＧ値の低下作用も維持される傾向が認められた（ｐ＝０．１１）。６０週目にワクチンの４回目接種を行うと、６２週目の時点ではＥ３ワクチン群で有意なＴＧ低下が確認された。以上より、最終接種から１年後のブースター接種により、ワクチン効果が増強されることが確認された。
（実施例７）ペプチドワクチンの最適化
　下記のアミノ酸配列のペプチドの合成をペプチド研究所に依頼し、ＫＬＨがＮ末端に結合した合成ペプチドを入手した。
　Ｅ５：ＥＰＫＳＲＦＡ（３２～３８番目のアミノ酸）（配列番号３）
　図１６に示す投与スケジュールにて、実施例３と同様にして、ｏｂ／ｏｂマウスにＥ３ワクチンおよびＥ５ワクチンを投与し、抗体価（図１７）および血清脂質プロファイル（図１８）を確認した。図１７に示すように、７アミン酸長のＥ５ワクチンの投与でも抗体産生を認め、Ｅ３ワクチンの抗体価と有意差はなかった。また、図１８に示すように、血清脂質プロファイルも、Ｅ３ワクチンとＥ５ワクチンとの間で有意差はなかった。これらの結果より、Ｅ３ペプチドに比べて３アミノ酸短い７アミノ酸長のＥ５ペプチドでも同様の免疫効果を示すことが確認された。また、Ｅ５ペプチドは、アミノ酸長を短縮していることから、細胞障害性免疫を惹起する可能性はより低い。
　また、Ｅ５ペプチドの投与後のＴ細胞活性（脾臓細胞の増殖）を同様にして評価した。結果を図１９に示す。図に示すように、Ｅ５ペプチドによる細胞障害性免疫の有意な誘導を認めなかった。
（実施例８）糖尿病腎症モデルマウスを用いた効果の確認
　自然発症する糖尿病モデルマウスを用いて、検討を行った。図２０に示す投与スケジュールにて、実施例２で調製したペプチドワクチン組成物のそれぞれ（Ｅ３ペプチドワクチンおよび対照のＫＨＬワクチン）を、肥満、糖尿病および糖尿病性腎症を示すマウス［ＢＫＳ．Ｃｇ－ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌ（ｄｂ／ｄｂ）］（日本クレアから購入）の６週齢に対し、２週間おきに計３回１００μｇずつ皮内投与した。初回ワクチン接種から１８週目（２４週齢）に、マウスから尿、血液、腎臓、肝臓を採取し、血液中の抗体価、尿中アルブミン量、空腹時血糖、各種臓器の重量の測定を行った。また、ワクチン接種後の体重変化を測定するとともに、摂餌量を記録した。
　実施例３と同様にして、血清中の最大半量抗体価を測定した。抗体価の測定結果を図２１に示す。この結果より、自然発症糖尿病モデルマウスにおいても、本発明のペプチドワクチンによる抗体産生誘導活性を確認した。尿中アルブミン量（図２２Ａ）および空腹時血糖（図２２Ｂ）を常法に従い測定した。図に示すように、初回接種から１８週目に尿中アルブミンの低下が確認された。また、糖尿病モデルにおいて、空腹時血糖はコントロール群とワクチン群で有意差は認めなかった。このことから、ワクチンによる尿中アルブミン低下作用は、糖代謝とは独立した別の機序が関与していることが示唆された。
　両群で摂餌量に変化はなかったが、ワクチン接種から１８週目の時点で、Ｅ３ワクチン投与群の体重低下が有意に認められた。さらに、臓器ごとの重量を比較したところ、肝臓重量がワクチン群で有意に低下していた。結果を図２３に示す。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本出願は、日本国で出願された特願２０２１－８４９７１（出願日：２０２１年５月１９日）および特願２０２１－１８３８７６（出願日：２０２１年１１月１１日）を基礎としており、それらの内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
　本発明により、脂質異常症に対する新たな治薬が提供された。本発明のワクチンは、血中の低密度リポタンパク質コレステロールやとトリグリセリドのレベルを低減するのに有用である。

Claims (13)

  1. 　アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）の一部の配列をもつペプチドを有効成分として含むワクチン組成物であって、該ペプチドは、以下のペプチド：
    （１）配列番号３（ＥＰＫＳＲＦＡ）に示されるアミノ酸配列を含む７～１５のアミノ酸からなるペプチド、および
    （２）上記（１）のペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
    からなる群より選ばれる少なくとも一つのペプチドであるワクチン組成物。
  2. 　前記ペプチドは、配列番号４（ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ）に示されるアミノ酸配列を含む１０～１５のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. 　前記ペプチドは、配列番号５（ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ）に示されるアミノ酸配列を含む１３～１５のアミノ酸からなるペプチド、または該ペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失・置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載のワクチン組成物。
  4. 　哺乳動物に投与すると、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）とトリグリセリド（ＴＧ）の両方のレベルを減少させる能力を有する、請求項１～３のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
  5. 　２またはそれ以上の前記ペプチドを含む請求項１～３のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
  6. 　前記ペプチドが、医薬的に許容しうる担体に結合または融合している請求項１～３に記載のワクチン組成物。
  7. 　前記担体が、スカシ貝、Keyhole limpet hemocyanin（ＫＬＨ）、Ovalbumin（ＯＶＡ）、Bovine serum albumin（ＢＳＡ）、ＡＪＰ００１ペプチド、およびＯＳＫ－１ペプチドからなる群より選択されるキャリアタンパク質である、請求項６に記載のワクチン組成物。
  8. 　脂質異常関連疾患の治療または予防のための請求項１～３に記載にワクチン組成物。
  9. 　前記脂質異常関連疾患は、冠動脈性心疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、卒中性脳発作、アテローム性動脈硬化症およびメンケベルグ型動脈硬化症を含む動脈硬化症、血栓症、末梢動脈疾患を含む症候性の血管疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、急性膵炎、網膜脂血症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病性腎症、腱黄色腫、および発疹性黄色腫から選ばれる疾患である請求項８に記載のワクチン組成物。
  10. 　ＥＰＫＳＲＦＡ（配列番号３）、ＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤ（配列番号４）、およびＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫ（配列番号５）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも一つのペプチド。
  11. 　哺乳動物に投与すると、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）とトリグリセリド（ＴＧ）の両方のレベルを減少させる能力を有する、請求項１０に記載のペプチド。
  12. 　請求項１０または１１に記載のペプチドと、スカシ貝ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin：ＫＬＨ）、Ovalbumin（ＯＶＡ）、Bovine serum albumin（ＢＳＡ）、ＡＪＰ００１ペプチド、およびＯＳＫ－１ペプチドからなる群より選択されるキャリアタンパク質とが結合した結合体。
  13. 　脂質異常関連疾患の治療または予防のために哺乳類に投与されることを特徴とする請求項１２に記載の結合体。
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